SIR MYCOPLASMA teszt ANTIBIOGRAM UROGENITALIS MYCOPLASMÁKHOZ

Átírás

1 SIR MYCOPLASMA teszt ANTIBIOGRAM UROGENITALIS MYCOPLASMÁKHOZ

2 1- KLINIKAI ALKALMAZÁS A SIR MYCOPLASMA urogenitális mycoplasmák - Ureaplasma spp (Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum) és Mycoplasma hominis (Mh) - antibiotikum érzékenységének vizsgálatára alkalmas teszt. Pillanatnyilag az Ureaplasma urealyticum és az Ureaplasma parvum megkülönböztetése igen nehéz feladat. A SIR MYCOPLASMA 8-féle, a fenti baktériumokra ható, és a genitális fertőzések kezelésében rendszeresen használt antibiotikumot tartalmazó mikrolemez. A rezisztens törzsek terjedése, és főként az elsőnek választandó ciklinekre és makrolidekre rezisztens törzseké (10, 11, 18) az antibiotikum rezisztencia vizsgálatát elengedhetetlenül szükségessé teszi, ha ki akarjuk küszöbölni az eredménytelen beavatkozásokat. A standard inokulum alkalmazása biztosítja e technika és a referencia módszer közötti jó egyezést (9). 2- ALAPELV A SIR MYCOPLASMA folyékony közeget alkalmazó, antibiotikum érzékenységet vizsgáló teszt, amelyben az antibiotikumok (doxycyclin, tetracyclin, azithromycin, josamycin, erythromycin, ofloxacin) két különböző koncentrációban, vagy egyetlen koncentrációban (clindamycin, pristinamycin) fordulnak elő. A teszt a metabolizmus gátlásán alapul. A mycoplasmák növekedését metabolikus aktivitásuk jelzi: az Ureaplasma spp a karbamidot hidrolizálja az U 9 bouillonban, az Mh pedig az arginint hidrolizálja az arginin bouillonban, s ez ammónia felszabadulásával jár, ami lúgossá teszi a közeget, s ettől a ph-indikátor (fenolvörös) sárgából pirosba csap át. Ha a mikroorganizmus érzékeny a vizsgált antibiotikumra, akkor az gátolja metabolizmusát és a közeg sárga marad (vagy narancssárga). Ha a mikroorganizmus rezisztens, akkor zavartalanul növekszik, és a közeg megpirosodik. 3- KISZERELÉS A SIR MYCOPLASMA az alábbiakat tartalmazza: 10 SIR mikrolemez (a 16 tesztlyuk kiosztása a címkén látható, melyen a minta azonosítója is feltüntethető). 10 öntapadó fólia. 1 használati utasítás Minden egyes mikrolemez külön alumínium tasakba van csomagolva, mely öntapadó fóliát és nedvszívó anyagot is tartalmaz. 4- TÁROLÁS +2-8 C között tárolva a SIR MYCOPLASMA a csomagoláson feltüntetett szavatossági ideig használható. 5- SZÜKSÉGES, DE NEM SZÁLLÍTOTT ANYAGOK U 9 bouillon: kódszám (10 ampulla fagyasztva szárított U 9 bouillon q.s.p. 2 ml) Arginin bouillon: kódszám (10 ampulla fagyasztva szárított arginin bouillon q.s.p. 2 ml) MYCOPLASMA DUO (20 teszt, kódszám 62740) Steril desztillált víz 2 ml-es, 200 μl-es, 100 μl-es és 20 μl-es pipetták 37 C-os inkubátor Gyűjtőtartály fertőző hulladékhoz 2

3 6- A VIZSGÁLAT KIVITELEZÉSE A) A SIR MIKROLEMEZ A SIR mikrolemez két sorban 8-8 antibiotikum tartalmú tesztlyukat tartalmazó lap. A különféle beszárított antibiotikumokat az inokulum bemérésével oldjuk fel. Ezzel a tesztlyukakban kapott koncentráció közel azonos lesz a kritikus koncentrációval, s így a vizsgált törzsekhez hozzárendelhető az érzékenységi profil: érzékeny (Sensitive), mérsékelten érzékeny (Intermediate) és Rezisztens az illető antibiotikumra nézve. Növekedési kontroll antibiotikum nélkül Doxycyclin (4 és 8 ) Tetracyclin (4 és 8 ) Azithromycin (2 és 4 ) Josamycin (2 és 8 ) Erythromycin (1 és 4 ) Clindamycin (2 ) Pristinamycin (2 ) Ofloxacin (1 és 4 ) B) AZ ANTIBIOTIKUMOK KIVÁLASZTÁSA A vizsgálathoz használt antibiotikumok kiválasztása az újszülöttkori és genitális mycoplasmafertőzések kezelésére javasolt terápiás előírások alapján történt (17). Kifejezetten a mycoplasmára vonatkozó kritikus koncentráció tekintetében nem állnak rendelkezésre adatok, ezért a SIR MYCOPLASMA tesztben választott kritikus koncentrációértékek tudományos közlemények során, valamint olyan orvostudományi társaságok ajánlásain alapulnak, mint pl. a CA- SFM (Antibiogram-Tanács, Francia Mikrobiológiai Társaság). Az azithromycin koncentrációjának megválasztása klinikai törzsek felhasználásával végzett vizsgálatokon alapul (19). Vizsgált ciklinek: tetraciklin és doxycyclin (4 és 8 ). A tetraciklinekre rezisztensnek leírt Mh és az Ureaplasma spp törzseket egyértelműen azóta mutatják ki, mióta közzétették, hogy minimális gátlási koncentrációjuk (MIC) legalább 8 mg/ml, ellentétben a korábban érzékenynek tekintett törzsek legfeljebb 2 mg/ml értékével (15, 18). Az antibiotikumok ezen osztályával szemben alacsony szintű rezisztencia tapasztalható, mely 48 órás inkubációs időt igényel (19). A ciklinekkel szembeni rezisztencia gyakorisága az egyes törzsek között országonként, és antibiotikumhasználattól függően változik (18). Vizsgált makrolidek: ertyhromycin (1 és 4 koncentrációkban), azithromycin (2 és 4 koncentrációkban), josamycin (2 és 8 koncentrációkban). A Mh törzsek természetes rezisztenciával rendelkeznek az erythromycinnel és az azithromycinnel szemben. A josamicin megtartotta hatásosságát. Ebből következően az ezen antibiotikumokkal kapott eredmények igazolhatják a korábban törzs azonosításának helyességét. A klinikai mintákból izolált Mh és Ureaplasma spp törzsek szerzett rezisztenciájának gyakorisága nem ismert, de feltehetően nagyon alacsony (18). Vizsgált lincosamide: clindamycine (2 mg/ml koncentrációban) Az Ureaplasma spp. törzsek természetes rezisztenciával rendelkeznek erre az antibiotikumra nézve (18). 3

4 Vizsgált streptogramin: pristinamycin (2 koncentrációban) A Mycoplasma törzsek kifejezetten érzékenyek erre az antibiotikumra nézve. Vizsgált fluorokinolon: ofloxacin (1 és 4 koncentrációknál) Ez a molekula hatásos a Mh és Ureaplasma spp esetében is. A rezisztencia gyakorisága nem ismert, de Ureaplasma spp esetében 1% alattinak becsülik (6, 18). C) AZ ANTIBIOGRAM ELKÉSZÍTÉSE Az antibiotikumérzékenységi vizsgálatot végezhetjük a MYCOPLASMA DUO (kódszám 62740) X tesztlyukának tartalmából kiindulva. A biológiai minták tárolási körülményeit (időtartam és hőmérséklet) illetően ld. az érvényben lévő ajánlásokat (13). 1) Szabványos inokulum készítése Az antibiogram leoltásához szükséges CCU/ml (CCU: színváltoztató egység) koncentrációjú inokulum készítéséhez a mintával beoltott táptalajon előtenyésztést kell végezni. Ez, a fentiekben ismertetett módon készített előtenyészet legfeljebb CCU/ml-re csíraszámra dúsítja fel a mycoplasmákat. Kalibrált inokulumot úgy kapunk, hogy ezt az előtenyészetet 1:100 arányban hígítjuk U 9 bouillonban vagy arginin bouillonban, az izolált speciestől függően. MYCOPLASMA DUO használatával Ha az antibiotikum érzékenységi vizsgálatot MYCOPLASMA DUO-val végezzük, akkor az X tesztlyuk tartalma felel meg az előtenyészetnek, Mh esetében órás, Ureaplasma spp esetében 24 órás inkubálás után. A tesztlyuk tartalmát felhígítjuk U 9 vagy arginin bouillonban, az alábbi előírás szerint, s így megkapjuk a standard inokulumot. 1. A Mycoplasma hominis-hoz Az X tesztlyuk tartalmából kiindulva (24 vagy 48 órás inkubálás után) készítsünk 1:100 hígítást arginin bouillonnal (20 μl az X lyukból 2 ml arginin bouillonba). 2. Az Ureaplasma spp-hoz 24 órás inkubálás után: készítsünk az X tesztlyuk tartalmából 1:100 hígítást U 9 bouillonnal (20 μl az X lyukból 2 ml U 9 bouillonba). 48 órás inkubálás után: ebben az esetben nem használhatjuk az X tesztlyuk tartalmát, mivel az Ureaplasma már autolízisen eshetett át. Készítsünk a +4 C-on tárolt transzport szuszpenziós közegből 1:10 hígítást bouillonnal (200 μl 2 ml U 9 bouillonhoz). 2) A standard inokulum bemérése Mérjünk be 100 μl standard inokulumot (az U 9 vagy arginin bouillonban készített előtenyészet 1:100 hígítása) a SIR mikrolemez mindegyik tesztlyukába. Fedjük le a lemezt öntapadó fóliával és inkubáljuk 48 órán át, 37 C-on. 4

5 5

6 D) Ureaplasma spp-t és Mh-t TARTALMAZÓ MINTÁK Ebben az esetben 2 SIR mikrolemezt oltsunk be: az egyiket az U 9 bouillonos hígítással készített standard inokulummal (az Ureaplasma spp törzs antibiogramjához), a másikat pedig az arginin bouillonos hígítással előállított standard inokulummal (a Mh törzs antibiogramjához). 7- AZ EREDMÉNYEK KIÉRTÉKELÉSE Az antibiogram azonnal kiértékelhető, amint a növekedési kontroll tesztlyukban a szín sárgáról pirosra vált át. A lemezt leolvassuk 24. óra után, majd a 48. óra letelte után ismét. A 48 órás leolvasás lehetővé teszi a ciklinekkel szemben mutatott kismértékű rezisztencia (19) kimutatását, és az eredmények megerősítését, ha a kiindulási inokulum alacsonynak bizonyul (10 3 CCU/ml), vagy ha a színváltozás 24 óra múltán még nem egyértelmű. 2 sárga tesztlyuk: 2 piros tesztlyuk: kis antibiotikum koncentrációjú lyukban: piros nagy antibiotikum koncentrációjú lyukban: sárga nincs növekedés: érzékeny törzs növekedés antibiotikum jelenlétében: rezisztens törzs mérsékelten érzékeny törzs A clindamycin és a pristinamycin esetében (csak egy koncentráció) csupán két eredmény lehetséges: Érzékeny (S) vagy Rezisztens (R). Példa: sárga/sárga: S (Sensitive, Érzékeny törzs) piros/sárga: I (Intermediate, Mérsékelten Érzékeny törzs) piros/piros: R (Rezisztens törzs) Kivételes eset: ha narancsszínt észlelünk. A sárgáról vörösre történő színváltozás kezdetén az alacsony koncentrációjú lyukakban narancsszínt figyelhetünk meg. Ezt is pozitívnak kell tekinteni, a teljes színváltozás a 48. óra múltán észlelhető. 8- A GYÁRTÓNÁL FOLYÓ MINŐSÉGELLENŐRZÉS Az összes termékünk a saját minőségellenőrző rendszerünk szerint készült, a nyersanyag átvételétől kezdve a termék forgalmazásáig. Minden egyes gyártási sorozat minőségét ellenőrizzük, és csak akkor hozzuk forgalomba, ha az megfelel az előre felállított kritériumoknak. Minden sorozat gyártási és minőségellenőrzési jegyzőkönyve megőrzésre kerül. 9- BELSŐ MINŐSÉGELLENŐRZÉS Minőségellenőrzési vizsgálatot liofilizált törzsgyűjteményből származó törzzsel (Ureaplasma parvum ATCC ) végezhetünk. Oldjuk fel a liofilizált törzset 1 ml frissen visszaoldott U 9 táptalajjal (kód: 62762). Készítsünk 1/10 hígítást frissen visszaoldott U 9 táptalajjal. Inkubáljuk a leoltott U 9 táptalajt 37 o C-on 18 órán át, aerob atmoszférában. Ebből az Ureaplasmában dúsított U9 táptalajból készítsünk 1/100 hígítást (vegyünk 20 μl liquot mennyiséget és adjunk hozzá 2 ml visszaoldott U 9 táptalajt). 6

7 A SIR MYCOPLASMA teszt leoltását a szokásos módon végezzük, azaz minden lyukba mérjünk 100 μl-t. Fedjük le a lemezt az öntapadós fóliával és inkubáljuk 37 o C-on 48 órán át. A lemez akkor olvasható le, amikor a növekedési kontroll színe sárgáról vörösre változik. Az elvárt eredmény profilja: Növekedési kontroll Növekedési kontroll DO 4-8 TE 4-8 JM 2-4 AZM 2-4 E 1-4 CM 2 PT S S S S S/I R S S/I OFX TELJESÍTMÉNY A SIR MYCOPLASMA tesztben vizsgált antibiotikumok kiválasztása a terápiás kezelések alapján történt, a SIR MYCOPLASMA antibiogram újraértékelése a kezelések megváltoztatásának figyelembe vételével történt. Az alábbiakban leírt két vizsgálat esetében a referenciamódszer a folyékony táptalajban kivitelezett minimális gátlókoncentráció (MIC) meghatározás volt (6, 15). Az első vizsgálatot (azithromycines lyukak nélkül) 80 törzsön végeztük, köztük 60 Ureaplasma spp és 20 Mycoplasma hominis törzsön (9). Ureaplasma spp törzsekkel Tetraciklinekre az egyezés 90%-tól [79,5-96,2%] 97%-ig [86,1-99%] terjedt, antibiotikumtól függően. Makrolidekre az egyezés 92%-tól [81,6-97,3%] 100%-ig [95,1-100%] terjedt, antibiotikumtól függően. Clindamycinre az egyezés 85% [73,4-92-9%] a Pristinamycinre az egyezés 100% [95,1-100%] a Fluorokinolonokra az egyezés 93% [83,8-98,2%] a Mycoplasma hominis törzsekkel Az egyezés tetracyclinre 85% [62,1-96,8%] a, az összes többi antibiotikumra 100% [86,1-100%]. Az előzőekben említett összes antibiotikumra nézve az egyezés 94,6% [92,4-96,4], 2,6% jelentős eltéréssel. Olyan törzset nem találtunk, mely a SIR MYCOPLASMA teszttel érzékenynek, a referenciamódszerrel rezisztensnek mutatkozott volna (kiugróan jelentős eltérés nem volt). A minocyclin 2 és 4 azithromycinnel való helyettesítése után újabb kiértékelést végeztünk. Összehasonlító vizsgálatot végeztünk a folyékony táptalajjal kivitelezett MIC meghatározás és a SIR MYCOPLASMA azithromycin tesztlyukai között. Referenciatörzseket és vad, klinikai törzseket is vizsgáltunk. Minden inokulumot standardizáltunk, és ellenőriztük, hogy az előírt és elfogadott 10 4 és 10 5 CCU/ml tartományon belül van-e (15). A két módszer eredményeit a teszt koncentrációinál érzékeny (S), mérsékelten érzékeny (I), illetve rezisztens (R) besorolás szerint értékeltük. A 15 referencia mycoplasma törzsre nézve (13 ATCC Ureaplasma spp törzs, és 2 ATCC Mycoplasma hominis törzs) az S és R klinikai besorolás egyezése 100% volt [81,9-100%] a volt. Minden Ureaplasma spp törzs érzékeny, míg a két Mycoplasma hominis törzs rezisztens profilt mutatott, a törzsek természetes rezisztenciájának megfelelően. A 15 Ureaplasma spp izolátum esetében a SIR MYCOPLASMA és a referenciamódszerrel végzett MIC meghatározás szolgáltatta klinikai besorolás egyezése 100% [81,9-100%] a volt. a : [CI 95%] = 95% megbízhatósági tartomány 7

8 11- AZ ALKALMAZÁS KORLÁTAI Ha a táptalaj színe pirosra változik, és zavarossá válik, akkor más mikroorganizmusok növekednek a közegben, és nem mycoplasmák (mivel ez utóbbiak növekedése a táptalaj átlátszóságát nem befolyásolja). Ez a jelenség az arginin és az U 9 táptalaj esetében is észlelhető, ha azokat 37 o C-on inkubáljuk. Az egyéb baktériumok jelenléte csokoládé agaron igazolható. Az eredmények végső értelmezése mint minden biológiai eredmény esetében nem alapulhat egyetlen vizsgálat eredményén, azokat klinikai adatokkal, valamint biokémiai, citológiai és immunológiai eredményekkel kell alátámasztani. Ha a SIR MYCOPLASMA beoltásához használt inokulum koncentrációja alacsony (<10 3 CCU/ml), a tesztlyukak színváltozása megbízhatatlan lehet. Ha a teszt eredménye rendellenesnek tűnik, tanácsos a standard inokulum ismételt elkészítése, és az antibiogram megismétlése SIR MYCOPLASMA teszttel. Ha egy adott antibiotikum esetében a magasabb koncentrációjú tesztlyuk piros, az alacsonyabb koncentrációjú pedig sárga marad, az eredmény nem értékelhető. Tanácsos az antibiogramot megismételni, új inokulumból kiindulva. A makrolidek, különösen az erythromycin, köztudottan ph-érzékenyek (14). Az alacsony koncentrációjú tesztlyukban tapasztalt színváltozás, melyből mérsékelt érzékenységre következtethetnénk, inkább a ph-változás, mintsem az antibiotikum hatásának tulajdonítható. Ez a színváltozási jelenség az azithromycin tesztlyukak esetében is megfigyelhető. 12- HIVATKOZÁSOK 1. BEBEAR C. Activité comparée de la minocycline et doxycycline sur les mycoplasmes pathogènes pour l'homme.pathol. Bio., 1985,33, CANTET P et BEBEAR C. Activité comparée in vitro de sept quinolones sur Ureaplasma urealyticum. Pathol. Bio.1983, 31, DAVIS J.W. Antimicrobial Susceptiblity of Ureaplasma urealyticum. J. Clin. Microb., 1981, 13, EVANS R.T and TAYLOR ROBINSON D. The Incidence of Tetracycline Resistant Strains of Ureaplasma urealyticum. J. Antimicrob. Chemother, 1978, 4, ROBERT M.C. Dissemination of the Tet M Tetracycline Resistance Determinant to Ureaplasma urealyticum. Antimicrob. Agents Chemother, 1986, 29, ROBERTSON J.A. Standardized Method for Determining Antimicrobial Susceptibility of Strains of Ureaplasma urealyticum and their Response to Tetracycline, Erythromycin and Rosaramincin. Antimicrob. Agents Chemother, 1981, 20, TAYLOR ROBINSON D. Clinical Antibiotic Resistances of Ureaplasma urealyticum. Pediatr. Infec. Dis., 1986, 5, SOBETZKO R., HARTMANN A.A., ELSNER P. Susceptibility of Ureaplasma urealyticum to Ten Chemotherapeutic Agents. Zbl.Bakt. Hyg. 1988, A269, RENAUDIN H., BEBEAR C. Evaluation des systèmes Mycoplasma Plus et SIR Mycoplasma pour la détection quantitative et l'étude de la sensibilité aux antibiotiques des mycoplasmes génitaux. Path.Biol., 1990, 38, n 5, CUMMINGS M.C., Mc CORMACK W.M. Increase in Resistance of Mycoplasma hominis to Tetracyclines. Antimicrob. Agents Chemother. 1990, 34, BAURIAUD R., SEROR C.,LARENG M.B., LEFEVRE J.C. Sensibilité in vitro aux antibiotiques des mycoplasmes génitaux isolés à Toulouse. Etude de nouvelles molécules (macrolides et quinolones).path. Biol. 1992, 40, n 5, WAITES K., DUFFY L., HAMRICK W., CROUSE D., CASSEL G. Microbiologic Efficacy of Intravenous erythromycin against Ureaplasma urealyticum in the Lower Respiratory Tract of 8

9 Preterm Neonates. 10th International IOM congress Bordeaux July 19 26th 1994 Poster n BEBEAR C.M., RENAUDIN H., CHARRON A., CLERC M., PEREYRE S., BEBEAR C DNA Gyrase and Topoisomerase IV Mutations in Clinical Isolates of Ureaplasma spp. and Mycoplasma hominis Resistant to Fluoroquinolones. Antimicrob. Agents Chemother. 47: KENNY G. E, CARTWRIGHT F.D Effect of ph, Inoculum size, and Incubation time on the susceptibility of Ureaplasma urealyticum to Eryhtromycin in vitro. Clin. Infect. Dis.; 17 (Suppl 1). 15. WAITES K.B., BEBEAR C.M., ROBERTSON J.A., TALKINGTON D. F., KENNY G. E. Laboratory Diagnosis of Mycoplasmal Infections. Cumitech Basic laboratory procedures in clinical bacteriology. Geneva : World Health Organization (WHO), 1991, 1st edition. 17. Sexually transmitted diseases treatment guidelines. MMWR May 10, 2002 / 51 / No- RR BEBEAR C.M L antibiogramme. Chap Paris : Eska Editor, 1 st edition. 19. BEBEAR C.M., RENAUDIN H Evaluation de la galerie SIR Mycoplasma incluant l azithromycine. - CE jelzés (Európai direktíva 98/79/CE az in vitro diagnosztikai célú orvosi eszközökről) - Csak in vitro diagnosztikai felhasználásra! - Katalógusszám - Gyártó - Meghatalmazott Képviselet - Gyártási szám - Szavatossági idő - Tárolási hőmérsékleti határok - Lásd a használati utasítást A tesztleírás az Európai Direktíva által előírt egyéb idegen nyelveken a Bio-Rad helyi képviseleteinél megtalálható. 9