MYCOPLASMA DUO TESZTKIT UROGENITÁLIS MYCOPLASMÁK AZONOSÍ- TÁSÁHOZ ÉS CSÍRASZÁM-MEGHATÁROZÁSÁHOZ

Átírás

1 MYCOPLASMA DUO TESZTKIT UROGENITÁLIS MYCOPLASMÁK AZONOSÍ- TÁSÁHOZ ÉS CSÍRASZÁM-MEGHATÁROZÁSÁHOZ

2 1. KLINIKAI JELENTŐSÉG A mycoplasmák kommenzalista szervezetek, amelyek az urogenitalis rendszer nyálkahártyáját kolonizálják, és bizonyos körülmények között nagymértékben felszaporodva különféle betegségeket okozhatnak. Ureaplasma urealyticum (Uu) férfiakban főleg húgycsőgyulladást, (a nongonococcalis urethritis második fő oka) olykor prostatitist és epididymitist is okozhat (12). Terhes nőkben az U. urealyticum chorionamnionitist (13) és idő előtti magzatburok repedést idézhet elő, amitől az újszülött is fertőződhet. Felelőssé tehető még a reproduktív rendellenességek előfordulásáért is (3, 4, 5). Mycoplasma hominis (Mh) Endometritist és salpingitist (12) okozhat, és kapcsolatba hozható az bakteriális vaginosissal is (8). Mindkét species kiválthat infekciót az újszülöttekben (meningitis, légúti fertőzések, sepsis (9, 10, 12, 13) ; gyermekágyi sepsist (6, 12) ; arthritist Mivel kommenzalista vagy patogén mikroorganizmusként egyaránt jelen lehetnek, kvantitatív kritériumok alapján kell kiértékelni a felnőttek urogenitális mintáiból készített tenyészeteket (1, 2, 11); a terápia kiválasztása a mycoplasma csíraszámon és a klinikai képen múlik. A MYCOPLASMA DUO alkalmas arra, hogy Urogenitalis mycoplasmákat (Uu és Mh) kitenyésszünk, azonosítsuk, és differenciális csíraszámlálást végezzünk. antibiotikum érzékenységi vizsgálatokhoz standard inoculumot készítsünk. 2. A MÓDSZER ELVE Az X jelű mikrotitráló tesztlyuk szelektivitását az alkalmazott gombaellenes szer, és antibiotikum keverék biztosítja. Az urogenitális mycoplasmák azonosítása és csíraszámának megállapítása az egyes válfajaik jellemző metabolizmusán alapul: - az Ureaplasma urealyticum (UU) hidrolizálja a karbamidot - a Mycoplasma hominis (MH) hidrolizálja az arginint, miközben ammónia szabadul fel, és a táptalaj lúgossá válik, a tápfolyadék zavarosodása nélkül. A reakció bekövetkeztét az jelzi, hogy a sárga színű ph-indikátor (fenolvörös) pirosra vált: sárga tesztlyuk: nincs jelen mycoplasma piros tesztlyuk: van mycoplasma a mintában. A csíraszám megállapítása a folyékony tápközeggel készített hígítási soron alapul. Először a szuszpendáló közegben, majd a D jelű tesztlyukban (10-1 hígítás), végül az U 10 4 és a H 10 4 tesztlyukban (10-2 hígítás) hígítjuk a mintát, így a törzs csíraszámát meg lehet állapítani. A csíraszám arányos lesz azzal, hogy hány tesztlyuk pirosodik be óra alatt: ezek mindegyikében legalább egy CCU (színváltozást okozó egység) található lásd: leolvasás. 2

3 Az antibiotikum érzékenységi teszt előkészítése Az X jelű tesztlyukban antimikotikum és antibiotikum keverék található, amellyel a minta szelektíven dúsítható, majd ezt lehet felhasználni 24 órás inkubálás után az antibiotikum érzékenység vizsgálathoz kellő standard inoculum előállításához ( CCU/ml) (CCU: színváltoztató egység). 3. A TESZTKIT TARTALMA - TÁROLÁS - SZAVATOSSÁGI IDŐ A tesztkit tartalma: Mycoplasma Duo (kódszám: 62740) 20 mikrolemez ; minden mikrolemez 6 tesztlyukból áll, az alábbi tartalommal: - az azonosításhoz szükséges beszárított szubsztrát - Mycoplasma növekedési faktorok - a kísérő baktériumflóra növekedését gátló anyagok U és U 10 4 : UU identifikálása és csíraszám meghatározása (karbamidot tartalmaz) H és H 10 4 : MH identifikálása és csíraszám meghatározása (arginint tartalmaz) D: hígító tesztlyuk X: szelektív mycoplasma dúsítás: minta előkészítése antibiotikum érzékenység vizsgálatához. 20 db reagens üvegcse egyenként 2 ml transzport közeggel a minta szuszpendálásához és szállításához 1 cseppentősüveg 15 ml hígítóval 40 műanyag mikropipetta (minden egyes mintához 2 db kell) 20 öntapadó takarófólia Mycoplasma Duo szuszpendáló közeg (kódszám: 62739) 40 db reagens üvegcse egyenként 2 ml szuszpendáló/transzport közeggel (a minta szuszpendálásához és szállításához) Tárolás: C között Szavatossági idő: a teszt dobozán feltüntetett lejárati határidőig 4. MINTÁK 3 1) Genitális minták: a húgycső, a méhnyak és a hüvely nyálkahártyájából véve (csecsemőknél ritkábban a torokból és az orr-garati területről, vagy a kötőhártyáról vett tamponminták). A mycoplasmák feltapadnak a sejtekre, ezért kaparékot kell vennünk a nyálkahártyáról. A tampont (cytobrush vagy Bactopick ) ezután áztassuk 2 ml tápközegbe. 2) Biológiai minták vizelet*: - első vizeletsugár: homogenizáljuk a mintát - teljes vizelet: 0.2 ml fiziológiás sóoldatban szuszpendáljuk a centrifugálás során kapott üledéket.

4 ondó, vagy ritkábban hemokultúra felülúszó, liquor, synoviális folyadék, vagy újszülötteknél a hörgőkbe beszívott folyadék esetében 0,2 ml mintával oltsunk be 2 ml szuszpenziós közeget. * Mivel a mycoplasmák feltapadnak a sejtekre, ezért a genitalis mycoplasmák detektálásához azok a legjobb urogenitális minták, amelyek hámsejteket tartalmaznak: a húgycsőből, a méhnyakról a hüvelyből származó tamponminták, amelyeket a nyálkahártya kaparásával gyűjtöttünk. A biológiai minták tárolási körülményeiről a hivatkozásokban (14) található tájékoztatás. 3) Szállítás Szükség esetén a minta szállítható is a szuszpenziós közegben. A közegbe történt leoltás után a minta még tovább tárolható: 48 óráig szobahőmérsékleten 72 óráig +2 és +8 C között 6 hónapig -20 C-on lefagyasztva. 5. A VIZSGÁLAT KIVITELEZÉSE A. A VIZSGÁLATHOZ SZÜKSÉGES EGYÉB, A KITTEL NEM SZÁLLÍTOTT ESZKÖZÖK 37 C-os inkubátor szennyezett hulladék gyűjtő tartály B. MUNKAMENET A mikrolemez beoltása 1) Higító oldat A cseppentős üvegből 4-4 csepp (200 µl) hígítót töltsünk a mikrolemez alsó sorában elhelyezkedő mindhárom tesztlyukba, az U 10 4, a D és a H 10 4 jelű lyukakba. 2) Minta Egy mikropipettával mérjük szét a mintával beoltott szuszpenziós közeget: 4-4 csepp (100 µl) kerüljön a mikrolemez felső sorának három tesztlyukába, az U, az X és a H jelű lyukba; 1 csepp (25 µl) a D jelű lyukba. 3) Hígítás Egy másik pipettával (mindenképpen új pipettát kell használni a hígítási sor készítéséhez, mivel a mycoplasmák feltapadnak a műanyagra) alaposan keverjük el a D jelű tesztlyuk tartalmát (háromszor szívjuk fel a folyadékot), majd egy-egy cseppet (25 µl) mérjünk be az U 10 4 és a H 10 4 jelű lyukakba. Inkubálás fedjük le a mikrolemezt az öntapadó fóliával; inkubáljuk 24 órán át 37 C-os inkubátorban, majd ha szükséges (lásd 7. fejezet), további 24 óráig. 4

5 5 C.

6 6. LEOLVASÁS ÉRTÉKELÉS 1) Leolvasás Az eredményeket először 24 óráig tartó inkubálás után olvassuk le: ekkor már egyértelmű eredményt kapunk a magas csíraszámú mintáknál ( 10 4 CCU/ml); A második leolvasást 48 órás inkubálás után végezzük. Erre azért van szükség, hogy: - konfirmáljuk a negatív eredményeket; - detektálhassuk a kis csíraszámban ( 10 3 CCU/ml) jelenlévő törzseket; - detektálhassuk azokat a törzseket, amelyek bár magas csíraszámban vannak jelen ( 10 4 CCU/ml), de lassú az anyagcseréjük. 2) Értékelés A karbamidot és/vagy arginint tartalmazó tesztlyukak színének sárgából pirosra változása, a tápközeg megzavarosodása nélkül, mycoplasmák jelenlétét jelzi. A leolvasási és értékelési diagram mindkét mycoplasma speciesre ugyanaz. Olvassuk le az U és U 10 4 tesztlyukakat az UU kiértékeléséhez és a H, valamint H 10 4 lyukakat az MH értékeléséhez. A MYCOPLASMA DUO lehetővé teszi, hogy külön-külön meghatározzuk a két mycoplasma faj csíraszámát, noha mindkettő jelen lehet egy és ugyanazon mintában. A mintákat a következő csoportokba sorolhatjuk: negatív: nincs színváltozás (sárga tápközeg) UU-pozitív: csak az U tesztlyuk(ak)ban történik színváltás; MH-pozitív: csak a H tesztlyuk(ak)ban történik szánváltás; UU- és MH-pozitív: ha mind az U, mind a H lyukakban bekövetkezik a színváltozás, akkor mind a két faj jelen van a mintában. Olvassuk ki mindkét faj csíraszámát. 6

7 7

8 8

9 MEGJEGYZÉS: Késleltetett leolvasás (pl. hétvége után): az eredmények 48 óra után már nem változnak, vagyis később is leolvashatók. Az azonosítás eredménye megerősíthető az mycoplasma agaron elkülönített telepek vizsgálatával. Ha a tápközeg megzavarosodik, mely a mycoplasmákon kívül más baktériumok jelenlétét jelzi (ez ritkán fordul elő, mivel az adalékanyagok fokozzák a szelektivitást), készítsünk leoltást agaron a szuszpendáló közegben, vagy a D tesztlyukból (helyezzünk 3 cseppet a táptalaj felszínére), és inkubáljuk 48 órán át 37 o C-on 10%-os CO 2 atmoszférában. Az alkalmazott eljárás alkalmas a 10 3 és 10 4 csíra/ml körüli csíraszámok meghatározására, melyek megfelelnek az elfogadott a patogenitási határértékeknek 7. AZ X TESZTLYUK HASZNÁLATA Az X tesztlyukat nem kell kiértékelni. Azt a célt szolgálja, hogy a mycoplasmát szelektíven feldúsítsuk, majd ebből standard inoculumot készítsünk antibiotikum érzékenységi vizsgálathoz (SIR MYCOPLASMA, KÓDSZÁM: 62781): Hígítsuk az X tesztlyuk tartalmát 1:100 arányban: U 9 bouillonnal (kódszám: 62762) az UU-hoz arginin bouillonnal (kódszám: 62763) az MH-hoz. Vegyünk az X tesztlyuk tartalmából 20 µl-t, és adjuk 2 ml karbamid vagy arginin bouillonhoz (a fajnak megfelelően). A SIR MYCOPLASMA tesztlap tesztlyukait oltsuk be az 1:100 hígítás 100 µl-nyi mennyiségeivel. 8. A TESZT MINŐSÉGE / MINŐSÉGELLENŐRZÉSE A Mycoplasma Duo minőségnek ellenőrzése az alábbi törzsekkel történik: TÖRZSEK Ureaplasma urealyticum ref UU 80 Mycoplasma hominis ref MH 31 Enterococcus faecalis CIP Proteus mirabilis ATCC Staphylococcus aureus CIP MÚKÖDÉS ELLENŐRZÉSE Megfelelő azonosítás, csíraszám meghatározás és dúsítás MIKROLEMEZ GÁTLÁS ELLENŐRZÉSE gátltás gátltás TÁPKÖZEG GÁTLÁS ELLENŐRZÉSE gátltás 9. A GYÁRTÓNÁL FOLYÓ MINŐSÉGELLENŐRZÉS Az összes termékünk a saját Minőségellenőrzési Rendszerünk szerint készült, a nyersanyag átvételétől kezdve a termék forgalomba hozataláig. Minden egyes gyártási sorozat minőségét ellenőrizzük, és csak akkor hozzuk forgalomba, ha az megfelel az előre felállított kritériumoknak. Minden sorozat gyártási és minőségellenőrzési jegyzőkönyve megtalálható a Bio-Radnál. 9

10 10. A TESZT ALKALMAZÁSÁNAK KORLÁTAI Vizeletmintáknál, ha nem tartalmaznak elég nagy mennyiségű sejtet, hamis negatív eredményt kaphatunk, vagy erősen lúgos ph-jú minták álpozitív eredményt is adhatnak. 11. HIVATKOZÁSOK 1. EB F. and ORFILA J., Les Mycoplasmes génitaux: rôle pathogène et diagnostic, Méd. Mal. infect, 1985, 9bis, SCHIEFFER H.G., Urethral syndrome in women: etiologic, cytologic and clinical studies, (abstract) June 1988: 7th Congress International Organization for Mycoplasmology - Vienna 3. QUINN P.A. and coll. Incidence of late loss and U. urealyticum in women with recurrent pregnancy loss, Abstract of the 1987 ICAAC 4. LAMONT R.F. TAYLOR ROBINSON D. and coll. The role of mycoplasmas,ureaplasmas and chlamydia in the genital tract of women presentingspontaneous early preterm labor., J. Med. Microbiol., 1987,- 24, WAITES K.B. and coll. Ureaplasma pneumonia and sepsis associated with persistent pulmonary hypertension in the newborn, (abstract) June 1988: 7th Congress International Organization for Mycoplasmology -Vienna 6. PHILLIPS L.E. and coll., Post cesarean wound infection by Mycoplasma hominis in a patient with persistent post partum fever, Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 1987, 7, BEBEAR C. and RENAUDIN H., Les mycoplasmes génitaux : principe d isolement et d identification, Feuil. Biol., 1986, 27, MARDH P.A. and coll., Mycoplasma hominis in women with bacterial vaginosis and their consorts, (abstract) June 1988: 7th Congress International Organization for Mycoplasmology - Vienna 9. WAITES K.B. and coll., Chronic Ureaplasma urealyticum and Mycoplasma hominis infections of central nervous system in preterm infants. Lancet, 1988, 2/9, MADOFF S. & HOOPER D.C., Non genitourinary infections caused by Mycoplasma hominis in Adults. Rev. Infect. Dis., 1988, 3, BONISSOL CH., Isolement et identification des mycoplasmes urogénitaux, Méd. Mal. infect., 1980, 10, COPIN E. and LEBRUN L., Infections à mycoplasmes urogénitaux, Feuil. Biol, 1991, 32, (181), CASSELL G.H., WAITES K.B., WATSON H.L., CROUSE D.T. and HARASAWA R., Ureaplasma urealyticum intra-uterine infection: role in prematurity and disease in newborns, Clin. Microbiol, Rew., 1993, 6 (1), Basic Laboratory Procedures Clinical Bacteriology. World Health Organization. Geneva st edition. 10

11 98

12 99

13 Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) /2003 Fax.: +33 (0) code: