Rheumatoid kórképek autoimmun patomechanizmusának vizsgálata

Átírás

1 Rheumatoid kórképek autoimmun patomechanizmusának vizsgálata Doktori tézisek Ortutay Zsuzsanna Semmelweis Egyetem Genetikai, Sejt és Immunbiológiai Intézet Témavezető: Dr. Buzás Edit egyetemi docens, az orvostudományok kandidátusa Hivatalos bírálók: Dr. Sármay Gabriella PhD, DSc Dr. Dérfalvi Beáta PhD, DSc Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Füst György PhD, DSc Dr. Kacskovics Imre PhD Dr. Treszl András MD, PhD Budapest, 2007

2 Bevezetés A gyulladásos és degeneratív ízületi betegségek esetében az életminőség súlyos romlása következik be, krónikus fájdalom jelentkezik, a kialakuló deformitások nemritkán mozgáskorlátozottsághoz és ennek következtében a munkavégző képesség csökkenéséhez, gyakran teljes elvesztéséhez vezetnek. A legjelentősebb klinikai tüneteket és a beteg mozgáskorlátozottá válását a hialinporc visszafordíthatatlan károsodása okozza. Ebben a folyamatban a porc alapállomány komponenseinek (II. típusú kollagén és aggrekán) hasítására képes enzimeket tartják a legfőbb effektor molekuláknak. Elsősorban különböző proteázokat hoztak összefüggésbe a porcdestrukciós folyamatokkal, köztük a mátrix metalloproteinázokat (MMP), az ADAM család, az ADAM TS család tagjait és szerin proteázokat (elasztáz, katepszinek és granzimok). A glikohidrolázok enzimcsaládja azonban az utóbbi évtizedekben nem volt jelen az arthritis kutatások fókuszában annak ellenére, hogy a porc alapállomány makmolekuláit igen jelentős glikoziláció jellemzi, s ez befolyásolhatja számos tulajdonságukat, így emészthetőségüket is. Az utóbbi években számos autoimmun betegség esetében azonosították sikeresen az autoantigéneket. A rheumatoid arthritis (RA) autoantigénje azonban a széleskörű kutatások 2

3 ellenére mindez idáig ismeretlen maradt. Mivel az autoimmun ízületi destrukció elsődleges célpontja a hialinporc, az ennek felépítésében résztvevő molekulák (pl. aggrekán), mint az autoimmun folyamatok nyilvánvaló célpontjai vehetők számításba. Célkitűzés I. Az RA patomechanizmusában szerepet játszó enzimek vizsgálata Az utóbbi évtizedekben a porcdegradáció folyamatában főként az MMP k szerepét vizsgálták, a glikozidáz enzimek szerepének vizsgálata háttérbe szorult. Munkánk során a porcdegradációban érintett effektor mechanizmusok vizsgálatát, az MMP k és a glikozidázok hatázainak tanulmányozását tűztük ki célul. Céljaink a következőek voltak: 1. Különböző ízületi bántalmakban szenvedő betegek synoviális folyadékában azon glikozidázok enzimaktivitásának vizsgálata, melyek képesek a porc aggregáló, kondroitin szulfátban gazdag proteoglikánjára, az aggrekánra jellemző szénhidrátláncok degradációjára. 2. A glikozidáz és az MMP enzimek együttműködésének vizsgálata a porcdegradációs folyamatban. 3

4 3. A vizsgált enzimek prediktív értékének tanulmányozása. 4. Az enzimeknek a közvetlen porcmátrixot károsító (glükózaminoglikán (GAG) depléciót előidéző) szerepének vizsgálata. 5. A szérumban illetve a synoviális folyadékban mérhető, exoglikozidázokat felismerni képes autoantitestek tanulmányozása. 6. A glükozidázok közül a D glükuronidáz (GLUC) forrásaként szolgáló sejtek azonosítása. II. Az RA patomechanizmusában esetlegesen szerepet játszó porc alapállomány molekulákkal reagáló antitestek vizsgálata Az RA olyan szisztémás autoimmun betegség, melynek autoantigénjét nem ismerjük annak ellenére, hogy kutatása évtizedekre nyúlik vissza. Az ízületi károsodás elsődleges célpontja a hialinporc, így kézenfekvő feltételezés, hogy a porcmátrix felépítésében résztvevő molekulák között kell keresnünk a betegség autoantigénjét. A porcalapállomány kis proteoglikánjai az összes proteoglikán tömegének csak kis részét képezik, mégis a nagy proteoglikánokkal azonos moláris mennyiségben vannak jelen. A porcmátrix kis proteglikánjai ellen fellépő immunválaszt még nem tanulmányozták RA ban. 4

5 Célul tűztük ki az alábbi vizsgálatok elvégzését: 1. Különböző gyulladásos és degeneratív ízületi betegségek esetén az egyes ellenanyagok szintjének vizsgálata a betegek szérumában és synoviális folyadékában. 2. A klinikai / laboratóriumi paraméterek és az ellenanyag szint összefüggéseinek vizsgálata RA betegcsoport esetén. 3. A különböző porcmátrix komponensekre specifikus ellenanyagok közötti összefüggések vizsgálata. Módszerek Mintagyűjtés Az Országos Reumatológiai és Fizioterápiás Intézetben (ORFI) kezelt 62 beteg (16 férfi és 46 nő) szérum és synoviális folyadék mintáit gyűjtöttük össze. Vizsgálatunkba foglaltunk még 14 beteget (9 férfi, 5 nő), akik a Debreceni Egyetem Orvos és Egészségtudományi Centrum (DEOEC) Orthopédiai Klinikáján térdízületi arthroscopián estek át akut sérülést követően. 5

6 I. Az RA patomechanizmusában szerepet játszó enzimek vizsgálata Glikozidáz tesztek A synoviális folyadék és szérum mintákban Dglükuronidáz, D N acetil glükózaminidáz, D N acetilgalaktózaminidáz, mannozidáz és D galaktozidáz enzimek aktivitását kromogén szubsztrátok (rendre p nitrofenil Dglükuronid, p nitrofenil N acetil D glükózaminid, p nitrofenil N acetil D galaktózaminid, p nitrofenil Dmannopiranozid illetve p nitrofenil D galaktopiranozid) segítségével mértük a minta saját ph ján, illetve ph=5,8 on (a synoviális folyadék fiziológiás ph ja). Az optikai denzitást 405 nm en mértük. MMP aktivitás mérése A synoviális folyadék minták MMP 1 és MMP 9 aktivitását Biotrak MMP 1 és MMP 9 aktivitás assay rendszerekkel mértük (Amersham Pharmacia Biotech) a gyártó utasításait követve. A glikozidáz és MMP tesztek statisztikai analízise A statisztikai számításokhoz a Splus6 for Windows programot használtuk. A betegcsoportok enzimaktivitását 6

7 Tukey honest significant difference módszere alapján hasonlítottuk össze. Az enzimaktivitásokat annak tükrében is megvizsgáltuk, hogy milyen a prediktív erejük az RA és nem RA csoportok elkülönítésében. A cél érdekében stepwise logistic regressziót alkalmaztunk. A porcszövet vizsgálata glükózaminoglikán specifikus Safranin O festéssel Autopsziás humán újszülött porcmintákat glikozidázokkal ( D N acetil glükózaminidáz (NAG), D glükuronidáz (GLUC)) illetve mátrix metalloproteinázokkal (MMP 1, MMP 9) emésztettünk külön külön, illetve egymással kombinálva. A szövetdarabkákat az emésztéseket követően 4 % os neutralizált formalinban fixáltuk és paraffinba ágyaztuk, majd 8 10 m vastag metszeteket Safranin O val festettünk. A porcszeletek képét digitalizáltuk, majd optikai denzitásukat meghatároztuk. Glikozidáz specifikus antitestek kimutatása Synoviális folyadékban NAG és GLUC specifikus ellenanyagokat ELISA módszerrel mutattunk ki. 7

8 Glikozidáz enzimek aktivitásának vizsgálata áramlási citometria segítségével A perifériás vérsejtek D glükuronidáz aktivitását áramlási citometriás rendszerben ImaGene Green C12FDGlcU szubsztráttal vizsgáltuk limfocita, monocita és granulocita kapukon belül. II. A RA patomechanizmusában esetlegesen szerepet játszó porc alapállomány molekulákkal reagáló antitestek vizsgálata A porcmátrix komponensek ellen termelt ellenanyagok kimutatása ELISA módszerrel aggrekán, biglikán, dekorin, II. típusú kollagén illetve fibronektin specifikus IgG és IgM típusú ellenanyagokat mutattunk ki szérum és synoviális folyadék mintákból, majd elvégeztük az eredmények statisztikai elemzését. Eredmények I. Az RA patomechanizmusában szerepet játszó enzimek vizsgálata 1. Meghatároztuk ötféle exoglikozidáz ( Dglükuronidáz, D N acetil glükózaminidáz, D Nacetil galaktózaminidáz, D mannozidáz és D 8

9 galaktozidáz) aktivitását humán synoviális folyadék mintákban mind a minta eredeti ph ján, mind pedig ph=5,8 mellett RA, szeronegatív spondylarthritis (SNSA), osteoarthritis (OA) és akut térdsérüléses betegek esetén. A synoviális folyadékok enzimaktivitása egységesen nagyon alacsony értéknek adódtak a D galaktozidáz, D N acetilgalaktózaminidáz és D mannozidáz enzimek mérésekor. Ugyanakkor szignifikánsan magasabbak voltak a D glükuronidáz (GLUC), illetve D Nacetil glükózaminidáz (NAG) esetében. 2. Az utóbbi két enzim (GLUC, NAG) aktivitását vetettük össze a különböző ízületi bántalmakban szenvedő betegek MMP 1 és MMP 9 szintjével. Az enzimcsoportok (vagyis az exoglikozidázok és az MMP k) tagjai közötti korrelációt vizsgálva azt találtuk, hogy a különböző csoportba tartozó enzimek közötti korreláció sokkal kevésbé kifejezett, mint az enzimcsoporton belüli korreláció. 3. A porcmátrix glükózaminoglikán (GAG) molekulákból való kiürülését vizsgálva arra az eredményre jutottunk, hogy míg a domináns exoglikozidázok hatékonynak bizonyultak a porc GAGtartalmának kiürítésében, a legjelentősebb hatást a kombinált emésztési eljárás eredményeként láthattuk, 9

10 melynek során az MMP kkel való emésztést glikozidáz kezelés követte. 4. A GLUC és a NAG aktivitása, ha a synoviális folyadék eredeti ph ján mértük, az RA szignifikáns prediktoraként szolgál. Ezzel ellentétben sem ugyanezek az enzimek ph=5,8 n mérve, sem pedig az MMP 1 illetve az MMP 9 szintje nem mutatott különbséget a betegségcsoportok között. 5. Az RA ban szenvedő betegek szérumának 48,27 % ában és SF ának 21,74 % ában volt mérhető emelkedett anti D glükuronidáz ellenes antitest szint. Ezek az antitestek irodalmi adatok alapján megfelelhetnek az RA ban korábban leírt D glükuronidáz specifikus perinukleáris antineutrofil citoplazmatikus antitesteknek. 6. Az RA ban szenvedő betegek vérsejtjeiből magasabb GLUC aktivitást mutattunk ki, mint az egészséges egyénekéből. A különbség a granulociták esetében volt a legkifejezettebb; ezen sejttípus esetében volt mérhető a legnagyobb D glükuronidáz aktivitás, de szignifikáns különbség volt kimutatható a monociták és a limfociták esetében is. Nem találtunk szignifikáns összefüggést egyazon RA ban szenvedő beteg (n=4) synoviális folyadékában mérhető és limfocita asszociált D glükuronidáz aktivitása között. 10

11 II. Az RA patomechanizmusában esetlegesen szerepet játszó porc alapállomány molekulákkal reagáló antitestek vizsgálata 1. A szérumban nem találtunk szignifikáns eltérést a különböző csoportok porcantigén specifikus ellenanyag szintjei között. Ezzel szemben a synoviális folyadék ellenanyag szintjei markánsan megkülönböztették az egyes betegségcsoportokat. RAban szenvedő betegek synoviális folyadékában szignifikánsan magasabb biglikán specifikus IgM reaktivitást mértünk, mint OA ban szenvedő betegek esetében. Az egyéb SNSA betegek csoportját a szignifikánsan magasabb synoviális folyadék antidekorin IgG szint különböztette meg az OA ban szenvedő betegek csoportjától. A syn folyadékban a II. típusú kollagénre specifikus IgG és IgM szintje szignifikánsan magasabb volt az RA csoportban, mint az OA ban, vagy SNSA ban szenvedő betegek esetében. A fibronektin specifikus IgG szint is emelkedett volt az RA csoport synoviális folyadékában az OA csoporthoz viszonyítva. 2. Nem találtunk összefüggést a szérumban mérhető ellenanyag szint és a betegek klinikai / laboratóriumi paraméterei között az RA csoportban. Ezzel szemben a II. típusú kollagénre specifikus IgG ellenanyagok 11

12 szintje a synoviális folyadékban korrelált a szérum reumafaktor tartalmával. 3. Erős korrelációt találtunk a II. típusú kollagénre illetve a fibronektinre specifikus ellenanyag szintek között. Szintén megfigyelhető volt az aggrekánra illetve a biglikánra specifikus ellenanyagok szintjeinek korrelációja. Következtetések I. Az RA patomechanizmusában szerepet játszó enzimek vizsgálata Munkánk során a porcdegradációban érintett effektor mechanizmusokat vizsgáltuk, különös tekintettel a glikozidáz enzimek szerepére. Két domináns exoglikozidáz enzimet azonosítottam humán synoviális folyadék mintákban: a Dglükuronidáz és a D N acetil glükózaminidáz enzimeket. Ezek az enzimek a synoviális folyadék eredeti ph ján is aktívak voltak, és ezen a ph n mérve aktivitásuk asszociációt mutatott az RA betegséggel. Az általunk glikozidázzal illetve glikozidázzal és MMP kkel emésztett porcmintákon a korai arthritishez hasonló szöveti mintázatot láthattunk, ez jól alátámasztja eredményeinknek a klinikai tünetekhez való relevanciáját. A glikozidázok fő forrásai RA ban szenvedő betegek esetén a gyulladásos sejtek lehetnek, mivel a sejtes véralkotókban magasabb GLUC aktivitás volt kimutatható. 12

13 II. Az RA patomechanizmusában esetlegesen szerepet játszó porc alapállomány molekulákkal reagáló antitestek vizsgálata A porcmátrix felépítésében szerepet játszó kis méretű proteoglikánok (biglikán és dekorin) felismerésére vonatkozóan azt találtuk, hogy bár a II. típusú kollagén felismerése az elsődleges RA ban, a synoviális folyadékban mérhető anti biglikán IgM ellenanyag szintje szignifikánsan magasabb volt RA esetén, mint OA ban. Az emelkedett dekorin specifikus IgM ellenanyagok relatív gyakorisága volt a legmagasabb a különböző porcmátrix molekulákra specifikus, emelkedett mennyiségben jelenlevő IgM típusú ellenanyagok közül. Erős korrelációt találtunk a II. típusú kollagén és a fibronektin, illetve az aggrekán és a biglikán specifikus ellenanyag szintek között. A porcmátrix kis proteoglikánjainak felismerése ezek alapján másodlagos az autoimmun folyamatban. Saját publikációk jegyzéke A disszertáció témájához kapcsolódó közlemények 1. Ortutay Z, Polgar A, Gomor B, Geher P, Lakatos T, Glant TT, Gay RE, Gay S, Pallinger E, Farkas C, Farkas E, Tothfalusi L, Kocsis K, Falus A, Buzas EI. Synovial fluid exoglycosidases are predictors of rheumatoid arthritis and are 13

14 effective in cartilage glycosaminoglycan depletion. Arthritis Rheum. 48(8): Polgar A, Falus A, Koo E, Ujfalussy I, Sesztak M, Szuts I, Konrad K, Hodinka L, Bene E, Meszaros G, Ortutay Z, Farkas E, Paksy A, Buzas EI. Elevated levels of synovial fluid antibodies reactive with the small proteoglycans biglycan and decorin in patients with rheumatoid arthritis or other joint diseases. Rheumatology (Oxford). 42(4): A disszertáció témájához nem kapcsolódó közlemények 1. Bosze S, Hudecz F, Igaz P, Ortutay Z, Csik G, Falus A, Toth S. Interleukin 6 N terminal peptides modulate the expression of junb protooncogene and the production of fibrinogen in HepG2 cells. Biol Chem. 384(3): Bosze S, Igaz P, Szabo R, Tobisch Z, Toth S, Falus A, Hudecz F. Interleukin 6 peptides modulate the production of acute phase proteins and the expression of junb protooncogen on HepG2 cells. In: Peptides Proc. 25th European Peptide Symposium, (Ed.: Bajusz, S., Hudecz, F. ) Akadémiai Kiadó, pp Bosze S, Igaz P, Szabo R, Tobisch Z, Toth S, Falus A, Hudecz F. Interleukin 6 peptides modulate the production of acute phase proteins and the expression of junb protooncogen on HepG2 cells. Journal of Peptide Science 4, 85,

15 4. Bosze S, Igaz P, Takacs K, Szabo R, Tobisch Z, Toth S, Falus A, Hudecz F. Modulation of junb mrna expression and of acute phase response of HepG2 cells by WSXWS motif related peptides and monoclonal antibodies. The Immunologist S1, 516,