Az enzimes analízis helye és perspektívái a korszerű élelmiszeranalitikában* I. Az enzimes analízis elméleti alapjai

Átírás

1 Az enzimes analízis helye és perspektívái a korszerű élelmiszeranalitikában* I. Az enzimes analízis elméleti alapjai TÖRLEY DEZS 6** és VÁMOSNÉ VIGYÁZÓ LI LL Y*** Érkezett: 978. november 5.. Bevezetés Az enzimológia fejlődése az élelmiszerkémiai és élelmiszertechnológiai ismeretek fejlődéséhez erősen kapcsolódott, talán azt is állíthatjuk, hogy ezen a tudományterületen tanulmányozták és használták először az enzimeket. A keményítő cukrosítása, a fehérjék bontása, a mandula emulzinjának hatása régen ismeretes, és már a múlt században sor került olyan analitikai eljárások bevezetésére, melyek indikátorszérűén mutatták egyes élelmiszerek hőkezelésének elégséges vagy elégtelen voltát. Századunkban az enzimes élelmiszer-analízis sokat fejlődött, de összefoglaló munka erről a területről csak 952-ben jelent meg, mikor Steifer () könyvében rendszerezve közölte az 950-ig megjelent ilyen tárgyú publikációkat. 2. Az enzimes analízis alkalmazási területe az élelmiszertudományban Az enzimek analitikai alkalmazhatósága két alapvető tulajdonságukra vezethető vissza: a) fajlagosságuk következtében olyan anyagok meghatározására is használhatók, amelyek elválasztása egyébként alig lehetséges vagy nagyon nehéz; b) az enzimek nagyon érzékenyek a környezeti tényezők, különböző kémiai és fizikai befolyások iránt. Ezért használhatók gátló vagy gyorsító tényezők vizsgálatára is. A felsorolt tulajdonságok azonban nemcsak az enzimes analízis előnyeit szabják meg, hanem a korlátáit is. Mivel az enzimek biológiai katalizátorok, olyan vegyületek analitikájára alkalmasak, amelyek az élő szervezetek anyagcseréjében előfordulnak. Ezen túlmenően vizsgálhatók enzimekkel olyan anyagok, amelyek a biológiai átalakulásokat befolyásolják. Az enzimek katalizátor voltából következik, hogy hatásuk megállapításához az egyes kémiai reakciók sebességét kell mérnünk, tehát szem előtt kell tartanunk a reakciókinetika törvényeit is. Az enzimek aktivitását is a katalizált reakció sebességével mérik; egysége az az aktivitás, mely percenként ^mol szubsztrátumot alakít át, lehetőleg szubsztráttelítettség mellett. * Elhangzott a M KE Biokémiai Szakosztálya, a M ÉTE és a M agyar K linikai Laboratórium i Diagnosztikai T ársaság Enzim es analízis és enzim diagnosztika kollokvium án. M átrafüred, 978. máj ** B udapesti Műszaki Egyetem Biokém iai és Élelm iszertechnológiai Tanszék. *** Központi Élelm iszeripari K utató Intézet, Budapest. 57

2 2.. Az enzimreakciók kinetikája Az enzimreakciók matematikai leírása ma is Michaelis és Menten (2), ill. Briggs és Haldane (3) levezetése alapán történik. Ez az elmélet feltételezi, hogy az enzim az S szubsztrátummal ES enzim - szuhsztrát komplexet képez, és a szubsztrátum átalakulásának sebessége arányos a komplex koncentrációjával. Az ES bomlása a sebességet befolyásoló lépés a termékképződés folyamatában. Egy-szubsztrátumos reakció esetén: K i K 3 E + S - ES - E + P () K 2 ahol: Kp K2 és K3 sebességi állandók, P a termék. Az enzimes reakciókat rendszerint a termék képződésének, vagy a szubsztrátum eltűnésének mérésével követjük. Fontos a reakció kezdeti sebességének mérése, mikor a szubsztrátum-koncentráció még nem csökkent számottevően, ill. nem képződött nagyobb mennyiségű gátló termék. Ha a reakció sebességét (v) a szubsztrátum-koncentráció [S] függvényében ábrázoljuk, hiperbolát kapunk, melynek egyenlete Vmax [S] Km + [S] + KM (2) ahol: Vmax és Km állandó. A Vmax maximális sebesség akkor érhető el, h a Gyakorlatilag ez Km nem következik be. Nagysága függ az enzimkoncentrációtól, és úgy is definiálható, mint az a sebesség, mely akkor alakul ki, ha a teljes enzim-mennyiség ES alakban van. Km a Michaelis állandó, azt a szubsztrátum-koncentrációt adja meg, amelynél a reakciósebesség a maximálisnak fele: Vmax V = Ez tehát az enzimnek a szubsztrátum iránti affinitását mutatja: minél kisebb Km - annál nagyobb az affinitás. Km függ a sebességi állandóktól is: ha k2» k3, akkor Km = Ks = KM = ^2 К k2 + k3 К К s = [S ] [ E ] [S ] Km értéke függ a hőmérséklettől, a ph-tól, a puffer minőségétől, effektoroktól stb., dimenziója mól dm-3. V m a x és Km meghatározható, ha a (2) egyenletet megfelelő átrendezés után ábrázoljuk. Legtöbbször Lineweaver és Burk (4) módszerét használják. A (2) egyenlet reciproka: _ Км [ 58 V V m a x [S ] V m a x L E S ] (3) (4)

3 Ez az у = ax + b típusú egyenes ábrázoljuk (. ábra). Ha egyenlete, értékét függvényében v [S] és =0, - [S] = К м - J [ S ] V V m a x Hofstee (5) szerint is lineáris összefüggés állapítható meg (2. ábra), mert a fentiek szerint V [S] + V К м = ^ гп ах [S] (6) V v + Km = Vmax (7) V V = - К M 72^ + V max b ] (8) kapunk. Ha a v-t ábrázoljuk V ~ függvényében, ismét у = a x + b típusú egyenest H a v -0, V - Vma\ [SÍ KM V ha 7Z 7 = 0, V = Vmax. LS] 7. ábra. A K m és Vm ax kinetikai állandók m eghatározása Lineweaver és B urk (4) szerint. [S] = a szubsztrátum koncentrációja, v = a reakciósebesség. A tengely-m etszet az ordinátán a m axim ális reakciósebesség (Vm ax) reciproka, az abszcisszán =. (K m = a Michaelis állandó). Km 2. ábra. A K m és Vm ax kinetikai állandók meghatározása Hofstee (5) szerint. A jelölések, m int у az 7. ábrán. A tengelym etszet az ordinátán = Vm ax) az abszcisszán = max Km 59

4 Az utóbbi szélső esetek közvetlenül is levezethetők a (2) egyenletből: ha [S]» Km. akkor v = V m a x, ha [S] «Km. akkor v = V m a x ~K^~ [S] és [S ] V m a x K^vT Az eddig tárgyalt folyamatok egy-szubsztrátumos reakciók voltak: S E, A több-szubsztrátumos reakciók esetében a viszonyok sokkal bonyolultabbak Vegyünk például egy két-szubsztrátumos folyamatot: P E2 S + S * Р г + Р 2, amelyben az enzim a szubsztrátum-molekulákkal biner és terner komplexeket képez. Ha feltételezzük, hogy a terner komplex bomlása termékké viszonylag lassan játszódik le és az egyes biner ES komplexek gyorsan képződnek, akkor v = + KaíSi [SJ V m a x Km s2 [ S 2] + KmSiSY [SJ [S2] (9) ahol KmSi az E S ^ ^ ES2 + S; Km s2 az ESíS2 ~ ESi + Sg, K m S i S2 az E S js g ES j+ Sj, E S 2 ä E + S 2, ill. E S ^ folyamatok megfelelő állandója. E S x + Sa, E S t = E + S x Ha [SJ» KmSi, akkor a (9) egyenlet egyszerűsödik: és megforditva. V m a x V m a x [ S 2] j Km s2 KaíS2+ [S 2] (0) + [S2] Az egyes szubsztrátumok nagy koncentrációját alkalmazva tehát a Michaelisállandók meghatározhatók. Ha [SJ «KmSj, akkor v = K m s 2+ V m a x [ S J KmSiS2 [S 2] ( ) 60

5 Ha viszont [Sj] «KvuSi és [S2]» KMSxSa, akkor v = V m a x [ S ] i ( 2) KmSi 2.2. Az enzimes analitikai meghatározások fontosabb típusai Metabolitkoncentrációk meghatározása (végp о n t a n a í z i s). Ha a S P átalakulás teljes, a végső értéket határozzuk meg. Ha S és P között van jellegzetes kémiai vagy fizikai különbség, a végpontot közvetlenül mérhetjük. Pl. a piridin-koenzimek 260 nm-en abszorbeálnak, redukált alakban 340 nm-en is. Ezáltal követhető a reakció minden beavatkozás nélkül! A 340 nm-en mért /Е alapján mind az oxidáció, mind a redukció követhető. Megfelelő redox-színezékek alkalmazásával a nikotinamid-koenzimtől függő reakciók a látható spektrumban is követhetők: a tetrazóliumsók redukciójával formazánok képződnek, ezeknek színintenzitása fotométerrel mérhető. Ha az enzimes reakció egyensúlya a termékmeghatározás szempontjából nem megfelelő, mellékreakció segítségével lehet eltolni az egyensúlyt a kívánt irányban, ill. a reakciót teljessé tenni. Vigyázni kell az enzimreakciók fajlagosságára. Enzimes szennyezés (idegen aktivitás) nem kívánt mellékreakciót okoz, de lehet a nem túl szigorú fajlagosság miatt a tiszta enzimnek is más szubsztrátumra ható mellék-aktivitása A z enzimaktivitás mérése. Az enzimaktivitás mérésekor - a szubsztrátum-meghatározással ellentétben - nagy szubsztrátum-koncentrációt, lehetőleg szubsztrát-telítettséget biztosítunk. dt (3) Az enzimkoncentrációt úgy kell beállítani, hogy a reakció lassú legyen, a szubsztrátumnak csak kis hányada alakuljon át. A reakció fotométeres követésekor extinkcióváltozást mérünk. Ha a változás lineáris, a mérési intervallumok tetszés szerint választhatók meg. Ha az átalakulás az időben görbe mentén játszódik le, rövid időközönként kell a mérést végezni. Az enzimes reakciók sebessége erősen függ a hőmérséklettől; a hőmérsékletkoefficiens s 0%/fok is lehet, azaz C különbség könnyen okozhat 0% eltérést. b Itt is érvényes a: log К = а (4) összefüggés, К azonos a V m a x = к [E] kifejezésben szereplő arányossági tényezővel. Tehát nagyon fontos a hőmérséklet pontos betartása, az átszámítási tényezők használatával óvatosan kell bánni. Az enzimek ph-optimuma függ a puffer minőségétől, az ionerősségtől, továbbá a hőmérséklettől és a szubsztrátum-koncentrációtól. Az optimális szubsztrátum-koncentráció meghatározására rendszerint v-t ábrázolják [S] függvényében. A legjobban használható a Lineweaver-Burk módszer (. ábra), mellyel a K m és V m ax egyaránt meghatározható. 6

6 Км 3. ábra,\ gátlás típusának m eghatározása Lineweaver és Burk (4) szerin t.--= nem gátolt reakció; = különböző inhibitor-koncentrációkkal gátolt reakciók. A jelölések, mint az. ábrán: K g = az ES enzim szubsztrá um komplex disszociációs állandója, a) a gátlás kom petitiv, a tengelym etszet az ordinátán = ;az abszcisszán a nem gátolt reakciók esetében = Vm ax K m a gátolt reakciók esetében = ~ ~ ]/K )' ^ ^ gátlás nem kom petitiv: a tengelym etszet,, KM ( + [I az abszcisszán = = az ordinátán a nem gátolt reakció esetében =, a gátolt К м К s ; v m ax +Ш/К/ reakciók esetében. c) A gátlás versengőtlen: a tengelym etszetek az ordinátán, ill. az abszcisszán a nem gátolt reakció esetében V, ill., a g áto lt reakciók esetében m ax Km + Ш /К / + [I]/K / v, i. v m ax K m A V m a x akkor közelíthető meg, ha a K m elhanyagolhatóan kicsi a szubsztrátumkoncentrációhoz képest. Ha az elfogadható hiba szerint akarjuk megválasztani, Michaelis és Menten egyenletét átalakítjuk: [ S ] = v K m V m ax V (5) 62

7 На % az eltérés a Vmax-tól, v = 0,99, S = 99 Km, ha 2% az eltérés a Vmax-tól, S = 49 K,n. A nagy szubsztrátum-felesleg sokszor azért nem érhető el, mert gátol, vagy a szubsztrátum oldhatósága nem elég nagy. Az aktivitás meghatározásakor figyelembe kell venni az esetleges aktívátorok vagy inhibitorok jelenlétét is. Szintetikus szubsztrátumok gyakran gyorsabban alakulnak át, mint a természetesek Mérés kapcsolt reakcióval. Enzimes átalakítás esetében előfordul, hogy a termék nem mérhető közvetlenül kémiai vagy fizikai módszerrel, de egy másik enzim okozta átalakulás szubsztrátumának vagy termékének meghatározásával igen. Az átalakító folyamat a segéd-reakció, a mérési folyamat az indikátor-reakció. A gyakoribb eset az indikátor-reakciónak a segédreakció után kapcsolása. Pl. Sj szubsztrátum meghatározása esetén: E s Sx + S * P! + P2 (segédreakcio) Rx+ P Qx+ Q2 (indikátorreakció) Meghatározandó R^ Qt vagy Q mennyisége. Az előre kapcsolt reakcióban Е / M + N S2 Es, Sx + S, P i + P 2 (7) Meghatározandó M, N vagy О értéke. Ilyen pl. a glükóz meghatározása, amelyben a hexokináz a segéd-enzim: Es glükóz + ATP *- ADP + G-6-P G 6 - P - dehidrogenáz G 6-P + NADP P G + NADPH + H + ahol ATP ADP NADP + NADPH G-6-P 6-PG adenozin-trifoszfát adenozin-difoszfát oxidált nikotinamid-dinukleotid-foszfát redukált nikotinamid-dinukleotid-foszfát glükóz-6-foszfát 6-foszfoglukonát. Több segédreakció is lehetséges, melyet indikátor-reakció ki tud szolgálni A z inhibició meghatározása. Az inhibitorok vagy a Km értékét növelik látszólag (kompetitiv gátlás), vagy a Vmax értékét csökkentik (nem kompetitiv gátlás), esetleg mindkettőt megváltoztatják (versengőtlen gátlás). (8) (9) 63

8 4. ábra. A gátlás típ u sán ak m eghatározása Dixon (6) szerint. A jelölések, m int az 7. és 3. ábrán a) A gátlás kom petitiv: a különböző inhibitorkoncentrációkhoz tartozó egyenesek m etszéspont- jának ordináta-értéke = ~\7, abszcissza-értéke = К /. b) A gátlásnem ko m p etitiv :atengely - v m ax m etszet az ordinátán = ~ :7,, az abszcisszán = -К/. c) A gátlás versengőtlen: a tengelym ax m etszet az ordinátán, ill. az abszcisszán a nem gátolt reakció esetében + K S /[S], to lt reakciók esetében у ---- ill. K /(l + K s/[s ])., ill. K r, a gáv m ax A kinetikai összefüggéseket leíró képletekbe inhibició esetén egy [I] tag kerül be, ahol [I] az inhibitor-koncentráció. K; az inhibitor-állandó, az El komplex disszociációs állandója. Kompetitiv inhibició esetén: Vmax [S] [S ] + K m, ill. (20) 64

9 Ч +-& -) (2) V Vmax [S] Vmax Nem kompetitiv inhibició esetén: Vmax [S] I +, ill. [S] + K s к S Vmax [S] l [I] К / ) Vmax v К / ) (22) (23) Az inhibició típusa egy-szubsztrátumos reakció esetében meghatározható Lineweaver és Виг к (4) szerint úgy, hogy azonos inhibitorkoncentrációt alkalmazva, különböző szubsztrátum-koncentrációkkal mérjük a reakció sebességét. Minden szubsztrátum-koncentrációra egy-egy egyenest kapunk, melyek dőlésszöge eltér. Kompetitiv gátlás esetében az ordinátán metszik egymást, nem kompetitiv gátlás esetén az abszcisszán ( 3/a, b ábra). Versengőtlen gátlás esetében: V Vmax [S] Vmax A különböző inhibitor-koncentrációk esetében Lineweaver Burk szerint ábrázolt egyenesek nem metszik egymást (3/c. ábra). Ha behelyettesítjük,, Km és Vmax, valamint [I] értékét, К / kiszámít- S v ható. Dimenziója mól dm-3. Kényelmesebb a meghatározás Dixon (6) szerint: különféle konstans [S] érté- kék és változó [I] mellett mérjük v-t, -t pedig [I] függvényében ábrázoljuk. v Kompetitiv inhibició esetén az egyes szubsztrátum-koncentrációkra kapott egye- nesek a koordináta-rendszer 2. negyedében metszik egymást, magasságában Vmax (4/a ábra). Nem kompetitiv inhibició esetén a metszéspont a negatív abszcisszán van (4/b ábra), versengőtlen gátlás esetén az egyenesek párhuzamosak (4/c ábra). A metszéspont negatív abszcissza-értéke а К /, [I] = К /. Ha az inhibició típusa ismert, К / meghatározására elég egyenest felvenni. Közleményünk 2. és 3. részében az állati és növényi élelmiszerek vizsgálatában alkalmazott fontosabb enzimes analitikai eljárásokat fogjuk ismertetni, a teljesség igénye nélkül. 65

10 IRODALOM () Stetter H.: Enzymatische Analyse. Verlag Chemie, GmbH, W einheim /Bergstrasse, 952. (2) Michaelis, L., Menten, M. L.: Biochem. Z., 49, 333, 93. (3) Briggs, G. E., Haldane, J. B.: Biochem. J., 9, 338, 925. (4) Lineweaver, H., Burk, D.: J. Amer. Chem. Soc., 56, 658, 934. (5) Hofstee, B. H. J.: N ature, 84, 296, 959. (6) Dixon, M.: Biochem. J., 55, 70, 953. HAZAI LAPSZEMLE Összeállította: Kacskovics Miklós Ferenczi S., Érczhegyi L.: Pektinbontó enzimek borászati alkalmazása. Borgazdaság. 26, 45, 978. Tóth M.: Auto Analyzer néhány alkalmazási módszere a söripar analitikában. Söripar, 25, 55, 978. Oláh L.-né, Török S.: A kékderítés hatásának vizsgálata. Borgazdaság. 26, 50, 978. Kálmán B., Kiss /., Farkas J.: Félüzemi kísérletek a vöröshagyma kihajtásának gátlására, ionizáló sugárzással. Konzerv- és Paprikaipar. 26, 2, 978. Rak l.-né Vukov K.: Kombinált enzimkezelés hatása almazúzalék viszkozitására. Konzerv- és Paprikaipar. 26, 7, 978. Körmendу L., Erdős L.: A szórás értelmezésének kérdése húsipari nyersanyagoknál és késztermékeknél. Húsipar. 27, 80, 978. Bende E., Six L., Szabolcs L.: Érzékszervi bírálatok minősítése ízlelő-, szagló- és színlátóképességük alapján. Élelmezési ipar. 32, 69, 978. Kölesei M., Prágai /., Lukács P., Kardos F.: NEVIROL készítményekkel végzett biológiai-hatástani vizsgálatok repülőgépes alkalmazástechnológiai kidolgozása. Olaj, szappan, kozmetika, 27, 39, 978. Hopkó l.-né, Varjasy G.-né: Az édesipari nyersanyagok radiológiai vizsgálata. Édesipar. 29, 80, 978. Kiss L: Az ionizáló sugárzás alkalmazási lehetősége és sugárforrásigénye az élelmiszeriparban és a mezőgazdaságban. Izotóptechnika. 2, 39, 978. Nemeshegyi G., Hadnagy A., Tombor A.-né, Zentai Gy.: Porpúderok szemcseméretének és szemcseméret-eloszlásának hatása a késztermék színére II. Olaj, Szappan, Kozmetika. 27, 83, 978. Deák T., Fábri /., Vajda Ö.: A növényi élelmiszerek mikrobiológiai módszereinek egységesítése. Szabványosítás. 30., 274, 978. Ruip J., Gantner Gy., Rédey Z., Körmendy L., Mihályi Gy.-né: Á nátriumkazeinát és a szójafehérje hatása a húspépek vizkötő képességére. Húsipar, 27, 80, 978. Magyar К.-né: Cukoripari levek élesztőcsíraszámának gyors meghatározása rezazurin próbával. Cukoripar, 3, 39, 978. László Á., Varjú M., Ferenczi S.: Az alumínium mennyisége és változása tokaji borokban. Borgazdaság, 26, 97, 978. Molnár L, Lukács Gy.: A borok színének objektív meghatározása. Borgazdaság, 26, 0, 978. Mérő Gy.-né: Konzervipari zöldségés gyümölcsfélék radioaktív szennyezettségének és a technológiai folyamatok hatásának vizsgálata. Élelmezési Ipar, 32, 295,