PASTOREX STAPH-PLUS 1 x x Latex Agglutinációs Teszt Staphylococcus Aureus Identifikálásához

Átírás

1 PASTOREX STAPH-PLUS 1 x x Latex Agglutinációs Teszt Staphylococcus Aureus Identifikálásához /01 1- FELHASZNÁLÁS A PASTOREX STAPH-PLUS lemez agglutinációs gyorsteszt a fibrinogén aktivitás (clumping factor), a protein A és a Staphylococcus aureus tok poliszacharidjainak egyidejű kimutatásához. 2- ÖSSZEFOGLALÁS ÉS ISMERTETÉS A Staphylococcus aureus egyike a betegmintákban leggyakrabban előforduló kórokozóknak. A megfelelő betegellátásban nagyon fontos, hogy gyorsan különbséget tudjunk tenni e species és más, kevésbé virulens staphylococcusok között. A szabad koaguláz kimutatására szolgáló teszttel identifikálni lehet a Staphylococcus aureus-t (11, 12). Ez a vizsgálat azonban 4 24 órát vesz igénybe, és a felhasznált plazma változhat a gyártási sorozattól függően, ami befolyásolhatja a reakciót (16). Ezért agglutinációs reagenseket fejlesztettünk ki, amelyek gyorsabban és megbízhatóbban detektálják a Staphylococcus aureus-t (3). Ezek az agglutinációs tesztek fibrinogénnel és IgG-vel szenzitizált latexet használnak a clumping factor és a protein A kimutatásához, amelyek a S. aureus biokémiai jellemzői. Mindazonáltal megfigyelték, hogy a Staphylococcus aureus egyes törzsei (szükségképpen methicillin-rezisztens törzsek) nem mutatnak agglutinációt ezekben a tesztekben (15). Ezeknek a törzseknek a vizsgálata kimutatta, hogy mindegyiküknek poliszacharid tokja van (4). Ezért feltehető, hogy a bizonyos körülmények között (betegminták, izolálás és bakteriális klón) a baktériumot beburkoló poliszacharid tok elfedi a protein A-t és a clumping factort, s ezzel megakadályozza, hogy a csak fibrinogénnel és IgG-vel szenzitizált latex részecskék agglutinálódjanak. 3- ALAPELV A PASTOREX STAPH-PLUS lehetővé teszi, hogy egyszerre detektáljuk az alábbi komponenseket: 1) a fibrinogén affinitási faktort, amelyet kötött koaguláznak vagy clumping factor -nak is neveznek, 2) a protein A-t, amely affinitást mutat a gamma immunglobulinok (IgG-k) Fc fragmentumához, és 3) a Staphylococcus aureus kapszuláris poliszacharidjait. A reagenst fibrinogénnel, IgG-vel és specifikus, a S. aureus tokpoliszacharidjai ellen készített monoklonális antitestekkel (Pasteur Intézet szabadalma) szenzitizált latex részecskékből készítjük (1, 5, 6, 8, 10). Azzal, hogy egyetlen reagensben kombináltuk a fibrinogént, az IgG-t és a tokellenes monoklonális antitesteket, a Staphylococcus aureus egészen vastag tokkal ellátott, vagy a csaknem tok nélküli törzseit is felismerhetjük. A vastag tokot fejlesztő törzsek esetében a tok poliszacharidja ellen készített antitestek agglutinálják a baktériumokat, a poliszacharid tokjukat elveszített törzseknél pedig a fibrinogén és az IgG. A tenyészetből izolált Staphylococcus aureus-t egy lemezen összekeverjük a latex reagenssel. Ezután megnézzük, hogy jelentkezett-e agglutináció. Ha igen, az Staphylococcus aureus jelenlétére utal. 4- KISZERELÉS 1. PASTOREX STAPH-PLUS, 50 tesztet tartalmazó kit, kódszám: Latex teszt: 1 cseppentősüveg 1 ml piros borjúalbuminnal, fibrinogénnel, IgG-vel és a Staphylococcus aureus poliszacharid tokantigénje elleni monoklonális antitesttel szenzitizált latex. Tartósítószer: <1.5 % ProClin 300 Negatív kontroll: 1 cseppentősüveg 1 ml, borjúalbuminnal szenzitizált, piros latexet tartalmazó negatív kontroll. Tartósítószer : <1.5 % ProClin egyszerhasználatos agglutinációs lemez. 150 db keverőpálca 2. PASTOREX STAPH-PLUS, 5 x 50 tesztet tartalmazó kit kódszám: Latex teszt: 5 db 1ml-es cseppentősüveg tesztreagens. Negatív kontroll: 5 db 1 ml-es cseppentősüveg negatív kontroll reagens. 4 x 16 db egyszerhasználatos agglutinációs lemez. 300 db keverőpálca. 1

2 5- TÁROLÁS A +2-8 C között tárolt, mikrobiális szennyeződéstől védett reagensek a címkén feltüntetett szavatossági ideig stabilak a felbontás után. Függőleges helyzetben tároljuk a latex reagenst tartalmazó üvegeket. A LATEX REAGENSEKET NEM SZABAD LEFAGYASZTANI. 6- SZÜKSÉGES, DE NEM SZÁLLÍTOTT ANYAGOK Oltókacsok a baktériumtelepek gyűjtéséhez Fertőtlenítő tartály vagy autoklávozható zsák az elhasznált lemezek gyűjtéséhez. 7- KEZELÉSI ELŐÍRÁSOK A Pastorex Staph-Plus kit kizárólag tenyészetek vizsgálatához készült: nem használható közvetlenül a betegmintákon. Az eredmények minősége azon múlik, hogy betartjuk-e a GLP ajánlásokat. Az összes reagenst és a mintát szobahőmérsékleten kell felhasználni (18-30 C). Ne érjünk hozzá az agglutinációs lemez felületéhez. Használat előtt rázzuk fel a latexes üvegeket. A reagenst tartalmazó cseppentősüvegek hegyét töröljük le, hogy kalibrált nagyságú cseppeket kapjunk. A cseppek elhelyezésekor tartsuk függőleges helyzetben az üvegeket. A latex reagens és a baktériumtelepek elkeveréséhez használjuk a kittel szállított műanyag keverőpálcákat. Ne használjunk fapálcát. Minden újabb reakcióhoz váltsunk keverőpálcát. Az összes elhasznált anyagot autoklávozható tartályba vagy fertőtlenítő fürdőbe dobjuk le. MUNKAVÉDELMI ELŐÍRÁSOK Mindig tartsuk be a mikrobiológiai veszélyforrások elleni védelemre vonatkozó aktuális kezelési, munkavédelmi és ártalmatlanítási előírásokat. Figyelmeztetés: Ezek a reagensek ProClin 300 < 1.5% tartalmaznak. A tesztben fellelhető egyes kémiai összetevők kockázati és óvintézkedési ajánlásaihoz tekintse át a címkéken biztosított képjelzést (képjelzéseket) és a használati utasítás végén adott tájékoztatást. A biztonsági adatlap a következő címen érhető el: 8- HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ 1) A MINTÁK ELŐKÉSZÍTÉSE A kithez használt mintáknak tiszta és friss tenyészetekből kell származniuk. A javasolt izoláló, vagy egyéb közegek: Agar táptalajok Trypto-kazein-szója agar Columbia agar + birkavér Columbia agar Véres agar Mannitol sós agar Baird-Parker közeg adalékokkal MRSASelect A kitenyésztett mikroorganizmusokat fessük meg Gram szerint és vizsgáljuk meg katalázra. A Pastorex Staph-Plus reagenssel vizsgált telepeknek Gram pozitív, kataláz pozitív coccusoknak kell lenniük. 2) AGGLUTINÁCIÓS REAKCIÓ Rázással alaposan homogenizáljuk a latex reagenseket. Szükség esetén keverjük fel vortex keverővel. Cseppentsünk 1 cseppnyi latex reagenst az agglutinációs lemez egyik körébe. Cseppentsünk egy cseppnyi negatív kontroll latex reagenst egy másik körbe. Egy kaccsal vagy múanyag pálcával vegyünk ki 1 3 Gram pozitív, kataláz pozitív telepet és emulgeáljuk 10 másodpercig az egy csepp latexben. Ismételjük meg a 4. lépést a negatív kontroll latexre is. Vízszintesen forgató mozdulattal homogenizáljuk a lemez tartalmát. Az eredményeket a forgatás megkezdésétől számított 30 másodpercen belül le kell olvasni. Értékeljük ki az eredményt az alábbi kritériumok szerint, majd dobjuk a lemezt fertőtlenítő tartályba. Ne használjuk föl még egyszer a lemezt. 2

3 9- AZ EREDMÉNYEK KIÉRTÉKELÉSE POZITÍV REAKCIÓ A pozitív reakciót az jelzi, ha csak a tesztreagenssel képződnek aggregátumok, amelyek szabad szemmel is láthatók normál megvilágítás mellett, s 30 másodpercen belül megjelennek onnantól kezdve, hogy elkezdtük forgatni a lemezt. Az összecsapzódott latex aggregátumok mérete különböző lehet, többé-kevésbé ködszerű, rózsaszín háttér előtt. Lassú és gyenge agglutináció nem specifikus agglutinációt jelenthet. NEGATÍV REAKCIÓ Negatív reakció esetén a szuszpenzióban nem keletkeznek aggregátumok, a szuszpenzió tejszerű megjelenése változatlan marad. ÉRTELMEZHETETLEN REAKCIÓ Az értelmezhetetlen reakciót az jelenti, ha a szuszpenzió agglutinál a negatív kontrollal. Ekkor egy másik módszert válasszunk az identifikáláshoz, például keressünk szabad koagulázt, vagy hőstabil DNázt. 10- A TESZT MINŐSÉGÉNEK ELLENŐRZÉSE Minden alkalommal, amikor használjuk a latexet, nézzük meg, hogy tapasztalunk-e agglutinációt, amikor a lemezre cseppentjük a reagenst. A latexet időnként meg kell vizsgálni korábban már identifikált Staphylococcus aureus és Staphylococcus epidermidis törzsekkel. A latex tesztreagensnek agglutinációt kell produkálnia a Staphylococcus aureus-szal és nem szabad reagálnia a Staphylococcus epidermidis-szel. A negatív kontrollnak nem szabad agglutinációt produkálnia egyik baktériummal sem. 11- A GYÁRTÓNÁL FOLYÓ MINŐSÉGELLENŐRZÉS Az összes termékünk a saját minőségellenőrző rendszerünk szerint készült, a nyersanyag átvételétől kezdve a termék forgalmazásáig. Minden egyes gyártási sorozat minőségét ellenőrizzük, és csak akkor hozzuk forgalomba, ha az megfelel az előre felállított kritériumoknak. Minden sorozat gyártási és minőségellenőrzési jegyzőkönyve megtalálható a Bio-Radnál. 12- MEGBÍZHATÓSÁG A PASTOREX STAPH-PLUS megbízhatóságát több különböző laboratóriumban is felmérték (2, 13, 14). Összesen 440 S. aureus törzset és 138 egyéb staphylococcust vizsgáltak a kittel. A tenyészeteket Gram-festéssel, kataláz aktivitás vizsgálatával és a koaguláz csőpróbával identifikálták. A nem egyező mintákat később biokémiai vizsgálatoknak, és egy kereskedelmi forgalomban lévő, alternatív gyorstesztnek vetették alá. A S. aureus törzsek methicillin érzékenységét is ellenőrizték. Az methicillin-rezisztens S. aureus (MRSA) és a methicillinre érzékeny S. aureus (MSSA) érzékenységi vizsgálatainak eredményei, valamint az összesítő eredmények az 1. táblázatban olvashatók. A S. aureus-tól eltérő egyéb staphylococcus törzsek specificitási vizsgálatainak eredményét a 2. táblázat tünteti fel. 1. táblázat Pastorex STAPH-PLUS eredmények MRSA és MSSA izolátumokkal Összes Pozitív Negatív Relatív érzékenység SARM SASM S. aureus összesen * egy értelmezhetetlen eredményt kizártak 217 * % % 439 * % Methicillin-rezisztens S. aureus Az 1. táblázat szerint 217 jól definiálható MRSA izolátumból 217-et lehetett pontosan identifikálni a PASTOREX STAPH- PLUS kittel. A PASTOREX STAPH-PLUS érzékenysége az MRSA-ra 100%-ra volt tehető, ha kizárjuk az értelmezhetetlen eredményeket, amelyek a vizsgált törzsek 0,4%-át érintették. Methicillinre érzékeny S. aureus Az 1. táblázat szerint a 222 kitenyésztett MSSA izolátum mindegyike pozitív eredményt adott a PASTOREX STAPH-PLUS kittel. Az MSSA populációval kapott érzékenység 100%-os volt. 3

4 Egyéb staphylococcusok 2. táblázat A PASTOREX STAPH-PLUS eredményei egyéb staphylococcus törzsekkel Összes Pozitív Negatív Relatív specificitás Egyéb staphylococcus törzsek % 138 nem S. aureus, hanem más staphylococcus izolátumot, köztük S. epidermidis-t, S. haemolyticus-t, S. hominis-t, S. saprophyticus-t, S. schleiferi-t, S. lugdunensis-t, és még más fajokat is vizsgáltak a PASTOREX STAPH-PLUS-szal. A 138 izolátumból 137-re kaptak negatív eredményt, amint azt a 2. táblázat mutatja. Az eltérő eredményt S. lugdunensis-ként azonosították, és alternatív gyorsteszttel vizsgálva is pozitívnak bizonyult. 13- AZ ALKALMAZÁS KORLÁTAI A beszámolók szerint a Staphylococcus lugdunensis és a Staphylococcus schleiferi fibrinogén affinitási faktorral rendelkezik (7, 9) és reagálhat a clumping factorhoz készült teszttel a törzstől és az izoláló közegtől függően. Mivel közismert, hogy a staphylococcus egyes törzsei, külünösen a Staphylococcus saprophyticus, a latex szemcsék nem specifikus aggregációját okozzák, célszerű a kittel szállított kontroll latexet minden vizsgált mikroorganizmus fajtához felhasználni. Az állatgyógyászati gyakorlatban előforduló, de emberben ritkán izolált Staphylococcus intermedius és Staphylococcus hyicus pozitív reakciót idézhet elő a klasszikus koaguláz tesztekkel, ezért elméletileg reagálhat a fibrinogén affinitási faktort detektáló teszttel is. Nem szabad elfelejtkeznünk a keresztreakciók lehetőségéről sem. Egyes streptococcusokban van olyan fehérjéje, amely affinitást mutat az immunglobulinok Fc fragmentumához, ezért reagálhat a latex-szel. A latex technikák aspecifikus reakcióiról is készültek már beszámolók több faj, például az Escherichia coli és a Candida albicans esetében (17). Javasoljuk, hogy Gramfestéssel és kataláz teszttel vizsgálják meg a telepeket a latex teszt alkalmazása előtt. Álnegatív eredményeket kaphatunk, ha az izolált Staphylococcus aureus nem termel fibrinogén affinitási faktort (clumping factort), protein A-t vagy olyan tok poliszacharidokat, amelyek ellen a specifikus monoklonális antitestek készültek. Álnegatív eredmények akkor is előfordulhatnak, ha kevés inokulumot használtunk. 14- HIVATKOZÁSOK 1. Boutonnier A., Nato F., Bouvet A., Lebrun L., Audurier A., Mazie J.C., and Fournier J.M. Direct testing of blood cultures for detection of the serotype 5 and 8 capsular polysaccharides of Staphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol : Davies S. Detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus: the evaluation of rapid agglutination methods, Br. J. Biomed. Sci., 1997, 54: Esserts I., and Radebold K. Rapid and reliable identification of Staphylococcus aureus by a latex agglutination test. J. Clin. Microbiol Fournier J.M., Boutonnier A., and Bouvet A. Staphylococcus aureus strains which are not identified by rapid agglutination methods are of capsular serotype 5. J. Clin. Microbiol : Fournier J.M., Bouvet A., Boutonnier A., Audurier A., Goldstein F., Pierre J., Bure A., Lebrun L., and Hochkeppel H.K. Predominance of capsular polysaccharide type 5 among oxacillin-resistant Staphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol : Fournier J.M., Hannon K., Moreau M., Karakawa W.W., and Vann W.F. Isolation of type 5 capsular polysaccharide from Staphylococcus aureus. Ann. Inst. Pasteur/Microbiol : Freney J., Brun Y., Bes M., Meugnier H., Grimont F., Grimont P.A.D., Nervi C., and Fleurette J. Staphylococcus lugdunensis sp. No. and Staphylococcus schleifer sp. Nov., two species form human clinical specimen. J. Clin. Microbiol : Hochkeppel H.K., Braun D.G., Vischer W., Imm A., Sutter S., Staeubli U., Guggenheim R., Kaplan E.L., Boutonnier A., and Fournier J.M. Serotyping and electron microscopy studies of Staphylococcus aureus clinical isolates with monoclonal antibodies to capsular polysaccharide types 5 and 8. J. Clin. Microbiol : Jean Pierre H., Darbas H., Jean-Roussenq A., and Boyer G. Pathogenicity in T cases of Staphylococcus schleiferi, a recently described species. 10. Karakawa W.W., Fournier J.M., Vann W.F., Arbeit R., Schneerson, R.S. and Robbins. J.B. Method for the serological typing of the capsular polysaccharides of Staphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol., 1985, 22: Kloos W.E. and Lambe D.W. (1991). Staphylococcus Manual of Clinical Microbiology, 5th Ed. Edited by Balows A., Hausler W.J., Herrmann K.L., Isenberg H.D., and Shadomy J.J. American Society for Microbiology, Washington, D.C., Pages Kloos W.E., and Scleifer K.H. Staphylococcus Bergeyís manual of systematic bacteriology. 1986, vol. 2, Luijendijk AD., Alex van Belkum, Verbrugh H., and Kluytmans J. Comparison of Five Tests for Identification of Staphylococcus aureus from Clinical Samples. J. Clin. Microbiol., 1996, 34: Neher C., Allerberger F., Prodinger W. Dierich M.P., Evaluation of commercially available agglutination tests for methicillinresistant. 8 th ECCMID Congress, Lausanne,

5 15. Ruane P.J., Morgan M.A., Citron D.M., and Mulligan M.E. Failure of rapid agglutination methods to detect oxacillin-resistant Staphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol : Selepack S.T., and Witebsky F.G. Inoculum size and lot-to-lot variation as significant variables in the tube coagulase test for Staphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol., 1985, 22: Kronvall G. A Surface Component in Group A, C, and G Streptococci with Non-Immune Reactivity for Immunoglobulin G. J. Immunology., 1973, vol.11,

6 6

7 Distributed in the USA by Bio-Rad Laboratories Diagnostics Group th Avenue N.E. Redmond, WA For Customer Orders Call : BIORAD For Technical Service Call : BIORAD ( ) Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) /01 Fax : +33 (0)