SEMMELWEIS EGYETEM GYÓGYSZERTUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA

Átírás

1 TARTALOMJEGYZÉK SEMMELWEIS EGYETEM GYÓGYSZERTUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA A bilirubin konjugációjának és a konjugátumok transzport folyamatainak tanulmányozása primer kollagén szendvics és hagyományos rigid májsejt kultúrában Doktori (Ph.D.) értekezés Lengyel György Témavezetők: Dr. Vereczkey László D.Sc.; Jemnitz Katalin Ph.D. Szigorlati Bizottság Elnöke: prof. Dr. Magyar Kálmán, akadémikus Szigorlati Bizottság Tagjai: Dr. Bánhegyi Gábor D.Sc., Dr. Tihanyi Károly, a biológia tudományok kandidátusa Hivatalos Bírálók: Dr. Bánhegyi Gábor D.Sc., Dr. Tihanyi Károly, a biológia tudományok kandidátusa MAGYAR TUDOMÁNYOS AKADÉMIA KÉMIAI KUTATÓKÖZPONT, BIOMOLEKULÁRIS KÉMIAI INTÉZET FARMAKOBIOKÉMIAI OSZTÁLY Budapest,

2 TARTALOMJEGYZÉK TARTALOMJEGYZÉK 1 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE BEVEZETÉS A máj szerepe a metabolizmusban, Drog transzport proteinek szerepe az endogén és exogén anyagok metabolizmusában A bilirubin metabolizmusa A kolesztázis Gyakran alkalmazott in vitro módszerek a transzport aktivitás meghatározására CÉLKITŰZÉSEK KÍSÉRLETI MÓDSZEREK Vegyszerek Májsejt preparálás Mikroszóma preparálás UGT1A1 aktivitás meghatározása mikroszómában A BG meghatározása primer hepatocita rigid kultúrában Indukciós vizsgálatok primer hepatocita rigid kultúrában Western immunoblot analízis A BG és PNP-G mennyiségi meghatározása HPLC analízissel A BMG és BDG tömegspektrometriás azonosítása Primer hepatocita szendvics kultúra A BG és PNP-G szinuszoidális és kanalikuláris effluxának meghatározása primer hepatocita szendvics kultúrában Indukciós vizsgálatok primer hepatocita szendvics kultúrában MRP2 és MRP3 proteinek gátlásának vizsgálata hepatocita szendvics kultúrában CDF-DA kanalikuláris felhalmozódásának vizsgálata konfokális pásztázó lézer mikroszkóp segítségével Vezikuláris transzport kísérletek Statisztika A vizsgalataink során alkalmazott modell vegyületek szerkezete EREDMÉNYEK A bilirubin-glukuronidok HPLC analízise és azonosítása Bilirubin konjugáció primer patkány hepatocita kultúrában Enziminduktorok hatása a bilirubin konjugációjára primer patkány hepatocita kultúrában In vitro epevezető rendszer kialakulása és feltárása primer patkány hepatocita szendvics kultúrában A BG és pnpg biliáris efflux indexének meghatározása patkány és humán hepatocita szendvics kultúrában

3 TARTALOMJEGYZÉK 5.6 A szinuszoidális és a kanalikuláris membránon történő BG efflux BDG/BMG aránya 96 órás patkány és humán hepatocita szendvics kultúrában A szinuszoidális BDG/BMG arány változása a humán és patkány májsejtkultúra korának függvényében A BDG/BMG arány alakulása humán és patkány mikroszóma frakcióban Összehasonlító indukciós vizsgálat primer patkány hepatocita rigid és szendvics kultúrában Induktorok hatása a BG szinuszoidális és kanalikuláris effluxára patkány hepatocita szendvics kultúrában Gátlószerek hatása a BG kanalikuláris és szinuszoidális effluxára patkány hepatocita szendvics kultúrában Gátlószerek hatása az 5(6)-karboxi-2',7'-diklórfluoreszcein-diacetát (CDF-DA) kanalikuláris akkumulációjára Gátlószerek hatása a 3 H-estradiol-17β-D-glukuronid ( 3 H-E 2 17βG) MRP2,3 mediált transzportjára kifordított membrán vezikulákon Eredmények összefoglalása MEGBESZÉLÉS ÖSSZEFOGLALÁS SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS IRODALOMJEGYZÉK

4 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE 1 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE 3 H-E 2 17βG 3 H-estradiol-17β-D-glukuronid A ABC AhR ASBT BB BCRP BDG BDL BG BL BMG BRIC BSEP BSP CAR CL cmoat CSA DEX DMSO EBSS EGTA ER FIC1 FTF FXR GR HBSS HCC IM LXR Apikális pólus ATP Binding Cassette Aromás szénhidrogén receptor Apikális epesó transzporter Benzbromaron Mellrák rezisztencia protein Bilirubin-diglukuronid Epevezető lekötés Bilirubin-glukuronid Bazolaterális pólus Bilirubin-monoglukuronid Benign Recurrent Intrahepatic Cholestasis Epesó export pumpa Brómszulfoftalein Konstitutív androsztán receptor Klofibrát Kanalikuláris multispecifikus organikus anion transzporter Ciklosporin A Dexametazon Dimetil-szulfoxid Earle s Balanced Salt Solution Etilénglikol-bisz-(amino-etiléter)-tetraacetát Endoplazmatikus retikulum Familiáris intrahepatikus kolesztázis Fetoprotein transzkripciós faktor Farnezoid X receptor Glukokortikoid receptor Hank s Balanced Salt Solution Hepatocelluláris karcinóma Indometacin Liver X receptor - 5 -

5 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE MC MDR MOPS MRP NSAID NTCP OATP OCT PB PBS PFIC P-GP PNP-G PPARα PR PSC PXR Q-víz RARα RIF rpm SHP-1 SLC SPGP T3 TRIS UDCA UGT VBDS XRE Metilkolantrén Multidrog rezisztencia protein 3-(N-morfolinó)-propánszulfonsav Multidrog rezisztencia kapcsolt protein Nem szteroid gyulladáscsökkentők Na + -taurokolát kotranszporter Organikus anion transzport protein Organikus kation transzporter Fenobarbitál Phosphate Balanced Salt Solution Progresszív familiáris intrahepatikus kolesztázis P-glikoprotein Para-nitrofenol-glukuronid Peroxiszóma proliferátor aktivált receptor α Probenecid Primer szklerotizáló kolangitisz Pregnán X receptor Millipore Ultra-Pure Water System Purification Pak (MilliQ) Retinolsav receptor Rifampicin fordulat/perc Kis heterodimer partner Membrane Solute Carriers Testvér p-glikoprotein Tiroxin Tri(hidroxi-metil)-metilamin Urszodeoxitaurokolsav UDP-glukuronozil-transzferáz Vanishing Bile Duct Syndrome Xenobiotic Responsive Element - 6 -

6 BEVEZETÉS 2 BEVEZETÉS 2.1 A máj szerepe a metabolizmusban 1,2 A máj központi szerepet játszik az endogén és exogén anyagok metabolizmusában. A szervezetbe került idegen anyagok és feleslegessé vált endogén molekulák a szisztémás vérkeringés útján többnyire albuminhoz kötve jutnak el a májhoz. 1. ábra A májlebenyke szerkezete 1 (A) pásztázó elektronmikroszkópos felvétel, periférián a szinuszoidok, középen a centrális véna látható; (B) fénymikroszkópos felvétel a szinuszoidok egy részletéről, középen egy az epitéllel érintkező vörös vértesttel; (C) a máj sematikus szerkezete. A máj szerkezetére jellemző, hogy a vér az átlyuggatott felszínű endotél sejtekkel borított szinuszoidokban áramlik (1/A, 1/B ábra), ennek köszönhetően a molekulák könnyen diffundálnak a májsejtek felszínéhez. A hatszögletű májlebenyke a máj szerkezeti és funkcionális egysége, melyben a polarizált májsejtek úgy helyezkednek el, hogy bazolaterális (szinuszoidális) membránjuk a szinuszoidok felé, míg apikális (kanalikuláris) membránjuk az epevezető felé néz. A két membrán eltérő típusú transzporter rendszerrel rendelkezik, mely lehetővé teszi az epeszekréció megvalósulását (1/C ábra). A szinuszoidális membránban uptake proteinek foglalnak helyet, melyek feladata a metabolizálandó anyagok felvétele a májsejtekbe, majd a felvétel után a molekulák vagy változatlan formában ürülnek az epével, vagy pedig metabolizmus útján átalakulnak polárosabb, vízoldékonyabb anyagokká. A gyógyszerek biotranszformációjának leggyakoribb formája az oxidáció. A fázis I folyamatok közé tartozik például az endoplazmatikus retikulumban zajló mikroszómális oxidáció, melyet a citokróm P-450 enzimek katalizálnak. A mikroszómális monooxigenáz-rendszeren kívül az oxidatív fázis I folyamatokban részt vesznek más nem - 7 -

7 BEVEZETÉS mikroszómális enzimek, például az alkohol-dehidrogenáz vagy az aldehid-oxidáz. A fázis II folyamatok főként a fázis I során keletkezett kevésbé poláris metabolitok vízoldhatóságát fokozzák poláris kis molekulák (glukuronsav, szulfát csoport, glutation) konjugációjával. A fázis I és fázis II folyamatok lezajlása után a metabolitok molekulatömegtől függően vagy a szinuszoidális efflux transzportereken keresztül visszakerülnek a véráramba, majd vizelettel ürülnek, vagy pedig a kanalikuláris efflux transzporterek segítségével az epébe szekretálódnak. Emberben általában az 500, míg patkányban a 300 g/mol-nál nagyobb molekulatömegű metabolitok ürülnek epével. Újabban az uptake folyamatokat fázis 0-nak, míg az efflux folyamatokat fázis III-nak nevezi az irodalom. 2.2 Drog transzport proteinek szerepe az endogén és exogén anyagok metabolizmusában Uptake proteinek, az SLC transzporter nagycsalád 3,4 Az SLC transzporter nagycsalád tagjait a Na + ion gradienstől való függésük szempontjából két csoportba lehet osztani: Na + ion függő (Ntcp, Asbt), illetve független transzporterekre (OATP; OAT; OCT). 2. ábra Az Oatp1 szerkezete 3 12 transzmembrán domént feltételező modell. A 3 potenciális extracelluláris N-glikozilációs helyet Y, a konzervatív aminosavakat fekete, míg a töltéssel rendelkező aminosavakat szürke pöttyök jelölik. A humán NTCP, és a patkány Ntcp működése a sejtbe irányuló nátrium gradiensen alapul (másodlagos aktív transzport). Kizárólag a májban expresszálódnak és az epesavak és származékaik felvételében játszanak szerepet. A patkány Ntcp szemben a humán NTCP-vel az epesavakon kívül az esztron- és dehidroepiandroszteron-szulfát, valamint a thyroid hormonok felvételében is szerepet játszik. A Na + ion függő uptake transzporterek közé - 8 -

8 BEVEZETÉS tartozik az ASBT. Elsősorban a kolangiociták és az enterociták apikális membránján lokalizálódik, főként az epesavak felvételében játszik szerepet. 1. táblázat Áttekintés a humán és patkány szervezetben előforduló uptake proteinek nevezéktanáról, membrán és szöveti lokalizációjáról valamint főbb szubsztrátjairól 3. Név Szisztematikus Polaritás Szöveti lokalizáció Főbb szubsztrátok név Humán uptake proteinek NTCP SLC10A1 BL hepatocita epesavak, esztron-szulfát, BSP hpgt SLC21A2 BL eikozanoidok OATP-A SLC21A3 BL hepatocita, agy epesavak, esztron-szulfát, E 2 17βG, eikozanoidok, OATP-C SLC21A6 BL hepatocita epesavak, rifampicin, eikozanoidok, BDG, BMG OATP-8 SLC21A8 BL hepatocita epesavak, digoxin, BMG OATP-B SLC21A9 BL általános esztron-szulfát, benzil-penicillin OATP-D SLC21A11 általános prosztaglandin E2 OATP-E SLC21A12 általános taurokolát. T3,T4 OATP-F SLC21A14 agy E 2 17βG, T3,T4, BSP OCT1 SLC22A1 BL kis organikus kationok Patkány Uptake proteinek Ntcp Slc10a1 BL hepatocita, vese epesavak, esztron-szulfát, T3,T4 Oatp1 Slc21a1 BL máj, vese epesavak,szteroid hormonok, T3,T4 BDG, ochratoxin rpgt Slc21a2 BL, A általános eikozanoidok OAT-K1/2 Slc21a4 vese epesavak, hormonok, eikozanoidok Oatp2 Slc21a5 BL vese, máj, véragygát, epesavak, digoxin retina Oatp3/Oat2 Slc21a7 BL, A jejunum, chorioid epesavak, eikozanoidok plexus Oatp9 Slc21a9 epesavak, eikozanoidok, rokuronium Oatp4/Lst-1 Slc21a10 BL máj, szem epesavak, eikozanoidok, phalloidin Oatp11 Slc21a11 Aptp12 Slc21a12 máj, tüdő, szív, agy, epesavak, T3 retina, vese Oatp5 Slc21a13 vese Oatp14 Slc21a14 agy Oat1/Oct1 Slc22a1 BL hepatocita, vese kis organikus kationok Az OATP család tagjai széles és részben átfedő szubsztrát spektrummal jellemezhetőek (1. táblázat). A 2. ábrán látható a 12 transzmembrán szegmenset tartalmazó hipotetikus szerkezet. A család tagjainak közös jellemzője: az ötös számú nagy extracelluláris hurok, mely a transzmembrán régió között található, illetve az N-glikozilációs helyek a kettes, ötös extracelluláris hurkon. A legtöbb Oatp esetében a működésben szerepet játszó hajtóerő tisztázatlan. Az Oatp1, Oatp2 által mediált taurokolát transzport hátterében az intracelluláris glutation gradiens játszik szerepet. Mai ismereteink szerint nem írtak le olyan betegséget, mely az OATP deficiencia következménye lenne. Ezzel szemben több kolesztázis modellben szepszis indukált, estradiol indukált, epevezető lekötés megfigyelték, hogy a - 9 -

9 BEVEZETÉS hepatocelluláris Oatp protein szintek csökkennek. Állatkísérletekkel igazolták, hogy primer szklerotizáló kolangitisz esetén az Oatp1,2 protein szint közel 80%-kal csökken Efflux proteinek, ABC transzport proteinek 5,6 Az ABC efflux transzport proteinek családjába olyan membránproteinek tartoznak, melyek szerkezetileg teljesen különböző molekulákat aktív transzporttal a koncentráció gradiens ellenében transzportálnak. A működésükhöz szükséges energiát az ATP hidrolízise fedezi. Membrántopológia alapján az ABC transzportereket 4 osztályba sorolják (3. ábra). Az elsőként felfedezett csoport a p-glikoproteinek (P-gp) voltak. A P-gp (mdr, spgp) fehérjék két, egyenként 6 3. ábra Az ABC proteinek általános szerkezete 6 A feltételezett másodlagos szerkezet alapján az extraceluláris N glikozilezett helyek a P-gp esetén az 1., transzmembrán szegmenset tartalmazó transzmembrán modulból épülnek fel, melyekhez 2 intracelluláris ATP-kötő az MRP1,2,3 esetében az 1. és a 3., az MRP4,5 esetében a 2. transzmembrán doménen, míg a BCRP esetében a domén kapcsolódik. Az első 3. transzmembrán hurkon helyezkednek el. extracelluláris hurok a P-gp esetében nagymértékben N-glikozilezett. In vitro kísérletek alapján feltételezik, hogy a glikoziláció megléte vagy hiánya kevéssé befolyásolja a transzport aktivitást, ezzel szemben nagy szerepet játszik a proteinek intracelluláris transzportjában és membrán lokalizációjában. A P-gp-hez hasonló szerkezetet mutat a második csoport, melybe az MRP4,5 proteinek tartoznak, azzal a különbséggel, hogy az N- glikoziláció a négyes extracelluláris hurkon történik. A harmadik csoportba tartozó MRP1,2,3 alapstruktúrája azonos az MRP4,5-el, azonban ezek tartalmaznak egy extra-transzmembrán domént, mely öt transzmembrán szegmensből épül fel. A negyedik csoportba az utolsóként felfedezett transzport proteinek tartoznak az úgynevezett fél-transzporterek, amely csoport legismertebb tagja a BCRP. A BCRP-t hat transzmembrán szegmens és egy N terminális ATP

10 BEVEZETÉS kötő domén alkot. A funkcionális egység két fél egység összekapcsolódásával jön létre. Az alábbi táblázat áttekintést nyújt az emlős efflux transzporterek szöveti és membrán lokalizációjáról, valamint a főbb szubsztrátjairól. 2. táblázat Áttekintés az emlős szervezetben előforduló MRP proteinek nevezéktanáról, membrán és szöveti lokalizációjáról valamint főbb szubsztrátjairól 5. MRP transzporterek Szisztematikus név Membrán Szöveti lokalizáció Főbb szubsztrátok MRP1 ABCC1 BL Általános glutation-konjugátumok, citosztatikumok MRP2/CMOAT ABCC2 A hepatocita, vese konjugált anionok, citosztatikumok MRP3 ABCC3 BL hepatocita, kolangiocita, konjugált anionok, ciszplatin vese MRP4 ABCC4 A vese esztradiol konjugátumok, methotrexat MRP6 ABCC6 BL,A általános BQ123 MDR1/PGY1 ABCB1 A általános ciklosporin A, verapamil, epesavak, citosztatikumok BSEP/SPGP/PGY4 ABCB11 A hepatocita Epesavak MDR3/PGY3 ABCB4 A hepatocita digoxin, foszfatidil-kolin ABCA1 A hepatocita, monocita foszfatidil-kolin ABCG5/ABCG8 A hepatocita foszfatidil-szerin Transzport proteinek élettani szerepe 7 A sejtmembránban található transzporterek típusa és mennyisége függ a sejt, szövet vagy szerv fiziológiai szerepétől; polarizált sejtek esetén a membrán típusától. Orális úton a szervezetbe kerülő xenobiotikumok először a bélhám sejteken található transzport rendszerrel kerülnek kapcsolatba. A vékonybél villusaiban igen nagy számban található az MDR1, MRP2, BCRP melyek az enterociták apikális membránján lokalizálódnak és a xenobiotikumok felszívódása ellen hatnak. Ezek a transzporterek ugyan jelen vannak az egész bélcsatornában, de expressziójuk bélszakaszonként eltérő: a tápcsatorna kezdetén és végén a legkisebb, a duodénumban és a jejunumban főként MRP2, míg az ileumban és a colonban főként MDR1 és BCRP expresszálódik. A bélhám sejetek bazolaterális membrán doménjén főként MRP1,3 található, a működésük következtében az enterocitákba felvett epesavak a vérkeringésbe kerülnek. A fiziológiai szerep tisztázásához nagy segítséget jelentettek a knock-out egerek. Az Mdr1a knock-out egereken olyan bélgyulladást tapasztaltak, mely hasonlít néhány humán bélbetegséghez. Bár még nem igazolták, de feltehetőleg a jelenséget az okozza, hogy a bélbaktériumok által termelt toxinok a hiányzó mdr1a aktivitás miatt bejutnak a bélfalba és ott gyulladást indukálnak. Az epesavak homeosztázisában kritikus lépés az ASBT mediált intesztinális reabszorpció, mely működés

11 BEVEZETÉS eredménye az epesavak enterohepatikus körforgása. Patkányokban a jejunum alsóbb szakaszán az Oatp3 is szerepet játszik az epesavak felszívódásában. 4. ábra A transzporterek szerepe a gyógyszerek aktív transzportjában 5 Az elsődleges epeszekrétum a májsejtek által határolt epecsatornákba választódik ki, az epesavak egy része a kolangiocitákkal határolt epegyűjtőcsatornákban visszaszívódik (kolehepatikus körforgás). A bélcsatornába került epesavak és a bilirubin egy része a bélhámsejtek transzportereinek közreműködésével visszakerülnek a központi keringésbe (enterohepatikus körforgás). Bal oldalon a humán, jobb oldalon a patkány sejtekre jellemző transzport proteinek találhatóak. A felszívódás után a vérkeringésbe került molekulák a májba jutnak. A metabolizálandó endogén és exogén anyagok főként OATP, illetve NTCP mediált uptake útján kerülnek be a hepatocitákba. A fázis I és II folyamatok lezajlása után a metabolitok vagy a bazolaterális membránon lokalizálódó MRP1,3 transzporteren keresztül visszakerülnek a vérbe, majd vizelettel ürülnek; vagy pedig a hepatociták kanalikuláris membránján lokalizálódó transzporterek segítségével az epébe kerülnek. Az így keletkezett elsődleges szekrétum a kolangiocitákkal szegélyezett epevezetőkben áramlik. A kolangiocták apikális membránján lokalizálódó ASBT főként epesavakat abszorbeál az elsődleges szekrétumból, míg a kolangiociták bazolaterális membránján lokalizálódó MRP3 és tasbt ( truncated ASBT) a

12 BEVEZETÉS periduktuláris plexusba juttatja az epesavakat, így létrehozva azok intrahepatikus körforgását (kolehepatikus sönt). A transzporterek nagy szerepet töltenek be a különböző gátak (vér-agy gát, placenta barrier) funkciók létrehozásában. Az MDR1 alapvető szerepet játszik a vér-agy gát működésében, hiányukban a drogok agyi penetrációja 10-vagy akár 100-szorosára is emelkedhet, ami súlyos toxikológiai következményeket vonhat maga után. A placenta barrier létrehozásában fő szerepet játszanak a szincitiotrofoblasztok apikális membránján lokalizálódó P-gp, BCRP és feltehetőleg MRP2, melyek meggátolják a drogok és méreganyagok bejutását a magzati keringésbe Transzport proteinek farmakológiai szerepe 6,8,9 A transzporterek alapvető szerepet játszanak a kemoterápiás rezisztencia kialakulásában, továbbá a gyógyszerek kiválasztásában és szöveti megoszlásában, azaz a gyógyszerek farmakokinetikai profiljának kialakításában. Komoly farmakológiai kutatások irányulnak P-gp inhibitorok keresésére, azt remélve, hogy így fokozható a citosztatikumok hatása. Azonban a szisztémás adagolás következtében a gátló hatás nem csak a tumoros sejteket érinti, hanem az egész szervezetre is hatással van. A bélben lokalizálódó P-gp proteinek direkt gátlása (PSC833, GF120918, ciklosporin A) drámaian megnövelte bizonyos P-gp szubsztrátok, például a paclitaxel biológiai hasznosíthatóságát mind egér, mind humán vizsgálatokban. Állatkísérletekben a HIV proteáz inhibitor saquinavir magzati penetrációja is fokozódott a PSC833, GF P-gp gátlószerek hatására. Az MRP1 az epithelium sejtjeinek bazolaterális membránján lokalizálódik. Az mrp1 knockout egerekben fokozott toxicitás jelentkezett i.v. etopozid adagolás következtében az orofaringeális nyálkahártyán, illetve a tesztikuláris tubulusokban. A jelenség következtében felismerték, hogy az MRP1 nagy szerepet játszik ezeknek a szöveteknek a toxinokkal, xenobiotikumokkal szembeni védekezésében. Hasonlóan knock-out egereken végzett vizsgálatok mutattak rá, hogy az i.p. adagolt vinkrisztin fokozott toxicitást okozott a kontroll egerekhez képest, különösen a csontvelőben és a gasztrointesztinális nyálkahártyában. Normális körülmények között ezeknek a szöveteknek a védelmében kiterjedt szerepet játszanak a P-gp és MRP1 proteinek. Az endogén MRP1 expresszióval rendelkező sejtvonalak a vinka alkaloidokkal, antraciklinekkel és a topotekánnal történő kezeléssel szemben rezisztensek

13 BEVEZETÉS Az MRP2 meghatározhatja az intesztinális abszorpció mértékét. Az enterociták apikális membránján lokalizálódva a lumenbe juttatja szubsztrátjait, így jelenléte a gasztrointesztinális rendszerben befolyásolhatja az orális gyógyszerek biológiai hasznosíthatóságát. Potenciális gyógyszer-interakciók forrása lehet az ún. stimulatív kotranszport, amelyet eddig az MDR1, MRP1 és MRP2 proteinekre írtak le. Az egyik elsőként dokumentált jelenség a redukált glutation hatása az MRP1 mediált etopozid és vinkrisztin transzportjára. Csökkentett glutation koncentráció mellett mindkét drog transzportja csökken. A legegyszerűbb magyarázat erre a jelenségre, hogy a két komponens egyszerre transzportálódik, így az egyik vagy a másik komponens hiányában a transzport kis kapacitással, vagy nem működik. Az MDR1 esetében szintén hasonló jelenséget írtak le két modell szubsztrát a Hoechst és a Rodamin 123 jelenlétében. A két szubsztrát transzportja eltérő típusú vegyületekkel stimulálható, így ezek alapján feltételezték, hogy ezeknek a fehérjéknek minimum két szubsztrát-kötő hellyel kell rendelkezniük. Az MRP2 szintén stimulálható, így pl. szulfinpirazon és vinkrisztin transzportja sztöchiometrikusan stimulálható glutationnal; a szulfinpirazon, indometacin, penicillin G transzportja stimulálható N-etilmaleimidglutationnal; az E 2 17βG transzportja pedig szulfinpirazonnal. A kotranszport fokozódás mértéke néhány vizsgált esetben több mint négyszeres volt. A megnövekedett transzportaktivitás megváltoztathatja a gyógyszeres kezelés hatásfokát, mivel az intesztinális abszorpció csökkenhet. Az MRP4 főként az antivirális nukleozid analógok és egyéb nukleozid analóg citosztatikumok transzportjában vesz részt. Az antivirális rezisztencia kialakulásában nagy szerepet tulajdonítanak az MRP4-nek, különösen HIV fertőzöttek esetében. A BCRP-t, mely szintén nagy szerepet játszik a per os adagolt gyógyszerek biológiaihasznosíthatóságában, egy doxorubicin rezisztens mellrák eredetű sejtvonalon fedezték fel. A BCRP inhibitor GF hatására az orálisan adagolt topotekán hatszoros szérumszint emelkedése következett be Uptake és efflux proteinek szintézisének és aktivitásának szabályozása 10,11,12,13,14 Az uptake és efflux proteinek aktivitása hasonlóképpen a metabolizmusban résztvevő fázis I és II enzimekéhez elsősorban a szervezetet érintő kémiai terheléstől függ. Ha növekszik a szervezet kémiai terhelése (toxinok, gyógyszerelés), akkor ezzel egyensúlyt tartva növekedni fog a metabolizáló rendszerben résztvevő enzimek és transzport fehérjék mennyisége. A megváltozott kémiai környezethez való alkalmazkodás biokémiai adaptáció útján történik. A legtöbb szervezetbe kerülő xenobiotikum egyben transzkripciós faktor aktivátor vagy receptor

14 BEVEZETÉS ligand, így ezek a molekulák a transzkripció fokozódásával de novo fehérjeszintézist indukálnak. Ez a hosszú távú adaptáció lassan bekövetkező folyamat, mivel a fehérje szintézis időigényes, a bekövetkezett változás azonban tartós. Egy élőlény túlélése szempontjából előnyös az, ha minnél gyorsabban reagál környezetének változására. A metabolizmus folyamataiban szerepet játszó transzport proteinek aktivitása dinamikus poszttranszkripciós szabályozás (foszforiláció, membráninzerció) alatt áll, így az élőlények gyorsabban reagálhatnak a megváltozott kémiai terhelésre. A kanalikuláris transzport proteinekből (BSEP, MRP2) nagymennyiségű intracelluláris raktár található, ehhez képest a membránban aktuálisan lokalizálódó transzport fehérjék mennyisége elhanyagolható. 3. táblázat Áttekintés a transzport proteinek indukálhatóságáról 15 Nukleáris Receptor Ligandok Transzport proteinek Pregnán X receptor PXR rifampicin, szteroidok, MDR1 phenobarbitál, sztatinok, epesavak és epesav prekurzorok OATP2 MRP2 Funkcionális következmények efflux a hepatociták, enterociták felszínén hepatocelluláris uptake (pl. digoxin) efflux a hepatociták, enterociták felszínén Konstitutív androsztán Recepetor CAR fenobarbitál MRP2 efflux a hepatociták, enterociták felszínén MRP3 efflux a hepatociták, kolangiociták, és enterocyták bazolaterális felszínén Farnezoid X receptor FXR epesavak I-BABP OATP8 BSEP MRP2 hepatocelluláris uptake epesav biliaris exkréció efflux a hepatociták, kolangiociták, és enterociták kanalikuláris felszínén Peroxiszóma proliferátor aktivált receptor α PPARα zsírsavak, klofibrát mdr2 kanalikuláris foszfolipid flippáz aktivitás ASBT Na + ion függő epesav felvétel az ileumban Glukukortikoid receptor GR glukokortikoidok ASBT Na + ion függő epesav felvétel az ileumban Retinol sav receptor RARα retinoidok NTCP Na + ion függő epesav felvétel az ileumban Kis heterodimer partner SHP-1 aktiváció FXR által Ntcp Na + ion függő epesav felvétel az ileumban OATP-C epesav felvétel a hepatocitákba α1fetoprotein transzkripciós faktor FTF epesavak MRP3 efflux a hepatociták, kolangiociták, és enterociták bazolaterális felszínén "Liver" X receptor LXRα/β oxiszterolok ABCA1 koleszterin efflux a makrofágokból, hepatocitákból és az enterocitákból ABCG5/ABCG8 koleszterin szekréció az epébe

15 BEVEZETÉS Egyes tanulmányok megkülönböztetnek camp illetve taurokolát hatására mobilizálódó raktárakat. A foszfatidil-inozitol 3 kinázt gátló Wortmannin hatására a taurokolát indukált epesav szekréció 50%-al csökkent. Tehát a taurokolát hatására kialakuló vezikuláris forgalom az intracelluláris raktár és a kanalikuláris membrán között a foszfatidil-inozitol 3 kináz szabályozása alatt áll. A protein kináz C szerepe szintén fontos az intracelluláris membrán forgalomban. A protein kináz C aktivitás fokozódás kiváltható urszodeoxikolsav-val vagy forbolészter adásával, ami a kanalikuláris membrán növekvő MRP2 denzitásához vezet. Az urszodeoxikolsav indukált membrán inzercióban a protein kináz C mellett szerepet játszik a p38 mitogén aktivált protein kináz is. Az ozmotikus környezet is hatással van a transzport proteinek aktivitására. Hipozmótikus körülmények között az intracelluláris vezikulákban lokalizálódó BSEP proteinek kikerülnek a kanalikuláris membránra, ezzel szemben a hiperozmótikus környezet hatására a BSEP és MRP2 proteinek lefűződnek a membránról, így a sejt transzport aktivitása csökken. A protein kináz C aktiváció az Oatp1 mediált transzportot csökkenti. Az extracelluláris ATP hatására történő szerin foszforiláció következtében az Oatp1 és Oatp2 funkcionális downregulációja észlelhető. A foszforilált Oatp elveszti aktivitását anélkül, hogy elhagyná a sejtfelszínt, a membránasszociált proteinek foszforilációs helyei lehetőséget adnak a sejtnek, hogy viszonylag gyorsan reagálni tudjon a patológiás körülményekre. Fontos felismerés volt, hogy a protein kináz C aktivátorok csökkentik az Oatp1 mediált digoxin transzportot is. A transzport proteinek aktivitása az egyedfejlődés során is változik. A patkány májban az Ntcp és az Oatp1 epesav transzporterek már az embrió fejlődése alatt jelen vannak. Az Ntcp mrns a vemhesség napjában detektálható patkányban, a születés után kezd emelkedni és a felnőtt szintet egy héttel a születés után éri el. Az Oatp1 először a vemhesség 16. napján detektálható és az elválasztás időpontjától kezd emelkedni patkányokban. Az apikális epesav transzporter, a BSEP mrns-e egerekben a vemhesség 15. napján már jelen van, emberben szintén kialakul az embrionális fejlődés során, de a patkány embriókból hiányzik. A máj és a vese MDR1 génexpressziója a vemhesség 11. hetében jelenik meg. 2.3 A bilirubin metabolizmusa 16 Virchov már 1847-ben hematómákból izolált bilirubin kristályokat, így feltételezte, hogy azok a vérből származnak ben Fisher és Orth meghatározta a bilirubin tetrapirrol szerkezetét, majd 1950-ben London és munkatársai sikerrel demonstrálták a bilirubin képződését

16 BEVEZETÉS hemoglobinból. A szérum bilirubin koncentráció fontos indikátora a kóros májműködésnek ban Hymans van der Bergh módszert dolgozott ki, melynek segítségével két meghatározott bilirubin frakciót tudott megkülönböztetni: direkt és indirekt reagáló bilirubin. A normál szérum bilirubin koncentráció 5-17 μm és ennek kb. 4%-a a konjugált bilirubin. A szervezetben naponta kb. 6 g bilirubin képződik A bilirubin képződése 17 A bilirubin a hem tartalmú fehérjék degradációját követően képződik. A szervezetben a hem 85-90%-a található hemoglobinban, kb. 10% mioglobinban és 1% egyéb fehérjékben (citokróm P-450 enzimek, peroxidáz, kataláz, oxigenáz). A degradáció első lépéseként az A és B pirrol gyűrűk közötti α metilén csoportot az α-metil oxigenáz kihasítja, így koleglobin keletkezik. A globinhoz kötött hem oxidációja következtében a porfirin gyűrű felbomlik. Ezt követi a globin lehasítása, majd a vastartalmú biliverdin IXα keletkezése. A hem oxigenáz katalitikus ciklusa a citokróm P-450 kevert funkciójú oxidázéra hasonlít. A bilirubin a citoszolban keletkezik, a tizedik szénatomon lévő központi metilén híd redukciójával, a folyamatot a NADPH-biliverdin reduktáz katalizálja. A kiszabaduló Fe 2+ ion Fe 3+ ionná oxidálódik, majd transzferrinhez kötődve eljut az újrafelhasználás helyéhez. A vasat a felhasználásig a lép ferritinben tárolja. A makrofág sejtekből kilépő bilirubin albuminhoz kapcsolódva komplexet alkot és így kerül be a központi keringésbe. A bilirubin kémiailag két aszimmetrikusan szubsztituált dipirrinon csoportból épül fel, melyek a központi metilén csoport körül szabadon rotációval elfordulhatnak, így a propionil oldallánc karbonil csoportja, a dipirrinon laktám amino csoportja és a pirrol gyűrű N atomja intramolekuláris hidrogénkötéseket hoznak létre, mely a molekula nagyfokú hidrofóbicitását okozza. A bilirubin hidrofób tulajdonsága miatt különösen nagy affinitással kötődik a központi idegrendszer szöveteihez. A bilirubin neurotoxicitása miatt a szervezetből történő eliminálása létfontosságú. A bilirubin erőssen kötődik az albuminhoz, ez a kötődés megakadályozza, hogy a szabad bilirubin kifejtse neurotoxikus hatását A bilirubin felvétele 18 Az elimináció első lépése a bilirubin és konjugátumainak szelektív felvétele a vérből a hepatocitákba. Sokáig úgy képzelték, hogy a bilirubin spontán diffúzióval kerül be a májsejtekbe, de a gátlási vizsgálatok rávilágítottak, hogy ebben a folyamatban gyors és szelektív karrier mediált uptake játszik szerepet. A bilirubin ugyanis ugyanazt a karrier rendszert használja, mint amit más organikus anionok pl.: BSP, indocianin zöld. A BSP és bilirubin gátolják egymás felvételét a májsejtekbe. A humán bilirubin felvételben az OATP-C,

17 BEVEZETÉS OATP-8, OATP-B vesz részt. Megfigyelték, hogy a HIV proteáz inhibitor indinavirral kezelt betegekben konjugálatlan hiperbilirubinémia fejlődik ki hasonlóképpen, mint az immunszuppresszáns ciklosporin A és az antituberkulotikum hatású rifamicin esetében. Kísérletesen is alátámasztották, hogy ezek a gyógyszerek terápiás dózisban szerepet játszanak az OATP-B mediált bilirubin uptake gátlásában. A májsejtek által felvett bilirubin a ligandinhoz (glutation S transzferáz dimer) kötődik. Humán májsejtekben a BG felvételében az OATP-C és OATP-8 játszik szerepet. Mindkét protein nagy affinitást mutat a BMG-hez (Km: 0,1 μm, 0,5 μm). Az OATP-C a BDG transzportjára is képes (Km 0,28 μm) A bilirubin konjugációja, az UGT enzimcsalád 19 Az UDP-glukuronozil transzferázok (UGT) a metabolizmus második fázisában vesznek részt. A glukuronsavval történő konjugáció mennyiségét tekintve a legjelentősebb fázis II reakció, melynek eredményeként általában nem toxikus, poláros termékek keletkeznek. Az UGT-k népes családja lehetővé teszi, hogy számtalan szerkezetileg különböző molekula biotranszformációja valósuljon meg ezen az úton. A glukuronidáció főként alkoholos, fenolos hidroxil valamint karboxil csoporton megy végbe. Az UGT enzimek legnagyobb mennyiségben a májban expresszálódnak, de nem jelentéktelen hányaduk fordul elő az enterális rendszerben, bőrben, vesében, szaglóhámban, ez utóbbiaknak a szaglási ingert kiváltó mediátorok eliminálásában van szerepük. A folyamat kofaktora az UDP-glukuronsav, amely UDP-glukózból keletkezik UDP-glukóz-dehidrogenáz hatására. Az UGT-k az endoplazmatikus retikulum membránjában lokalizálódnak. A kompartmentalizációs elmélet szerint az enzimek aktív centruma a lumen felé néz, ezért a glukuronsavnak és a szubsztrátoknak transzporterek segítségével be kell kerülni az ER lumenébe. Aminosav szekvencia homológia alapján az UGT enzimeket két családba sorolják. Egy családon belül a homológia nagyobb 45%-nál, az alcsaládon belül, pedig nagyobb 60%-nál. Az UGT1 családba tartozó enzimek nagy része az UGT1A alcsaládba tartozik. Az UGT2 családba tartozó enzimeket három alcsaládba sorolják. Az UGT1A enzimcsaládot kódoló gén szerkezetére jellemző, hogy a gén 3 végén található négy darab közös exon. Itt kódolódik az enzim C terminálisán elhelyezkedő glukuronsav kötő régió. A gén 5 vége felőli oldalon helyet foglaló minden exon egy-egy izoenzim első exonját kódolja, melyek az enzimek N terminális részét a szubsztrát kötő régiót kódolják. Az mrns transzkripció során az első exonok közül replikálódik egy és kapcsolódik a négy darab közös

18 BEVEZETÉS exonhoz. A közös exonokhoz legközelebb elhelyezkedő első exon az UGT1A1, a második az UGT1A2 és így tovább, az utolsó az UGT1A13 izoenzim kódjához tartozik. A fenti génstruktúrából egyenesen következik, hogy a közös exonokat érintő mutációk valamennyi izoenzim aktivitásában tükröződhetnek, míg az első exonok valamint a szabályzó szekvenciák mutációja eltérő mértékben érintheti az egyes izoenzimek aktivitását. Klinikai manifesztációt eddig csak az UGT1A1 enzim esetében tapasztaltak. Az UGT1A1 enzim végzi a bilirubin glukuronsav konjugációját, a folyamat során poláros, vízben jobban oldódó BMG és BDG keletkezik A bilirubin konjugátumok effluxa 16 Az ER lumenében keletkező BG az ER transzporterei segítségével ez idáig tisztázatlan mechanizmussal kerülnek a citoplazmába. Ezt követően fiziológiás körülmények között a BG a kanalikuláris membránon lokalizálódó MRP2 (humán rekombináns MRP2: K mbmg =0,7 μm K mbdg =0,9 μm) közreműködésével kerül az epecsatornákba. Normál körülmények között az MRP3 jelenléte a szinuszoidális membránon alacsony, így nem kerül BG a szinuszoidális membránon keresztül a véráramba. Ha az MRP2 funkcionálisan inaktív (kolesztázis), akkor szerepét a szinuszoidális membránon lokalizálódó megnövekedett mennyiségű MRP3 veszi át. Ez a kompenzációs mechanizmus megakadályozza a citotoxikus molekulák intracelluláris felhalmozódását. Így azok a metabolitok is a véráramba kerülnek, amelyek egyébként az epével ürülnének. A fokozódó renális kémiai terhelés hatására a vesében is lejátszódik a fenti folyamat, így a metabolitok eliminációjának sebessége fokozódik Örökletes bilirubin anyagcserezavarok és következményeik 14,20 A biotranszformációban szerepet játszó fázis I-II enzimek és transzport proteinek működési zavara a metabolikus homeosztázis felborulásához vezet. A metabolizmus folyamatainak csökkenése vagy megszűnése a xenobiotikumok és a feleslegessé vált endogén anyagok (pl. bilirubin) felhalmozódásához vezethet. A legtöbb esetben - mivel ezen enzimek részben vagy teljes egészében átfedő szubsztrát specificitással rendelkeznek klinikai manifesztáció nem történik. Genetikai okokra visszavezethető klinikailag is tapasztalható bilirubin anyagcserezavart az UGT1A1 és MRP2 proteinek esetében találtak. A Gillbert-kór a kaukázusi rasszba tartozó egyének 5-6%-át érintő megbetegedés. A kórkép kialakulásának hátterében genetikai mutáció áll, amely az UGT1A1 gén promoter régióját

19 BEVEZETÉS érinti. A betegség örökletes, krónikus, de gyakran tünetmentes. A mutáció következménye egy genetikai polimorfizmus, mely a TA bázisok ismétlődésében jelentkezik. A Crigler-Najjar szindrómának két típusa van. A CNSI szindrómát az UGT1A1 teljes hiánya jellemzi. Ennek következménye, hogy kritikus mértékben emelkedik a szérum bilirubin szint, ami kernicterus kialakulásához, majd halálhoz vezet. Ebben az esetben nem detektálható konjugátum az epében. A szérum bilirubin szint magas: µm. A CNSII szindróma kialakulásáért az UGT1A1 csökkent működése felelős. A szérum bilirubin szint µm között van. Az epében nagymértékben megnő a BMG aránya. A betegség molekuláris hátterében az áll, hogy az UGT1A1 mrns transzkripció egy korai stop kodon miatt megáll, vagy egyéb mutáció miatt inaktív, illetve erősen csökkent aktivitású fehérje szintetizálódik. A Dubin-Johnson szindróma a kanalikuláris MRP2 hiánya következtében kialakuló konjugált hiperbilirubinémia. A Rotor szindrómára jellemző a krónikus, de ártalmatlan hiperbilirubinémia. A betegség autoszómális recesszív öröklődés menethez kötött. A bilirubin szérum szint 17 µm, egyéb májfunkciós paraméterek normálisak. A betegséget a hepatociták csökkent bilirubin raktározása okozza. 2.4 A kolesztázis A transzporterek kórélettani szerepe A transzport folyamatokat érintő kórélettani változások létrejöhetnek genetikai defektus következtében vagy kialakulhatnak szerzett módon. Az örökletes májbetegségek egyik típusa a PFIC, mindhárom formája autoszómális recesszív öröklődést mutat. Három altípusa közül az egyik a Bayler-betegség (PFIC I), melyre sárgaság és súlyos pruritus jellemző az epesavak magas szérum koncentrációja miatt. A betegséget a FIC1 (ATP8B1) gén mutációja okozza. FIC1 gén által kódolt p típusú adenozin trifoszfatáz feltehetőleg szerepet játszik az epesavak és foszfolipidek transzportjában, bár ezt direkt úton még nem igazolták. Ennek ellenére az ATP8B1 diszfunkció következménye az epesav transzport zavara. Az ATP8B1 nem csak a májból, de a vékonybélből is hiányzik vagy mennyisége csökkent, aminek következménye a krónikus vizes hasmenés. A Bayler-szindróma (PFIC II) a BSEP (ABCB11) gén mutációja következtében jön létre. A betegségre jellemző az epesavak intracelluláris akkumulációja, melynek következtében hepatocelluláris károsodás alakul ki, ami nekrózist és/vagy apoptózist indukál

20 BEVEZETÉS A PFIC III, MDR3 deficiencia következtében alakul ki. A PFIC I és II-vel szemben erre a kórképre jellemző a magas szérum γgt, a szövetekben a ductuláris proliferáció és a gyulladásos infiltráció. A kanalikuláris MDR3 defektus következtében az epéből hiányoznak a foszfolipidek. Mivel a foszfolipidek micellaképződéssel védik a biliáris epitélt az epesavak citotoxikus hatásától, így azok hiánya a biliáris epitél károsodásához vezet. BRIC a familiáris intrahepatikus kolesztázis benignus formája. Nem vezet progresszív májkárosodáshoz, de az epéből hiányzó epesavak gyakran intesztinális malabsorpcióhoz vezetnek az egyébként tünetmentes páciensekben. Dubin-Johnson-szindróma autoszómális receszív módon öröklődő betegség. Jellemző az emelkedett konjugált bilirubin szint, a magas vizelet koproporfirin I szint, illetve a megnövekedett brómszulfoftalein retenció. A PFIC-vel szemben megtartott májfunkció jellemző. A kórképet az apikális MRP2 deficiencia okozza. Az MRP2 delta mutáció az endoplazmatikus retikulum és a Golgi komplex közötti protein forgalom zavarát okozza, melynek következtében fokozódik az MRP2 endoplazmatikus retenciója, amit proteoszómális degradáció követ, ennek következtében az MRP2 teljesen hiányzik az apikális membránból. A hiányzó kanalikuláris MRP2 funkciót fokozott szinuszoidális MRP3 expresszió kompenzálja. Így a BG nem az epébe, hanem a vérkeringésbe kerül, majd renális úton ürül. Az emelkedett szérum BG szint következtében a tubulusok MRP3 expressziója is fokozódik, mely folyamat a konjugátumok ürülését gyorsítja. A transzport rendszer szerzett defektusai között említhető a gyógyszer, illetve szepszis indukált kolesztázis, valamint a terhesség alatt jelentkező intrahepatikus kolesztázis. A szerzett intrahepatikus kolesztázis típusait a következő fejezetben tárgyalom

21 BEVEZETÉS 4. táblázat Áttekintés a transzport proteinek fiziológiás lokalizációjáról és a kórfolyamatokban bekövetkezett változásairól 14. A változások alapesetben a proteinszintekre (p) vonatkozik. Faj Transzport protein Fiziológiai funkció Kórkép, állapot Változás Bazolaterális transzport proteinek patkány humán patkány humán patkány/humán patkány/humán Ntcp hepatocelluláris Na függő epesav felvétel kolesztázis, állatmodell Terhesség p,mrns hepatocelluláris Na NTCP függő epesav felvétel Kolesztázis p,mrns Hepatocelluláris karcinóma amfipatikus molekulák multispecifikus BDL és estradiol indukált Oatp1 felvétele kolesztázis Oatp2 szívglikozidok CCl 4 okozta májkárosodás mrns estradiol indukált kolesztázis p,mrns amfifil molekulák multispecifikus Oatp4 felvétele BDL és szepszis Epesavak és organikus anionok hepatocelluláris OATP-C felvétele gyulladásos kolesztázis mrns OATP8 MRP1 MRP3 Hepatocelluláris karcinóma xenobiotikumok, peptidek, organikus anionok hepatocelluláris felvétele citotoxikus kationok és nem epesavas anionok effluxa hepatoma sejtek, szepszis citosztatikumok konjugált anionok Eisai hiperbilirubinaemiás effluxa patkányok, BDL Dubin-Johnson syndroma primer biliáris cirrózis Apikális transzport proteinek egér/patkány BSEP epesavak effluxa Génmutáció p humán BSEP epesavak effluxa PFIC2 biliáris exkréció intrahepatikus kolesztázis gyulladásos kolesztázis mrns ciszinhibició (CS A) transzinhibició (E17-βG) C57L/J epekőképződésre hajlamos egér ennek ellenére alacsony epesav szekréciós kapacitás egér Mdr2 foszfolipid exkréció portális gyulladás, epevezető proliferáció, fibrózis humán MDR3 foszfolipid exkréció PFIC3 Mutáció patkány/humán MRP2 organikus anion exkréció epevezető lekötés, endotoxaemia kolesztázis direkt hiperbilirubinaemia, patkány Mutáció Dubin-Johnson syndroma Mutáció PBC, gyulladásos kolesztázis PSC humán FIC1 aminofoszfolipid transzlokátor Bayler betegség, BRIC Mutáció

22 BEVEZETÉS A szerzett kolesztázis A kolesztázis vagy epepangás állapota a kóros epeszekréció következtében alakul ki, melynek extra vagy intrahepatikus okai lehetnek. Az extrahepatikus okok között említhető az obstrukciós kolesztázis, mely az epevezető elzáródása (epekő, tumor) következtében alakul ki. Az elzáródás következtében kialakuló intrakanalikuláris nyomásfokozódás a hepatociták membrán felszínén molekuláris szintű változásokat indukál. Megváltozik mind a bazolaterális, mind a szinuszoidális membrán proteinek mennyisége és eloszlása. A változásoknak köszönhetően a kanalikuláris efflux csökken, míg a szinuszoidális fokozódik. Az intrahepatikus kolesztázis lehet szepszis vagy gyógyszer indukált. A szepszis indukált kolesztázis mechanizmusára jellemző, hogy a baktériumokból felszabaduló endotoxinok a Kupffer sejtekből tumor nekrózis faktor α-t, interleukin 1 -és 6-ot szabadítanak fel. A felszabaduló citokinek hatására a kanalikuláris membránról a transzport proteineket (BSEP, MRP2) is tartalmazó membrán vezikulák fűződnek le, a folyamat hatására az epekomponensek nem tudnak az epébe szekretálódni A gyógyszer-indukált kolesztázis 21 A gyógyszer indukált kolesztázisok spektruma az akut, enyhe kolesztázistól a krónikus Vanishing Bile Duct Syndrome -ig (VBDS) terjed. A gyógyszer okozta májkárosodások közel 17 %-a akut kolesztázis. 5. Táblázat A kolesztázis típusainak rövid áttekintése 21 Típus Akut forma I. Kolesztázis hepatitis nélkül Ösztrogén, anabolikus szteroidok, ( bland kolesztázis) Ciklosporin A Tamoxifen II. Kolesztázisos hepatitis Klórpromazin, makrolid antibiotikumok, triciklusos antidepresszánsok, augmentin, NSAID (hepatocanalicularis, exudative) Azatioprin III. Kolangolítikus kolesztázis (epevezető károsodás) Flucloxacillin, paraquat Krónikus forma IV. Vanishing bile duct syndrome Klórpromazin, oxopenicillin, cimetidin, barbiturát, haloperidol, karbamazepin Ibuprofen, esztradiol V. Primer szklerotizáló kolangitisz Floxuridin

23 BEVEZETÉS Az I. típusra jellemző, hogy a kezdeti tünetek a gyógyszer terápia megkezdése után 2-3 hónappal jelentkeznek: hasmenés, anorexia, rossz közérzet, majd ezt követően súlyos viszketés alakul ki. A viszketést a szervezetben pangó epesavak idézik elő. Az első látható tünetek az icterus és horzsolások megjelenése a bőrön. Igen súlyos esetekben a bilirubin szint 200 µmol/l is lehet. Az ösztrogén indukált kolesztázis tipikus példa hepatitis mentes gyógyszer indukált kolesztázisra. A tünetek rendszerint 2-3 hónappal a kolesztázist okozó gyógyszerterápia indítása után kezdődnek. A terápia befejezése után, gyorsan és reverzibilisen megszűnnek. A hormonpótló kezelésként alkalmazott estradiol esetében nem alakul ki gyógyszer indukált kolesztázis sőt, még a kolesztatikus májbetegségben szenvedő nők esetében is biztonságosan alkalmazható. A II. típusra jellemző, hogy a kezdeti tünetek megjelenése a gyógyszerelés megkezdése után 1-6 hét között változik. Jellemző tünetei: fájdalom a jobb felső kvadránsban, hányás, anorexia. A szérum alkalikus foszfatáz szint kb. háromszorosa a normál szintnek. Pruritus a betegek 70%-ánál jelentkezik, de nem olyan súlyos mértékben, mint az előző típusnál. A gyógyszerelés befejezése után 3 hónapon belül megszűnnek a tünetek. Jellemző erre a típusra a klórpromazin indukált májkárosodás (a betegek 0,2-2%-a). A betegek 7%-ánál a VBDS alakulhat ki. Az amoxicillin-klavulánsav kombináció (Augmentin) szintén számos esetben okozott májkárosodást, elsősorban az augmentin klavulánsav tartalma miatt. A III. típusra jellemző a portális-lobuláris területek gyulladásos infiltrációja, valamint az interlobuláris epevezetők léziója. A klinikai tünetekre jellemző a magas láz, hepatomegália, sárgaság. Ezt a fajta toxikus májkárosodást elsősorban flukloxacillin, klorpromazin, karbamazepin idézheti elő. A IV. típusra az intrahepatikus epevezető rendszer kiterjedt és progresszív károsodása jellemző. A kezdeti tünetek májgyulladásra utalnak, majd ezt abnormális májfunkciós paraméterek és sárgaság követi. Perzisztáló anicterikus kolesztázis gyakran több mint egy éven át is jelen lehet. Májbiopszia során az intralobuláris epevezetők mennyiségének csökkenése figyelhető meg. A szindróma patogenezise ismeretlen, de az eozinofil infiltráció valószínűsíti az immunmediált epevezeték károsodást, valamint szerepet játszhat benne a pangó epesavak toxikus hatása is. Az V. típus (Primer szklerotizáló kolangitis) alakul ki pl. a metasztázisos kolorektális karcinoma kezelésekor alkalmazott intraarteriális fluxuridine infúzió alkalmazása után

24 BEVEZETÉS Az epeszekréció gátlásának molekuláris hátterében szerepet játszhat: 1) A transzport protein direkt gátlása (benzbromaron, probenecid, indometacin, glibenclamid, rifampicin). 2) A mikortubulusok depolimerizációját okozó kolhicin, mely gátolja a transzport proteinek kihelyeződését a sejtmembránra; a ciklosporin A pedig a perikanalikuláris F-actin károsításával gátolja a transzport protein-plazmamembrán transzportot. 3) A transzport proteinek poszttranszkripciós szintézisének gátlása, pl. etenil-estradiol. Kolesztatikus mellékhatásokat jelentettek a következő kiterjedten alkalmazott gyógyszerekről: sztatinok, tillopidin, ACE gátlók, ATII antagonisták, fluoroquinolon származékok, loracerbef, NSAID, terbinafin, tiopronin, glicirhizin. 2.5 Gyakran alkalmazott in vitro módszerek a transzport aktivitás meghatározására A gyógyszerjelölt molekulák transzporterekre gyakorolt hatásának in vitro preklinikai vizsgálata során leggyakrabban akkumuláció/efflux, transzport/permeábilitás és ATP-áz esszéket alkalmaznak. Az akkumuláció/efflux teszteket máj sejtszuszpenzióban, monolayeren vagy membrán vezikulákon végzik fluoreszcens (rhodamin 123) vagy radioaktiv ligand alkalmazása mellett 22,23. A módszer jól használható a potenciális gyógyszer-interakciók, abszorpció és elimináció mértékének becsléséhez. Előnye, hogy könnyű és gyors technika, jól alkalmazható nagy áteresztő képességű (HTP) vizsgálatoknál. Hátránya, hogy nem lehet meghatározni az akkumuláció/effluxban érintett transzport proteinek lokalizációját, és alulbecsli a transzport aktivitást a kis permeabilitású szubsztrátok esetében. A transzport/permeabilitás esszék célja az akkumuláció/efflux esszékhez hasonlóan a potenciális transzport szubsztrátok meghatározása főként transzport fehérjéket expresszáló Caco-2 sejtek alkalmazása mellett. A módszer jól használható a transzporterek celluláris lokalizációjának meghatározására. Definitív módszer az efflux transzporterek drog permeábilitásra gyakorolt hatásának vizsgálatára. Hátránya, hogy konfluens monolayer-t követel meg, alulbecsli a transzport aktivitást a nagy permeabilitású szubsztrátok esetében 24,25. Az ATP-áz esszék az ATP hidrolízis során keletkező inorganikus foszfát detektálásán alapulnak. Ezeket kiterjedten alkalmazzák a P-gp aktivitás meghatározására. Az ATP-áz aktivitás meghatározása történhet membrán vezikulákban vagy monolayeren. A gyógyszer/transzporter interakciók felderítéséhez a módszer könnyen adaptálható nagy

25 BEVEZETÉS áteresztő képességű vizsgálatokhoz. Hátránya, hogy nagy a mérések közötti variabilitás, és kis permabilitású szubsztrátok vizsgálata esetén alulbecsüli a transzport aktivitást 26,27. A fenti technikák kivitelezése során általában genetikailag módosított sejtvonalakat alkalmaznak. Ezek az immortalizált sejtek egy vagy több transzport fehérjét overexpresszálnak. Szemben a primer sejtekkel ezek mind funkcionális, mind morfológiai szempontból távol állnak a fiziológiás állapottól

26 CÉLKITŰZÉS 3 CÉLKITŰZÉSEK Doktori munkám alapját a bilirubin metabolizmusában kulcsszerepet játszó UDPglukuronozil transzferáz (UGT1A1) és bilirubin-glukuronid efflux transzporterek (MRP2, MRP3) vizsgálata képezte. Munkám egyik célkitűzése az volt, hogy megvizsgáljam primer hepatocita kultúrában a bilirubin metabolizmusát érintő indukciós típusú gyógyszer interakciókat, különböző indukciós hatásmechanizmussal működő molekulák esetében (dexametazon, klofibrát, metilkolantrén, rifampicin). Vizsgálni kívántuk a fenti induktorok hatását az UGT1A1, a kanalikuláris MRP2 és a szinuszoidális MRP3 aktivitására primer hepatocita rigid és kollagén szendvics kultúrában. Munkám további célkitűzése volt a gyógyszerindukált kolesztázis in vitro modellezése. Ennek megvalósítása érdekében vizsgáltuk a már ismert kolesztázist okozó és transzport gátló vegyületek hatását a bilirubin-glukuronid szinuszoidális és kanalikuláris effluxára primer hepatocita szendvics kultúrában