ÚJ LEHETŐSÉGEK A GYERMEKKORI AKUT LIMFOID LEUKÉMIA DIAGNOSZTIKÁJÁBAN ÉS TERÁPIÁJÁBAN

Átírás

1 ÚJ LEHETŐSÉGEK A GYERMEKKORI AKUT LIMFOID LEUKÉMIA DIAGNOSZTIKÁJÁBAN ÉS TERÁPIÁJÁBAN Doktori értekezés SZERZŐ: DR. CSÓKA MONIKA TÉMAVEZETŐ: PROF. DR. SZENDE BÉLA PROF. DR SCHULER DEZSŐ II. sz. Gyermekgyógyászati Klinika és I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet Semmelweis Egyetem, Budapest 2001

2 TARTALOMJEGYZÉK 1. Összefoglalás 5 2. Summary 6 3. Bevezetés 7 4. Célkitűzések Az apoptotikus index prognosztikai szerepének vizsgálata prednizolon-kezelés alatt gyermekkori ALL-ben Bispecifikus antitestek előállítása, tisztítása és jellemzése call-es gyermekek leukémia sejtjeinek fenotipizálása A perifériás vér limfocitáinak aktiválása A CD3xCD19 bispecifikus antitest által mediált lízis in vitro vizsgálata allogén és autológ rendszerben Irodalmi háttér Akut limfoid leukémia Apoptózis Morfológiai változások Biokémiai változások Apoptózis és kemoterápia A kaszpázrendszer aktivációja Receptorhoz kötött apoptózis DNS-károsodás indukálta apoptózis Immunterápia malignus betegségekben Konjugálatlan monoklonális antitestek Immuntoxinok Radioimmunkonjugátumok Bispecifikus antitestek Célsejt antigének: CD19 és CD Effektor sejt antigén: CD Módszerek 32

3 6.1. Limfoblasztok apoptózisának vizsgálata A vérminták előkészítése apoptózis vizsgálatokhoz Fénymikroszkópos vizsgálat Flow citometria Klinikai vizsgálatok Statisztikai feldolgozás Bispecifikus antitestek előállítása és in vitro kipróbálása OKT3xHD37 (CD3xCD19) és OKT3xMEM97 (CD3xCD20) hibrid-hibridóma előállítása CD3xCD19 és CD3xCD20 bispecifikus antitestek előállítása és tisztítása Immunfluoreszcens jelölés A target sejtek és a perifériás vér mononukleáris sejtjeinek izolálása A nyugvó T sejtek aktiválása Citotoxicitási esszé Eredmények Az apoptotikus index, mint prognosztikai faktor prednizolonkezelés alatt gyermekkori ALL-ben A CD3xCD19 és a CD3xCD20 bispecifikus antitest előállítása, tisztítása és jellemzése call-es gyermekek leukémia sejtjeinek fenotipizálása A perifériás vér limfocitáinak aktiválása A CD3xCD19 bispecifikus antitest által mediált lízis in vitro rendszerben Megbeszélés Az apoptotikus index, mint korai prognosztikai faktor prednizolonkezelés alatt gyermekkori ALL-ben A CD3xCD19 bispecifikus antitest által mediált lízis allogén és autológ in vitro rendszerekben Következtetések Köszönetnyilvánítás 70

4 11. Az értekezés témájában megjelent saját közlemények bibliográfiai adatai Cikkek Idézhető absztraktok Előadások és poszterek Rövidítések jegyzéke Irodalomjegyzék 77

5 1. ÖSSZEFOGLALÁS Az ALL a leggyakoribb malignus betegség gyermekkorban. Mivel hagyományos terápiával a betegek %-ánál nem sikerül gyógyulást elérni, új diagnosztikus és terápiás eljárások kidolgozására van szükség. A blasztok szteroid-érzékenységének prognosztikai jelentősége jól ismert. A prednizolon a blasztok apoptózisát idézi elő. Ezt a tényt kihasználva olyan diagnosztikus módszert akartunk kidolgozni, amely már a kezelés első óráiban információt adhatna a leukémiás sejtek szteroid-érzékenységéről. Így rezisztencia esetén már a kezelés korai szakaszában nagyobb intenzitású és hatásosabb kemoterápiát kezdhetnénk. Vizsgálataink azt mutatták, hogy mind a morfológiai mind a flow citometriás apoptózisvizsgálatok jól korreláltak a klinikai prednizolon-válasszal. Azoknál a betegeknél, akiknek a szervezetében a kezelés végén leukémiás sejtek maradnak, alternatív megoldásként szóba jön az immunterápia. In vitro kísérleteinkben CD3 és CD19 monoklonális antitestet szecernáló hibridómák fúziójával általunk előállított bispecifikus antitestet alkalmaztunk, amely egy antitest-molekulán belül két különböző kötőhellyel rendelkezik. Az egyik kötőhely (CD3) a T sejteket aktiválja a T-sejt receptor komplexen keresztül, míg a másik kar (CD19) a citotoxikus T sejteket a malignus B sejtekhez kapcsolja. Mivel a CD19 antigén expressziója valamennyi vizsgált gyermekkori B-sejtes leukémia esetében állandó és erős volt, ideális célantigénnek tűnt vizsgálataink számára. A CD3xCD19 bispecifikus antitest aktiválta a perifériás vér mononukleáris sejtjeit mind egészséges donorok, mind remisszióban levő ALL-es betegek esetében. A CD28 molekulán keresztül történt kostimuláció az aktiváció szintjét kismértékben fokozta, de a citotoxikus aktivitás nem változott. Kísérleteinkben bebizonyítottuk, hogy a CD3xCD19 bispecifikus antitest kostimuláció nélkül is hatékonyan aktiválja a citotoxikus T sejteket, majd az így előaktivált sejteket a malignus B sejtekhez kapcsolva azok lízisét idézi elő. Ez a módszer hatékony lehet recidiváló és/vagy terápia-rezisztens gyermekkori B-sejtes ALL-ben. 5

6 2. SUMMARY ALL is the most common hematological malignancy of childhood. As conventional therapy fails to achieve complete recovery in % of the patients, new diagnostic and therapeutic methods need to be worked out. One of the known prognostic factors is the glucocorticoid sensitivity of leukemic blast cells. Prednizolon treatment results in apoptosis of leukemic blasts. This observation suggested a new diagnostic method, which could give early in the first hours of treatment information about steroid-sensitivity of blast cells. In this way non-responders could start on a more intensive and effective chemotherapy in the early stage of their treatment. According to our findings, an increase in apoptotic ratio measured by morphological and/or flow cytometric methods correlates with the clinical prednizolon response. Immunotherapy is one of the promising new approaches that may be used in patients with a residual load of leukemia cells. Bispecific monoclonal antibodies were raised by cell fusion of two hybridoma cell lines secreting CD3 and CD19 antibodies. The resulting bispecific antibody contains two different specificities within a single antibody molecule. One binding site (CD3) activates the T cells via the T cell receptor complex, whereas the second binding site (CD19) targets the cytolytic T cells to malignant B cells. Leukemic blasts from children with B-lineage ALL showed stable and strong CD19 expression. CD3xCD19 bsab was used to activate peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from healthy donors or from patients with ALL during remission. Costimulation through CD28 increased T cell proliferation to some extent, but did not increase cytotoxic activity of PBMC against leukemic blasts. We present evidence for an effective and specific activation of resting human T lymphocytes by CD3xCD19 in vitro. Based on our in vitro studies, adjuvant immunotherapy using CD3xCD19 bsab might be beneficial for children with relapsed and/or therapy-resistant common ALL. 6

7 3. BEVEZETÉS Az akut leukémia a leggyakoribb gyermekkori malignus betegség. Előfordulási gyakorisága évente kb. 4 beteg/ gyermek. Ezek mintegy 80%-át az akut limfoid leukémiák (ALL) alkotják. Hagyományos terápiával - beleértve a kemoterápiát, a központi idegrendszeri besugárzást és a csontvelőátültetést is - a betegek több, mint 70 %-ánál teljes remissziót, ill. betegségmentes túlélést lehet elérni. De a kezelés súlyos mellékhatásokkal jár és a betegek 20-30%-át nem sikerül meggyógyítani. Ez vagy azt jelenti, hogy egyáltalán nem is sikerül teljes csontvelői remissziót elérni, vagy az elért remisszió átmeneti és betegségük később recidivál. A betegek egy részénél a leukémia gyógyítása során csak a minimális reziduális betegség (MRD) állapotát tudjuk elérni, a teljes gyógyulást nem. A betegek sikeres kezelésének egyik legfőbb akadálya a tumorsejtek rezisztenciája a kemoterápiával szemben, amely kialakulhat de novo vagy a kemoterápiás kezelés következtében. A másik nagy akadály a nagydózisú kemoterápia mellékhatásaként jelentkező toxicitás. Ezeknél a betegeknél - a jobb gyógyulási esély érdekében - új diagnosztikus és terápiás módszerekre van szükség. A szteroidérzékenység minél korábbi időpontban történő meghatározása a megfelelő kezelés korai bevezetését tehetné lehetővé. Az immunterápia pedig az egyik ígéretes új adjuváns terápiás lehetőség azon betegek számára, akiknél leukémiás sejtek maradnak a szervezetben a kemoterápiás kezelés végén. A glukokortikoidok rendkívül fontos szerepe a leukémiák és limfómák gyógyításában már régóta ismert tény (1). Kísérleti modellekből tudjuk, hogy ez a hormon apoptózist indukál a malignus limfoid sejtekben. Glukokortikoiddal kezelt timociták és limfoid sejtvonalak sejtjei in vitro az apoptózisra jellemző morfológiai változásokat mutatnak, amelyek fény- és elektronmikroszkóppal jól követhetők (2). Ezekben a sejtekben az endogén endonukleáz aktivációja és jellegzetes kromatinhasítás következik be, amelyet elektroforézissel vagy flow citometriás vizsgálattal lehet kimutatni (3,4). Glukokortikoid-rezisztens sejtvonalak esetében ezeket a jelenségeket nem lehet megfigyelni (5). 7

8 Az általunk vizsgált időszakban érvényben levő kezelési sémák (ALL-BFM-90 és ALL-BFM-95) szerint az ALL-es gyermekek a kezelés első hetében csak prednizolont kapnak. A protokoll előírásainak megfelelően a kezelés 8. napján a perifériás vérben mért abszolút blasztszám alapján állapítjuk meg, hogy a betegek jól reagáltak-e a szteroidterápiára. A 33. napon végzett csontvelővizsgálat alapján határozható meg, hogy sikerült-e betegeinknél remissziót elérni. Az eredmények ismeretében dől el, hogy a betegek a jobb vagy a rosszabb prognózisú csoporthoz tartoznak, és ennek megfelelően a későbbiekben eltérő intenzitású kezelést kapnak. Mivel a leukémiás blasztok glukokortikoid-érzékenysége az egyik legfontosabb prognosztikai faktor a gyermekkori akut limfoid leukémiák esetében, ezt a tényt kihasználva olyan vizsgálati módszert akartunk felállítani, amely igen korán, már a kezelés megkezdése után néhány órával választ adna arra a kérdésre, hogy a leukémiás sejtek hogyan reagálnak a glukokortikoid kezelésre. Amennyiben a leukémiás blasztok szteroidrezisztensek, módszerünket alkalmazva már a kezelés első napjaiban lehetőség nyílhatna a terápia megváltoztatására. Vizsgálataink során a klinikai reakciót (perifériás blasztszám) hasonlítottuk össze a perifériás vérből származó tumorsejtek morfológiai változásaival (apoptotikus sejtek aránya). Ezzel párhuzamosan flow citométerrel a leukémiás sejtek DNStartalmának változását is mértük (apoptotikus index). Tapasztalataink alapján glukokortikoid-érzékenység esetén a sejtek apoptózisa a kezelés első néhány órájában bekövetkezik, s ez mind morfológiai, mind flow citometriás módszerrel jól követhető. Munkánkban azt vizsgáltuk, hogy használható-e a prednizolon-érzékenység korai markereként a limfoblasztok apoptotikus arányának változása a prednizolon monoterápia alatt. Annál a betegcsoportnál, akiket a hagyományos módszerekkel nem lehet teljesen tumormentessé tenni (MRD) alternatív terápiára van szükség. Az egyik ígéretes lehetőség az immunterápia. Először 1979-ben használtak monoklonális antitestet betegek kezelésére (6), és azóta folyamatosan fejlődött ez az alkalmazási mód. A hibridóma-technikával (7) előállított tumorellenes monoklonális antitestek gátolhatják a malignus hematopoietikus sejtek proliferációját és elpusztíthatják őket (8,9). Ez különböző mechanizmussal következhet be. Az egyik lehetőség olyan célantigének 8

9 kiválasztása, amelyek a sejtek túlélése és szaporodása szempontjából fontosak (pl. a növekedési faktor receptorok). A legtöbb alkalmazott antitest azonban nem funkcionálisan releváns molekulákkal reagál. Hatásukat más módon, a szervezet effektor mechanizmusainak aktiválásával fejtik ki: 1. Komplementfüggő citotoxicitás aktiválása 2. Antitestfüggő celluláris citotoxicitás (ADCC) 3. Makrofágok által közvetített citotoxicitás (citokinek) Az előbbi antitestek natív formában kerülnek felhasználásra, de citotoxikus molekulákat is lehet az antitestekhez kapcsolni, amelyek így célzottan eljuttathatók a tumorsejtekhez. Az így keletkező immuntoxinok vagy radioimmunkonjugátumok (10,11,12) külső effektor mechanizmusokat alkalmazva pusztítják el a tumorsejteket. Bispecifikus antitestek (13) alkalmazása során a szervezet saját citotoxikus T sejtjeit lehet aktiválni és a célsejtekhez kötni szolid tumorok, leukémiák és limfómák esetében (14). A hagyományos monoklonális antitestek monospecifikus, bivalens antigénkötő molekulák, ezzel szemben a bispecifikus antitestek két Fab karja két különböző antigént képes felismerni. Ezáltal lehetővé válik az effektor sejtek tumorsejtekhez kötése, miközben az effektor sejtek aktiválódnak. Bispecifikus antitestek előállítása történhet kémiai úton (15,16), két úgynevezett szülői antitest összekapcsolásával vagy a két monospecifikus antitestet szecernáló hibridóma sejtvonal fúziójával, ún. hibrid-hibridóma (13) létrehozásával. A legtöbb alkalmazott bispecifikus antitest egyik karjával a T sejtek felszínén levő TCR/CD3 komplexhez kapcsolódik, míg a másikkal a tumorsejt egyik sejtfelszíni antigénjét ismeri fel, ezáltal a citotoxikus T sejteket aktiválva elősegíti a tumorsejtek lízisét (17,18,19). A T sejt receptor (TCR) feladata a major hisztokompatibilitási komplex (MHC) molekulához kötötten prezentált antigénfehérjék felismerése. A T sejtek aktivációját a T sejt receptoron keresztül a CD3 komplex mediálja. Azok a bispecifikus antitestek, amelyek egyidejűleg kötődnek a T sejteken levő CD3 molekulához és a célsejt által expresszált antigénhez, képesek a T sejt mediálta citotoxicitást és a célsejtek lízisét MHC-től független módon indukálni (20,21). A TCR/CD3 komplexen keresztül történő T sejt aktiváció limfokin szekrécióhoz, sejtproliferációhoz és a lítikus program beindulásához vezet (22). Ahhoz, hogy a T 9

10 sejteket a bispecifikus antitestek a tumorsejtekhez tudják kötni, a tumorsejt felszínén olyan célmolekulára van szükség, amelyet valamennyi tumorsejt erősen expresszál. Eddigi ismereteink alapján a B-sejtvonalhoz tartozó malignus betegségek egy részénél a CD19 és a CD20 a legmegfelelőbb célantigén (23,24). Vizsgálataink során két bispecifikus antitest, a CD3xCD19 és a CD3xCD20 hatását és alkalmazhatóságát vizsgáltuk in vitro modellben gyermekkori common akut limfoid leukémia (call) esetében. 10

11 4. CÉLKITŰZÉSEK 4.1. Az apoptotikus index szerepének vizsgálata prednizolon-kezelés alatt gyermekkori ALL-ben Vizsgálataink célja a prednizolonnal kezelt ALL-es gyermekek perifériás vérében az apoptotikus index meghatározása morfológiai és flow citometriás vizsgálattal A mérés optimális időpontjának meghatározása A két vizsgálati módszer eredményeinek összehasonlítása egymással és a klinikai szteroid-válasszal ALL-es és ALL-recidívás betegek esetében A betegek hosszú távú követésének eredményei az apoptózis-index változásának függvényében ALL-recidívás betegek apoptózis indexének összehasonlítása a klinikai szteroid-válasszal Bispecifikus antitestek előállítása, tisztítása és jellemzése A hibrid-hibridóma technikával előállított és megfelelően tisztított bispecifikus antitestek (CD3xCD19 és CD3xCD20) funkcionális aktivitásának vizsgálata B- és T-sejtvonalakon call-es gyermekek limfoblasztjainak fenotipizálása Akut limfoid leukémiás gyermekek perifériás vérből vagy csontvelőből származó blasztsejtjei sejtfelszíni antigén expressziójának vizsgálata az ideális célantigének kiválasztása céljából. 11

12 4.4. A perifériás vér limfocitáinak aktiválása Egészséges donorok vagy remisszióban levő call-es betegek véréből izolált perifériás vér mononukleáris sejtek aktivációs szintjének mérése bispecifikus antitest jelenlétében kostimulációs faktor hozzáadásával, ill. anélkül Az aktiváció kinetikájának vizsgálata az optimális antitestmennyiség és az optimális aktivációs időtartam meghatározása céljából A T-limfociták aktivációja során az aktivációs és adhéziós molekulák, T- és B-sejt antigének expressziójának mérése a sejtek felszínén flow citometriával A CD3xCD19 bispecifikus antitest által mediált lízis in vitro vizsgálata allogén és autológ rendszerben A CD3xCD19 bispecifikus antitest jelenlétében előaktivált T-sejtek tumorellenes hatásának vizsgálata allogén rendszerben A remisszióban levő call-es betegektől vett, előaktivált T-sejtek autológ blasztsejtekkel szembeni lizáló képességének meghatározása Az in vitro körülmények között effektív minimális antitestmennyiség és az optimális effektor-target sejt arány meghatározása. 12

13 5. IRODALMI HÁTTÉR 5.1. Akut limfoid leukémia A normál B és T sejtek differenciálódása során az antigénreceptorokat kódoló génszekvenciák átrendeződnek. A limfopoietikus malignus betegségek a fejlődés egy stádiumában megrekedt sejtek klonális expanziója útján jönnek létre. A sejtek osztódnak, ugyanakkor nem képesek a további differenciálódásra (25,26). A limfoid prekurzorok malignus transzformációjának egyik lehetséges oka a normális growth promoting protoonkogén transzlokációja a vonalspecifikus antigén-receptor génekre. Ez a protoonkogén deregulációjához vezet, amely így már valódi onkogénként működik (27). Az onkogén-aktiváció klasszikus példája a Burkitt-limfóma, amelynél a 8-as kromoszóma hosszú karján (8q24) lokalizált c-myc gén transzlokálódik a 14q32 immunglobulin nehéz lánc lókuszra (28). Az elmúlt évtizedben több non-hodgkin limfóma típusnál írtak le protoonkogén és tumorszuppresszor gén abnormalitásokat. A leggyakoribb humán limfóma, a follikuláris limfóma esetében a bcl-2 onkogén és a 14q32 közötti transzlokáció következtében termelődött fúziós fehérje hatására az apoptózis gátlása fokozódik, ezáltal nő a tumorsejtek élettartama (26,29-31). A t(14;18) transzlokáció a follikuláris limfómák több mint 80 %-ában kimutatható (32). A B sejtes akut limfoid leukémiák általában egyetlen B prekurzor-sejt malignus transzformációjával és ezt követő klonális expanziójával keletkeznek (33,34). Az a megfigyelés, hogy a B sejtek érése során az adott stádiumban megjelenő sejtfelszíni antigének jelen vannak a malignusan átalakult sejteken is - amelyek a fejlődés ezen stádiumában megragadtak - arra utal, hogy a limfoblasztok fenotípusa és immunogenitása normális társaikéhoz hasonló (23,35) Apoptózis Az apoptózis elnevezés és a jelenség első leírása (1972) két patológus, Kerr és Wyllie nevéhez fűződik (36). Ők írták le először a két fő sejtpusztulási mód; a nekrózis és az apoptózis közötti különbségeket (37). A szervezet homeosztázisának fenntartásában kulcsszerepe van a sejtek szabályozott keletkezésének és pusztulásának (38,39). Az egyensúly felbomlása 13

14 okozhatja a sejtek túlzott pusztulását (pl. neurodegeneráció, AIDS, autóimmun betegségek) vagy éppen túlzott felszaporodását (karcinogenezis, tumorprogresszió). A sejtek halála lehet passzív (nekrózis) vagy aktív folyamat (apoptózis). A programozott sejthalál kifejezést az irodalomban gyakran az apoptózis szinonimájaként használják, bár programozott sejthalál bekövetkezhet hosszú idővel a kiváltó tényező hatása után anélkül, hogy az apoptózis morfológiai jellemzőit mutatná. Az apoptózis olyan fiziológiás jelenség, amely során egy specifikus program aktiválódásával a sejt aktív szerepet játszik saját pusztulásában. Előfordul fiziológiás körülmények (183,184) között (pl. morfogenezis), de fontos szerepet játszik patológiás folyamatokban (pl. karcinogenezis) is. Az apoptózis folyamatát befolyásolva új utakat találhatunk a daganatos betegségek terápiájában (40,41,42) Morfológiai változások Az apoptózis során a sejtek jellegzetes morfológiai változásokon mennek át; lekerekednek, térfogatuk csökken, citoplazmájuk kondenzálódik. Ezzel egyidejűleg a sejtmagban is átalakulások mennek végbe. sejtfelszín hólyagosodása citoplazmatikus szegmentumok elkülönülése zsugorodás kondenzált kromatin kariopiknózis apoptotikus test 1. ábra Az apoptózis során bekövetkező morfológiai változások 14

15 A mag kondenzálódik, a kondenzált kromatin a maghártya alatt elhelyezkedő, ozmiummal erősen festődő szemcsés anyagból álló szaggatott sávnak, néhol félhold alakú sapkának tűnik. A mag ezt követően fragmentálódik és az apoptotikus sejtekben számos kondenzált kromatint tartalmazó, a magból származó vezikulum jelenik meg. A sejtek végül membránnal körülvett részekre esnek szét, amelyekben összetömörült citoplazmaorganellumok vagy kondenzált kromatinrészecskék különböztethetők meg. Végül az apoptotikus testekre széteső sejtet specifikusan felismerik és bekebelezik a makrofágok (43). Ezek a változások (1. ábra) mind fény-, mind elektronmikroszkóppal jól követhetők Biokémiai változások A morfológiai változások hátterében zajló biokémiai és molekuláris történések feltérképezése nagy előrelépést jelentett az apoptózis megismerésében (186). A folyamatot beindító különböző trigger mechanizmusok végül egy közös útba torkollnak. Az első biokémiai változások a plazmamembránban mennek végbe. Megváltozik a membrán foszfolipid-struktúrája. Ezt a változást ismerik fel a szomszédos sejtek és a makrofágok. Ezzel párhuzamosan a citoplazma savas kémhatású lesz, a mitokondriumokból pedig citokróm-c és datp szabadul fel, ami apoptoszómaképződéshez és a kaszpáz kaszkád aktivációjához vezet (44). A sejtmagban zajló változások hátterében az internukleoszomális kromatint hasító nukleáris endonukleáz aktivációja áll. Ez az enzim a DNS-t kb. 200 bázispár méretű fragmentumokra, DNSlétrákra bontja (45). Az így keletkező DNS-töredékek Northern-blottal és flow citometriás méréssel (46,47) egyaránt kimutathatók (2. ábra). Ez a jelenség minden apoptotizáló sejtben megfigyelhető. Azokban a sejtekben, amelyekben meghatározott inger váltotta ki az apoptózist mindig megfigyelhető egy látens periódus a korai morfológiai változások előtt. A látens szakasz - néhány perctől órákig tart - után a változások nagyon gyorsan lezajlanak: a sejtzsugorodás és fragmentáció ideje mindössze néhány perc (48). 15

16 S E J T S Z Á M Normál sejtek Apoptotikus sejtek DNS TARTALOM 2. ábra A DNS-tartalom változásának flow citometriás mérése limfoblasztok glukokortikoid-kezelését követő apoptózis során A sejtek apoptózisa előre meghatározott program szerint zajlik; endogén vagy exogén jelek indítják be a folyamatot, egy szenzor érzékeli a sejthalált indukáló jelet, a reakciók eljutnak addig a pontig, ahol a sejthalál véglegessé válik, a folyamat végbemegy, és a sejtmaradványok lebomlanak (49). A végrehajtó rendszert aktiváló szignálok mindegyikét bonyolult regulátor rendszer ellenőrzi (50,52). Emiatt ugyanaz a jel, amely egyik esetben apoptózist indukál, más esetben nem vált ki sejthalált. A kutatások fényt derítettek az apoptózis jelentőségére az organogenezisben (pl. testüregek, üreges szervek kialakulása), a sejtek, szövetek folyamatos működésében (elöregedett vagy felesleges sejtek eliminációja) és a génhibák kijavítására képtelen sejtek elpusztításában (183,184,187). Mivel a daganatok genetikai betegségek, amelyek keletkezésében a génhibák kialakulásának alapvető szerepe van, érthető az utóbbi funkció kulcsfontosságú szerepe a karcinogenezisben. A daganatok keletkezése során a sejtek korlátlan szaporodása által a szervezet számára idegen, új sejttömeg keletkezik. A sejtek folyamatos felhalmozódásában két tényező játszik alapvető szerepet; az apoptózist gátló tényezők erősödése és az apoptózist elősegítő tényezők gyengülése. 16

17 Apoptózis és kemoterápia Míg régen azt gondolták, hogy a daganatellenes kezelés a tumorsejtek alapvető biológiai funkcióit károsítja, mára ezt a hipotézist felváltotta a terápia által indukált programozott sejtválasz elmélete, amely szerint a daganatellenes terápia ugyancsak az apoptotikus program beindításával fejti ki hatását (51,185). Azok a mutációk, amelyek az apoptózis beindulását vagy lezajlását gátolják, a tumorsejtek gyógyszerrezisztenciájához vezethetnek. A jellegzetes morfológiai változások hátterében proliferációs és survival gének hálózata áll, amelyek különböző mértékben expresszálódnak egészséges és tumorsejtekben. Azok a mutációk, amelyek az apoptózis folyamatának beindítását vagy kivitelezését befolyásolják, nagy szerepet játszanak a tumorok keletkezésében is (53). A sejtek különböző módon reagálnak a citotoxikus és DNS károsodást okozó hatásokra a sejttípustól, a DNS károsodás formájától és mértékétől függően (58,188). A kemoterápiás szerek gátolhatják a DNS replikációt, membránkárosodást vagy szabadgyök-képződést okozhatnak. Bár ezek a gyógyszerek különböző módon fejtik ki hatásukat és különböző intracelluláris célpontjaik vannak, végül közös effektor mechanizmus útján indukálnak apoptózist. A citotoxikus gyógyszerek által indukált apoptózis morfológiai jelei megegyeznek a fiziológiás ingerek által okozott apoptózis során lezajló változásokkal. A sejthalál formája és kinetikája függ a sejtek típusától is. A hematopoietikus sejtvonal sejtjeinél rendkívül gyorsan, néhány óra alatt lezajlanak a változások. Ezzel szemben néhány szolid tumor sejtjeinél több, mint 24 óra szükséges ehhez A kaszpázrendszer aktivációja Az apoptózisra jellemző klasszikus morfológiai és biokémiai változások hátterében intracelluláris polipeptidek szelektív proteolitikus degradációja áll. Ezen polipeptidek hasítása egy intracelluláris cisztein proteáz család, a kaszpázok működésének következménye. A kaszpázok aktivációja két különböző módon történhet: a plazmamembránban elhelyezkedő halál-receptorok vagy a mitokondriumokból felszabaduló citokróm-c által. A legtöbb tumorellenes gyógyszer a kaszpázrendszeren 17

18 keresztül fejti ki hatását. A terápia indukálta apoptózis két úton jöhet létre: lehet receptor-függő vagy indukálhatja DNS károsodás (54,55) Receptorhoz kötött apoptózis A halálreceptorok olyan sejtfelszíni receptorok, amelyek a specifikus halálligandok által kiváltott apoptózist közvetítik. Molekuláris szinten a legjobban ismert halálreceptorok a Fas/CD95 (56,57,189), a tumor nekrózis faktor 1-es típusú receptora (TNFR1), a DR1-6 család. A TNF TNFR1-hez való kötődése például a szignálközvetítő molekulák - TRADD (TNFR1-associated death domain protein) és FADD (Fasassociating protein with death domain) - koncentrációját fokozza. Ez a komplex azután első lépésben a prokaszpáz-8 nevű sejthalál-proteázt aktiválja, beindítva ezzel egy proteáz kaszkádot, amely sejthalálhoz vezet DNS-károsodás indukálta apoptózis Ebben a folyamatban a p53 molekula játszik központi szerepet, bár léteznek p53- tól független utak is (188). Jelen tudásunk szerint a DNS-lánc sérülése kinázokat aktivál (pl. DNS-függő proteinkináz) és ez a p53 foszforilációjához és aktivációjához vezet. A p53 bonyolult rendszeren keresztül viszi tovább az apoptózis szignálját, amely végül a célgének - Bax, p53 által indukált gének (PIGs) - transzaktivációját eredményezi. A következő lépésről keveset tudunk. Ide tartozhat a mitokondriális membrán potenciálváltozása és a citokróm-c felszabadulása. Ez több lépésen keresztül végül a prokaszpáz-9 aktiválásához vezet, amely egy hasonló proteáz kaszkádot indít el. Ennek a folyamatnak a legfontosabb modulátora a bcl-2. A két iniciátor kaszpáz (kaszpáz 8 és kaszpáz 9) bármelyike képes hasítani és aktiválni az úgynevezett effektor kaszpázokat (kaszpáz 3, kaszpáz 6 és kaszpáz 7). Az a tény, hogy különböző ingerek végeredményben ugyanazt a kaszpáz kaszkádot aktiválják, megmagyarázza a különböző ingerek által kiváltott apoptotikus folyamat azonosságát. Számos regulátor mechanizmus mindkét utat egyszerre képes szabályozni. Az apoptózis folyamata igen bonyolult, teljes feltárásához további kutatások szükségesek. Ugyanakkor az elmúlt években az egészséges sejtek vizsgálatával a sejthalál folyamatáról szerzett információk lehetővé tették annak pontosabb megértését, 18

19 hogy a malignus sejtek hogyan tudják elkerülni az apoptózist. A tumorsejtekben számos antiapoptotikus változást írtak le; a halálreceptorok downregulációját, a prokaszpáz-8 downregulációját, stb. A mitokondriális apoptózis válasz megszakítása is a tumorsejtek szaporodását eredményezi. Az egyik ilyen lehetőség az antiapoptotikus bcl-2 fokozott expressziója, amely egyértelműen rossz prognózist jelent számos malignitás esetében. A bcl-2 úgy fejti ki antiapoptotikus hatását, hogy gátolja a mitokondriális citokróm-c felszabadulását. Ugyanez a hatása a bcl-2 család proapoptotikus tagjainak (mint pl. a Bax) vagy a kaszpáz-9 gén deléciójának. Az apoptózis hiánya daganatnövekedéshez vezet, ugyanakkor a tumorellenes gyógyszerek egy része az apoptózis fokozásával hat. Ez a gyógyszerek támadáspontjától függően mind receptorfüggő, mind mitokondriális hatásmechanizmussal történhet (182). A szövetek homeosztázisa mindig a sejtek szaporodása, differenciálódása és pusztulása közötti egyensúly függvénye. A szomatikus sejtek proliferációját pozitív és negatív szignálok hálózata szabályozza. Az apoptózis olyan magas szinten szabályozott folyamat, amely során a szervezet a számára felesleges sejteket eliminálja anélkül, hogy gyulladásos reakció alakulna ki. Az apoptózist és a proliferációt egyaránt a sejtciklust szabályozó molekulák irányítják. Az apoptózist kiváltó ingerek egyidejűleg hatnak a sejtproliferációra és a sejthalálra. A glukokortikoidok a sejtciklus G1 fázisában okoznak blokkot és apoptózist indukálnak a transzformált limfoid sejtekben. Bizonyos sejtciklus szabályozók - c-myc, ciklin D3 - csökkent expressziója alapvető fontosságú az apoptózis indukálásában, de más G1-regulátorok szerepéről is vannak adatok; pl. p53, prb, E2F. Többféle apoptózist kiváltó tényezőt ismerünk, amelyek egy része sejttípusspecifikus; növekedési faktorok elvonása, ionizáló sugárzás, TNF, vírusfertőzés, glukokortikoidok. Ezekre a hatásokra a sejtek programozott jelenségek sorozatát indítják el, amelyek végül a sejt pusztulásához vezetnek. Számos katalitikus folyamat indul be az apoptózis folyamán, beleértve a proteáz aktivációt, amely a sejtfehérjék lebontásához vezet és a nukleáz aktivációt, amely a DNS fragmentációját és az RNS degradációját eredményezi. A kaszpáz elnevezés egy olyan cisztein proteáz családot takar, amely az emlősök sejtjeinek pusztulásában effektor funkciót tölt be. Aktivációjuk következtében jönnek létre a jellegzetes morfológiai változások. 19

20 A tumorképződés hátterében a sejtproliferáció és -pusztulás egyensúlyának megbomlása áll. Tumor létrejöhet a sejthalál csökkenése vagy a sejtproliferáció fokozódása következtében. Például, ha a bcl-2 gén expressziója fokozódik, azért alakul ki tumor, mert a csökkent apoptózist nem ellensúlyozza a sejtproliferáció csökkenése Immunterápia malignus betegségekben Az irodalomból ismertek olyan esetek, amikor malignus tumorok spontán visszafejlődnek. Ha ennek a jelenségnek a magyarázatát ismernénk, sikerülhetne olyan immunterápiát találni, amely lehetővé tenné a malignus betegségek hatásos kezelését. Az immunológiai őrjárat (surveillance) elmélete (Thomas, 1959; Burnet, 1970) az immunrendszernek azon a funkcióján alapul, hogy a számára idegent felismeri és eliminálja. Valamennyire a malignus sejtek is idegenek a szervezet számára, az immunrendszer mégsem képes őket elpusztítani. Ha a természetes immunválasz mellett a tumorsejtek túlélnek, akkor az nem képes megakadályozni a tumornövekedést. Olyan terápiás beavatkozásokra van szükség, amelyek a tumorsejtek elleni immunválasz hatékonyságát fokozzák (62). Már a múlt században próbáltak olyan immunstimuláns szereket találni, amelyek az immunválaszt fokozva elősegítik a daganatos betegségek gyógyítását. Amikor a XIX. század végén észrevették, hogy egyes daganatos betegekben zajló bakteriális fertőzéssel párhuzamosan a tumor regrediál, két kutató - F. Fehleisen (Németország) és W. B. Coley (USA) - megpróbált végstádiumban levő daganatos betegeknél infekciót indukálni. Bár a tumorellenes válasz kialakult, nagy problémát jelentett, hogy a fertőzés súlyosságát nem tudták kontrollálni. Emiatt Coley 1893-tól kezdve elölt baktériumokat használt a daganatos betegségek kezelésére. Ezt a Coley-toxint 1934-ben az Amerikai Orvosi Társaság a daganatok szisztémás terápiájaként ismerte el. A szer klinikai alkalmazhatóságát toxikus mellékhatása és a kis hatékonyság korlátozta. Hosszú idő telt el jelentősebb eredmény nélkül, míg az 1970-es években le nem írták a TNF szisztémás tumorellenes hatását (63). Súlyos toxikus mellékhatása sajnos korlátozta immunterápiás jelentőségét (64). A humorális és celluláris immunválasz megismerése kapcsán ismét felmerült az effektív immunterápia kidolgozásának lehetősége. A kutatásban fontos mérföldköveket 20

21 jelentett a szövetkilökődés mechanizmusának, a limfokinek immunregulációban betöltött szerepének, az MHC-függő és ettől független lízisnek a megismerése. A technika fejlődésével lehetővé vált a folyamatokban résztvevő molekulák izolálása, tisztítása, genetikai módosítása, ami segített megérteni a szervezet immunreakcióit. Bár az elmúlt évtizedekben a sebészet, a kemoterápia és a sugárterápia egyaránt rohamosan fejlődött, mégsem sikerül valamennyi daganatos beteget meggyógyítani. Újra és újra felmerül a további terápiás lehetőségek szükségessége (65,66). Az immunterápiás próbálkozások két csoportba oszthatók. Az egyikben a gazdaszervezet tumorellenes immunitását fokozzák, a másikban tumorellenes hatású biológiailag aktív anyagokat juttatnak be a szervezetbe (67). A legtöbb tumor gyenge immunogén, mert nem expresszál rejekciós antigéneket. A humorális immunterápiában alkalmazott citokinek - beleértve az interferonok, interleukinek, tumor nekrózis faktor és a hematopoietikus növekedési faktorok különböző fajtáit - vagy a szervezet immunitását fokozzák, vagy közvetlen tumorellenes hatással rendelkeznek (64). Bár alkalmazásukkal néhány esetben sikerült tartós, teljes remissziót elérni, toxikus mellékhatásaik sokszor már a minimális hatásos dózisban is az életet veszélyeztették (63-65,68,69). Celluláris immunterápia esetében tumorellenes effektor sejteket; in vitro aktivált T sejteket (limfokin aktiválta killer sejtek [LAK], tumorinfiltráló limfociták [TIL]) vagy monocitákat juttattak a szervezetbe. Nehézséget jelentett ugyanakkor, hogy a LAK sejtek nem tudtak a nagyobb tumorokba penetrálni (70-72), ill. tumorellenes aktivitásukhoz IL-2 adására volt szükség (73). A TIL sejtek ezzel szemben könnyen eljutottak ugyan a tumorsejtekhez, de szeparálásuk rendkívül nehézkes volt (65,74,75). A tumorok sejtfelszíni antigénjeinek megismerésével lehetővé vált az ellenük termelt monoklonális antitestek alkalmazása a malignus betegségek immunterápiájában (65,8,76) Konjugálatlan antitestek A kemoterápia fejlődésével párhuzamosan jelent meg Köhler és Milstein közleménye (1975) a monoklonális antitesteket termelő hibridómákról (7). Ezzel a technikával normális, antitesteket szecernáló sejteket lehet mielóma sejtekkel fuzionáltatni és ezáltal a sejtvonalat halhatatlanná tenni. Mivel a monoklonális 21

22 antitestek a malignus hematopoietikus sejtek felszínén levő antigénekhez kötődnek, kezdetben rendkívüli optimizmussal tekintettek a szeroterápia felé, amely specifikusan célba veszi és elpusztítja ezeket a sejteket ben került sor az első klinikai kipróbálásra (6), s azóta több száz, malignus hematológiai betegségben szenvedő beteget kezeltek monoklonális antitestekkel. Bár sok hasznos, új információt sikerült szerezni az antigénekről és antitestekről, az általános klinikai tapasztalatok (a kevés sikeres próbálkozást leszámítva) inkább csalódást keltettek. A monoklonális antitest-terápia elve egyszerű, klinikai megvalósítása mégis bonyolult (9,77). Az elmúlt évtized során számos probléma vetődött fel a szeroterápiával kapcsolatban, mint például a tumorsejtek elérhetősége, a kezelés során jelentkező toxicitás és az a tény, hogy a beadott antitestek nem tudnak minden tumorsejtet elpusztítani. A problémák felismerése effektívebb terápia kidolgozásához járult hozzá (78-80). Nehézkes volt a monoklonális antitestek eljuttatása a célsejtekhez, mivel molekulasúlyuk mintegy 180 kd, tehát lényegesen nagyobb molekulák, mint a kemoterápiás szerek. Emiatt nehezebben diffundálnak a nagyobb kiterjedésű tumorokba. Emellett - például leukémiában - a nagyobb keringő tumorsejtmennyiség megköti a beadott antitesteket és ezzel elősegíti gyors eliminációjukat a keringésből. Az antiidiotípus antitestek, amelyek a malignus B sejtek felszínén levő egyedi idiotípusdeterminánsok ellen irányulnak, kötődnek a szérumban keringő, szabad idiotípushoz is (81). Olyan célantigénre van tehát szükség, amely nincs jelen szabad formában a keringésben. Az ideális célantigén nem megy át moduláción sem (ennek során az antigén az antitesttel való kötődést követően nem expresszálódik a sejt felszínén), mivel eltűnése a sejt felszínéről csökkentené a terápia hatékonyságát. Ideális esetben az antitest csak a tumorsejtekhez kötődik, nincs keresztreakció az egészséges szövetekkel. A nemspecifikus kötődés csökkenti a tumorellenes hatást. Amennyiben a keresztreakció mégsem küszöbölhető ki teljesen, ez nem érintheti az életfontosságú szerveket. A hematopoietikus sejtvonal daganatos betegségei esetén a célantigén nem lehet jelen a csontvelői őssejteken, hiszen ekkor a kezelés irreverzibilis csontvelő-károsodást idézne elő. 22

23 Az antitest a célsejtet elérve fejti ki citotoxikus hatását. Az antigén-antitest kötődés önmagában rendszerint nem elég a sejt elpusztításához, hacsak a célmolekula (pl. növekedési faktor) (193) nem létfontosságú a sejt túlélése és proliferációja szempontjából. Malignus B sejtek esetében az anti-idiotípus antitestek kötődése közvetlenül csökkenti a tumornövekedést (81,82). A konjugálatlan antitestek effektivitása az antitest természetétől és endogén citotoxikus mechanizmusokat aktiváló képességétől függ. A klinikai próbák többsége monoklonális egér antitesttel történt. Azt tapasztalták, hogy a különböző antitesttípusok és izotípusok különböző hatékonysággal aktiválják a komplement-rendszert és a humán effektor sejteket (83-85). A maximális citotoxicitás eléréséhez csökkenteni kell az antigénexpresszió heterogenitását. Ha a célantigén a malignus sejtpopuláció egy részéről hiányzik, reziduális malignus sejtekkel kell számolni. Ennek a problémának a megoldására az egyik lehetőség az antitest-koktél alkalmazása, amely többféle sejtfelszíni antigént ismer fel. Ha az antigén az antitest kötődése után megváltozik, az effektor sejtek hatásossága csökken. Az antigén-antitest komplex fixálása a sejt felszínén a komplement mediálta citotoxicitás effektivitását növelheti. A terápia hatékonyságát a sejtfelszíni antigénsűrűség is erősen befolyásolja. Ez abban az esetben okoz problémát, ha a maximális citotoxicitás eléréséhez bizonyos számú antigén megkötése szükséges, de túl kicsi az antigénsűrűség a sejt felszínén. Az antitest-antigén affinitásnak is döntő szerepe van. Nem szabad megfeledkezni a monoklonális antitest-terápia mellékhatásairól sem. Az eddigi tapasztalatok szerint a betegek egyharmadánál léptek fel kisebb mellékhatások; láz, hiperszenzitivitási reakciók, kiütések, viszketés, bronchospazmus. Anafilaxiás reakció alig fordult elő. A betegek többsége mellékhatások nélkül tolerálta az ismételt infúziókat. A nem specifikus kötődés akár azonnali, letális szervkárosodást okozhatna, de az eddig használt antitestek többségénél ez nem fordult elő (6,86-97). Annak ellenére, hogy a betegek immunszupprimáltak voltak, a kezelést követően humán anti-egér antitestek jelentek meg a betegek mintegy negyedében - a krónikus limfoid leukémiát (CLL) kivéve - valamennyi malignus kórkép esetében. Bár emiatt nem léptek fel mellékhatások, de az anti-egér antitestek kivonták a keringésből a hatásos egérantitesteket, így semlegesítették hatásukat. Ez a jelenség humanizált antitestek 23

24 alkalmazásával küszöbölhető ki. A humanizált antitestek előállítása során az egér immunglobulin (Ig) gén variábilis és hipervariábilis régióit humán Ig génnel kombinálják, így csökkentve az antigén-determinánsok számát ( ). Alternatív megoldásként a betegek immunszuppresszív kezelése is szóba jöhet ciklosporinnal vagy ciklofoszfamiddal, de ilyenkor a mellékhatásokkal is számolni kell. A több, mint 100 beteg részvételével végzett I. fázisú vizsgálatok és pilot study -k eredményei többnyire csalódást okoztak, de a terápia korlátainak megértéséhez is hozzájárultak ( ,202). A felvázolt problémák megkérdőjelezték a konjugálatlan antitestek hatékonyságát a tumorterápiában. A technológia fejlődésével sikerült monoklonális antitest-toxin (immuntoxinok), ill. monoklonális antitest-radionuklid konjugátumokat (radioimmunkonjugátumok) létrehozni, amelyek új perspektívákat nyitottak a szeroterápia előtt Immuntoxinok A konjugálatlan antitestek többsége gyenge citotoxikus hatással rendelkezett, ezért az antitestekhez olyan fehérjetermészetű toxinokat kötöttek, amelyek hatásosan el tudják pusztítani a daganatsejteket (10,11,98). Az így létrehozott immuntoxinok (199) citotoxikus hatása független a humán effektor rendszer aktivációjától. Az immuntoxinok in vitro és in vivo már nanomólos koncentrációban képesek elpusztítani a malignus sejteket. Míg a konjugálatlan antitestekből gyakran 1 grammos dózisra volt szükség, addig immuntoxinokból milligrammos mennyiségek már hatásosak voltak a kezelés során. A célantigén kiválasztásánál többnyire ugyanazok a szempontok érvényesülnek, mint konjugálatlan antitestek alkalmazásakor, de ebben az esetben lényeges, hogy a célantigénnek internalizálódnia kell az antitest kötődése után, hogy a toxin-komponens bekerüljön a citoplazmába (192,194). Szintén kritikus pont a toxin kiválasztása. Olyan toxinra van szükség, amely alacsony koncentrációban is kifejti hatását. A klinikai gyakorlatban a ricin, a diftériatoxin (DT), a Pseudomonas exotoxin (PE) és származékaik bizonyultak a leghatásosabbnak. 24

25 Fontos szerepe van a toxin és az antitest közötti kötődés stabilitásának. A toxin nem szabadulhat fel a keringésben, de föl kell szabadulnia a citoplazmában. Az elmúlt 10 évben az immuntoxinokat több alkalommal is kipróbálták a leukémiák és limfómák terápiájában. Az immuntoxinok alkalmazásának hasonló problémák szabnak határt, mint a konjugálatlan antitestek esetében. A terápiás dózis a toxikus mellékhatások miatt még kevésbé emelhető. A leggyakoribb és legsúlyosabb mellékhatás a capillary leak szindróma, amely a nem specifikus endotélkárosodás következménye. Az immuntoxinok is immunogén molekulák. Esetükben nemcsak az antitest, hanem a toxin ellen is antitestek képződhetnek a betegek szervezetében. Ugyanúgy, mint a hagyományos kemoterápiás szerek esetében, az immuntoxinokkal szemben is kialakulhat rezisztencia. Ezt immunotoxin-koktélok alkalmazásával lehet kiküszöbölni. Az eddigi in vitro és in vivo eredmények alapján az immuntoxinok kemoterápiával és sugárkezeléssel kombinálva vehetnének részt a kezelésben (99,100) Radioimmunkonjugátumok A radioaktívan jelölt antitumor antitestek számos előnyt jelenthetnek a konjugálatlan antitestek, ill. immuntoxinok alkalmazásával szemben. Klinikailag leginkább a -sugárzó részecskék hasznosak, mint pl. a 131 Jód 131 I és a 90 Ittrium 90 Y. A radioimmunkonjugátumok (12,101) nemcsak a célantigénnel rendelkező sejteket pusztítják el, hanem képesek a körülöttük bizonyos távolságban elhelyezkedő többi sejtet is megölni (191). Ezáltal sikerülhet kiküszöbölni a célantigén negatív sejtek problémáját. Ahhoz, hogy kifejtsék citotoxikus hatásukat, nincs szükség endocitózisra sem. A kezelés hatásosságának feltétele azonban a célsejtek radioszenzitivitása. Radioszenzitivitásuk miatt a leukémiák és limfómák ideálisak a radioimmunterápia számára. Az első radioimmunglobulin-terápiás kísérletekben látványos eredménnyel kezeltek ferritinben gazdag tumorokat (Hodgkin-kór, hepatoma) konjugált poliklonális anti-ferritin antitestekkel (102,103). De használtak limfoid és mieloid differenciációs célantigéneket is. Ez a terápia meglehetősen eredményesnek bizonyult, és a néhány esetben megfigyelt mieloszuppresszión és trombocitopénián 25

26 kívül csak enyhe, átmeneti mellékhatásokat észleltek (láz, hányinger, viszketés és 131 I alkalmazása esetén pajzsmirigy-diszfunkció). A radioimmunterápia hatásossága leginkább a tumor nagyságától, a keringésben jelenlevő célantigének mennyiségétől, és az antigénmoduláció gyakoriságától függ. A szplenomegália is csökkenti a kezelés eredményességét, mivel a hiperfunkciós lép kivonja az antitesteket a keringésből. Fontos, hogy olyan antitestet válasszunk, amely az antigénhez való kötődés után nem internalizálódik és nem bomlik le, mielőtt a megfelelő hatást kifejtette volna. Új radiojodinációs technikák bevezetése vagy radiometál izotópok alkalmazása ( 111 In, 90 Y) vezethet a megoldáshoz. Ugyanakkor a stabilabb konjugátumok létrehozásával megnövelt biológiai felezési idő az aspecifikus teljestest-besugárzást is növeli (104). A keringésben jelenlevő nagyszámú szolubilis célantigén a beadott antitestek egy részét megkötheti, ezáltal a terápia effektivitása csökken. Ennek kiküszöbölésére próbálkoztak már plazmaferezissel vagy jelöletlen antitestek preinfúziójával a radioimmunterápia előtt (105). A nagy antigénsűrűség a célsejtek felszínén feltétlenül előnyös a terápia szempontjából, ugyanakkor az antitestek specificitásával, aviditásával, izotípusával, formájával, eredetével kapcsolatban megoszlanak a vélemények. Az eddigi kísérletek és klinikai vizsgálatok bíztatóak voltak (191,200,201). Úgy tűnik, közvetlenül a tumorhoz juttatva nagyobb sugárdózist tolerál a szervezet, mint külső sugárforrás esetén. A hatás növelése érdekében azonban további változtatások lehetségesek. Meg kell határozni a radioimmunkonjugátumok maximális tolerálható dózisát önmagában és hematopoietikus növekedési faktorok adásával vagy csontvelőátültetéssel kombinálva. A további fejlődés útja lehet új konjugációs eljárások (stabilabb kelátok) kialakítása, az immunkonjugátumok penetrációjának fokozása és a kombinált alkalmazás Bispecifikus antitestek A tumorsejtek elleni immunválasz elsősorban celluláris természetű. Ezt a tényt kihasználva a bispecifikus antitestek alkalmazásával előaktivált T sejteket lehet a tumorsejtekhez kötni, amelyek azután a daganatos sejteket lizálják. 26

27 A hagyományos monoklonális antitestek monospecifikus bivalens antitestek, ami azt jelenti, két Fab-karjuk azonos célantigént képes felismerni. Ezzel szemben a bispecifikus antitestek (3. ábra) két különböző Fab-résszel rendelkeznek, ami lehetővé teszi, hogy egyik karjukkal egy T sejt markert, míg másik kötőhelyükkel egy tumorsejt antigént ismerjenek fel ( ,203). Előállításuk többféle módon történhet: kémiai úton (15,16) (két intakt monoklonális antitest vagy Fab -részek összekapcsolásával), hibridóma sejtvonalak fúziójával (13) (hibrid-hibridóma technika), ill. molekuláris genetikai módszerekkel (rekombináns géntechnika) ( ). CÉLSEJT Bifunkcionális heteroantitest Bispecifikus antitest Citotoxikus T SEJT 3. ábra Kémiai úton és hibridóma technikával előállított bispecifikus antitestek felépítése és működési elve A hibrid-hibridómákat Milstein és Cuello írta le először 1984-ben (13). A hibridhibridómák által termelt bispecifikus antitestek mennyisége elvileg a homológ nehéz és könnyű (H-L) láncok párképzésétől függ. Ez a kapcsolódás teljesen véletlenszerűen történik és viszonylag kis mennyiségű bispecifikus antitestet eredményez (4. ábra). A hibrid-hibridómák által termelt antitestek bonyolult szerkezete megnehezíti az antitestek tisztítását, pedig a tiszta, jól definiálható összetétel terápiás alkalmazásuk elengedhetetlen feltétele. 27

28 4. ábra Hibrid-hibridóma által termelt különféle antitestek A bispecifikus antitestek egyidejűleg kapcsolódnak a célsejthez és az effektor sejt citotoxikus reakciót aktiváló molekuláihoz (TCR/CD3 vagy Fc receptor), ezáltal a citotoxikus aktivitást a tumorsejtekre összpontosítják. Az effektor sejtek specificitásuktól függetlenül elpusztítják a célsejtet ben jelentek meg az első publikációk a bispecifikus antitestek in vitro hatásosságáról (20,21), azóta egyre ígéretesebb eredményekről számoltak be klinikai tanulmányokban is ( ). Ahhoz, hogy a terápia eredményes legyen, számos feltételnek kell teljesülni: 1. Megfelelően aktivált effektor sejtekre van szükség. 2. A monovalens kötődés (minimálisra csökkenti az antigénmodulációt) miatt nagy antigén-affinitás szükséges ahhoz, hogy stabil kapcsolat jöjjön létre az effektor és target sejtek között (119,120). 3. A célsejteket minél nagyobb százalékban kell az effektor sejteknek specifikusan lizálniuk, ugyanakkor nem szabad bekövetkeznie az effektor sejtek reciprok lízisének. A kísérletek igazolták, hogy a bispecifikus antitestek közvetlen lítikus (a target és effektor sejtek közvetlen kapcsolata miatt) és tumornövekedést gátló (a limfociták által termelt citokinek miatt) hatást is kifejtenek (121). 28

29 In vitro számos különböző tumornál - karcinóma (122), glióma (123), limfóma ( ), mieloid leukémia (127) - vizsgálták a bispecifikus antitestek tumorellenes hatását ( ). Más tanulmányokban bispecifikus antitestekhez kapcsolt vírussal fertőzték meg specifikusan a sejteket azáltal, hogy a célsejtek felszínén fixálták a vírust (109,128). További felhasználási lehetőség a toxinok és radioizotópok jobb célbajuttatása ( ), a sejtreceptorok szerepének és hatásmechanizmusainak kutatása (132), alvadásgátló gyógyszerek vörösvérsejtekhez kapcsolása (133). Az antitestek in vivo hatékonyságát először egér modellben ( ) igazolták, de azóta számos klinikai kipróbálásról is beszámoltak már (112,127, ). Megjelent néhány közlemény a CD3xCD19 bispecifikus antitest alkalmazásáról B sejtes malignus tumorban szenvedő felnőtt betegeknél (113,118,141) A célsejt antigénje: CD19 és CD20 CD19 A B limfociták érése többlépcsős folyamat, amely során számos különböző szignál szükséges a sejtek proliferációjához és éréséhez ( ). A különböző érési alakok egyre több sejtfelszíni antigénjét jellemezték már és ellenük egyre több antitestet írnak le (8,145), ami az immunterápia esélyeit nagymértékben növeli ( ). A CD19 B-sejt specifikus antigén, amely a plazmasejtek kivételével gyakorlatilag minden humán B sejtvonalhoz tartozó sejten jelen van. A CD19 antigén a CD22 és CD80 (B7) antigénnel együtt az immunglobulin szupergén család tagja (146,147). A CD19 egy komplex része, amely legalább 2 másik membránfehérjét; a komplement receptor 2-es típusát (CD21/CR2) és a TAPA-1 (CD81) molekulát is magába foglalja (148). A B sejt ontogenezis során a CD19 antigén rendkívül korán, még az immunglobulin nehézlánc génátrendeződését megelőzve expresszálódik. A CD19 antigén azután a B sejt-érés minden stádiumában jelen van, csak a B sejtek plazmasejtekké való differenciálódása során tűnik el (149). A CD19, mint szignál-transzdukciós molekula részt vesz a B sejtek proliferációjának és végső differenciációjának szabályozásában. A CD19 a B sejtek differenciálódásának mértékétől és a B-sejt aktiváció módjától függően pozitív és negatív szignált is közvetíthet (148, ). 29