Diplomamunka (BMEVEMKU999)

Átírás

1 A Mycobacterium tuberculosis His145Trp mutáns dutpáz enzimének karakterizálása, antagonista jelöltek sz rése Diplomamunka (BMEVEMKU999) A dolgozatot készítette : Nagy Péter, biomérnök hallgató (PDY7SZ) BME-VBK Témavezet : Dr.Vértessy Beáta, MTA doktora MTA-SZBK, Enzimológiai Intézet, Genom metabolizmus és javítás labor Bels konzulens: Dr. Suhajda Ágnes, tudományos munkatárs BME-VBK, Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék Budapest, december

2 Tartalomjegyzék Köszönetnyilvánítás 4 Rövidítések jegyzéke 5 1. Célkit zések 6 2. Irodalmi áttekintés A Mycobacterium tuberculosis jelenlegi kemoterápiája A dutpáz, mint ígéretes célfehérje A dutpáz szerepe az él szervezetben A dutpáz, mint új gyógyszeripari célmolekula A dutpáz szerkezete és reakciómechanizmusa Európai Uniós pályázati stratégia Sz r vizsgálati lehet ségek Szekvencia analízis, munkahipotézisünk Antagonisták és a dupnpp-szubsztrátanalóg Anyagok és módszerek Az M. tub. dutp-áz és a His145Trp mutáns M.tub. dutp-áz klónozása A fehérjék expressziója és feltárása Fehérjék tisztítási lépései Ni-ion oszlop affinkromatográfia Dialízis Membránsz rés Fehérje vizsgálati módszerek Gélelektroforézis, poliakrilamid gélelektroforézis Fehérjekoncentráció meghatározása Enzimaktivitás mérése két módszerrel Fluoreszcens spektrofotometria Sejtkultúrás kísérletek az antagonistákkal 41 2

3 4. Eredmények és kiértékelésük A fehérjék el állítása A His145Trp dutpáz fehérje aminosav összetétele A fehérjék koncentrációja Enzimaktivitás mérése két módszerrel Aktivitásmérés fenilvörössel Aktivitásmérés MESG-gel Az antagonisták és a dupnpp hatása az enzim aktivitására Az antagonisták köt désének fluoreszcens spektrometriai mérése Sejtkultúrás kísérletek eredményei Eredmények összefoglalása 62 Irodalom 63 3

4 Köszönetnyilvánítás Els ként szeretnék köszönetet mondani témavezet mnek Dr. Vértessy Beátának, aki lehet vé tette számomra, hogy kutatócsoportjában dolgozhassam, megismertetett a téma alapjaival és irányította a munkámat. Továbbá szeretném megköszönni Takács Enik nek, Varga Balázsnak, hogy a klónozási munkálatokban és az egyéb felmerül problémák megoldásában a segítségemre voltak. Friedrich Péter professzor úrnak, az Enzimológiai Intézet igazgatójának, szintén köszönöm, hogy engedélyezte munkámat az intézetben. Köszönöm az ELTE kutatóinak: Prof. Hudecz Ferencnek, Dr. B sze Szilviának, Horváti Katának ill. az Országos Korányi TBC- és Pulmonológiai Intézet munkatársának Dr. Nagy Nórának a munkáját. Végül köszönöm az egész kutatócsoportnak, hogy munkám során támogattak, mindvégig a segítségemre voltak és, hogy a felmerül problémákkal mindig fordulhattam hozzájuk. 4

5 Rövidítések jegyzéke ATP-áz adenozin trifoszfatáz BSA Bovine Serum Albumin (marhaszérum albumin) dntp dezoxinukleotid-trifoszfát DTT ditio-treitol dttp dezoxitimidin-trifoszfát dudp dezoxiuridin-difoszfát dump dezoxiuridin-monofoszfát DMF dimetil-formamid DMSO dimetil-szulfoxid dupnpp, -imino-dezoxiuridin-trifoszfát dutp dezoxiuridin-trifoszfát dutpáz (dezoxiuridin-trifoszfát)-nukleotid hidroláz EGTA etilénglikol-bisz-(b-aminoetiléter)-n,n,n',n'-tetraecetsav FPLC Fast Protein Liquid Chromatography (gyors fehérje folyadékkromatográfia) HEPES N-(2-hidroxietil)piperazin-N'-(2-etán-szulfonsav) IPTG izopropil-tio-galaktozid IPP inorganikus pirofoszfatáz IPP inorganikus pirofoszfatáz MES 2-amino-6-merkapto-7-metilpurin M. tub. Mycobacterium tuberculosis MESG PEG MMEE PNP PNP NaPi PEG PMSF SDS TES TRIS 2-amino-6-merkapto-7-metilpurin-ribonukleozid polietilén-glikol monometil-éter purin-nukleozid foszforiláz purin-nukleozid foszforiláz nátrium-foszfát puffer polietilén-glikol fenil-metil-szulfonil-fluorid nátrium-dodecil szulfát N-trisz(hidroximetil)metil-2-amino-etán-szulfonsav trisz-(hidroximetil)-aminometán A dolgozatban a drog, ligandum, inhibitor jelölt molekula, és az antagonista szavakat szinonimaként használom! 5

6 1. Célkit zéseink a következ k voltak: Diplomamunkám témáját egy Európai Uniós pályázati munka hívta életre, melyben az MTA Enzimológiai Intézetén kívül még hat intézmény vesz részt. A pályázat két évre szól és célja a Mycobactérium tuberculosis dutpáz enzimének karakterizálása és olyan sz r módszerek kidolgozása, melyek közepes illetve nagy átereszt képesség ek, így segítségükkel gyorsan és hatékonyan tudjuk sz rni az M. tub. dutpáz enzime ellen ható lehetséges antagonistákat. A lehetséges molekulák szerkezetét a SZTAKI és az ELTE Számítógép-tudományi Tanszékének informatikusai tervezik meg, számítógépes modellezés segítségével. Ebben a modellezési munkában a kiindulási adatbázis felöleli mindazokat a hatóanyag molekulákat, melyeket a gyógyászatban használnak napjainkban. 1. A Mycobacterium tuberculosis dutpáz vad típusú és mutáns enzim génjének klónozása és a fehérjék expresszáltatása, preparatív el állítása 2. Az M. tub. dutpáz enzim enzimológiai és fehérjeszerkezeti karakterizálása, UV-VIS és floureszcens spektrofotometriával. 3. Enzimkinetikai mérések végzése arra vonatkozóan, hogy gátolják-e az M. tub. dutpáz enzimet az antagonisták. 6

7 2. Irodalmi áttekintés A Mycobacterium tuberculosis jelenlegi kemoterápiája A bakteriális és vírusos járványok még mindig nagy egészségügyi kockázatot jelentenek az emberiségre nézve. A rezisztens kórokozók következtében azok a gyógyszerek, amelyek hosszú ideig hatékonynak bizonyultak, egy id után hatástalanná válnak. Az antibakteriális és antivirális hatóanyagokat tartalmazó gyógyszerek használata a baktériumtörzseket fokozott, egyedfejl désre ösztönzi. Így az egyes baktériumok képesek a jelenleg használt gyógyszerek jelenlétében is életképesek maradni. Ezért fontos a folyamatosság az antibakteriális szerek fejlesztésében. A mutációk kijátszásához összetett gyógymódok szükségesek, amelyek eltér hatásmechanizmussal rendelkeznek, és hatásuk egyértelm en és gyorsan összehasonlíthatóak. Mindez lehet vé tenné, hogy a lehetséges molekuláris célpontok között valódi választási lehet ség álljon fel. A néhány molekuláris célpontra való összpontosítás helyett, eredményesebbnek bizonyulhat, ha kombinált terápiával egyszerre több célpontot támadunk. E tekintetben, a fehérjék, mint célmolekulák széleskör lehet séget biztosíthatnak. A célfehérje azonosítása nagy kihívást jelent a molekuláris biológusoknak, genetikusoknak és enzimológusoknak. Kutatásunk legfontosabb célja, hogy új módszereket keressünk a célpontok azonosításához, valamint, hogy potenciális ellenszereket keressünk. Ebben a munkában számos tudományterület ill. határtudomány is szerephez jut: a számítástechnika, a bioinformatika, a biofizika, a fizikai-kémia, valamint molekuláris biológia. Jelen esetben az M. tub. dutpáz enzimén végezzük a kísérleteket. A Mycobacterium tuberculosis a tuberculosis (TBC) nev betegség kórokozója, ami egy Gram-pozitív baktérium, amely a fejlett és fejl d országokban egyaránt súlyos egészségügyi problémát jelent. A hordozókban jó néhány évig vagy akár évtizedig is lappanghat a kórokozó anélkül, hogy tüneteket okozna, így a hordozó tudta nélkül, el segíti a betegség légutakon keresztül való terjedését, hiszen ezek a páciensek már bármerre utazhatnak a világban. Az els terápia elég gyakran sikeresnek ígérkezik, mert a súlyosabb tüneteket gyorsan kezeli. Ahhoz azonban, hogy a baktérium teljesen elt njön a beteg szervezetéb l, egy jóval hosszabb komplex gyógyszeres kezelésre van szükség. Azok, akik nem tartják be a szigorú gyógyszeres kezelést, el segítik a multirezisztens törzsek kialakulását, amelyeket aztán nehezebb 7

8 elpusztítani. Nem véletlen, hogy számos országban hosszú ideig kötelez volt a tüd baj (Mycobacterium tuberculosis-al való fert zöttség) sz rése. A betegség terjedését sikerült az 50-es évekre megállítani ill. a széleskör sz réseknek köszönhet en kordában tartani, azonban a XX. század második felében újra növekedésnek indult. A WHO az elkövetkezend évtizedre 200 millió TBC-s beteget prognosztizál. (forrás:who). A fert z betegségek között a halálozási arányát tekintve az AIDS után a tuberculosis a legsúlyosabb. A M. tub. legf bb DNS polimeráza olyan enzim, ami a DNS-hibákat jól tolerálja, így lehet séget ad a mutációk kifejl désének. Ez az enzim fontos szerepet játszik a baktérium gyors evolúciójában (1), (2). Ezen okokból kifolyólag a baktériumnak kiemelked en nagy a mutációra való hajlama és a nem megfelel gyógyszeres kezelés következtében a multirezisztens M.tub törzsek könnyebben kifejl dnek. A M.tub genomját napjainkra szekvenálták és leközölték (3). Néhány M.tub. fehérjét nagy felbontó képesség szerkezeti vizsgálatnak vetettek alá és jelenleg 72 darab különböz háromdimenziós fehérje (többségében enzim) szerkezet érhet el a fehérje adatbankból, ami jóval több támadási felületet jelenthet, mint amit a jelenleg alkalmazott 4 db TBC ellenes szer lefed. Napjainkban a következ négy gyógyszert alkalmazzák a tuberculosis elleni kezelésekben: streptomycin, rifampicin, isoniacid és pyrazinamid. A streptomycin a bakteriális riboszómát támadja meg (5). Köt helye a riboszómális alegységek határfelületén található. A rifampicin szintén elterjedt a tuberculosis elleni gyógyászatban. A legtöbb rezisztens mutáns esetén a mutáció az RNS-polimeráz béta alegységét érinti (6). Az izoniacid támadási pontja az enoil-reduktáz enzim, amelynek a mikolsav bioszintézisében van szerepe. A mikolsav származékok a Mycobacterium sejtfal szintéziséért felel sek (7). Az izoniacid rezisztencia hátterében a kataláz-peroxidáz inaktivációja áll. A kataláz-peroxidáz felel s az izoniacid el anyagának biológiailag aktív anyaggá való átalakításáért (8). A kataláz-peroxidáz hiánya együtt jár egy emelkedett alkilhidroxi-peroxidáz termeléssel. Az alkilhidroxi-peroxidáz aktivitás a kataláz-peroxidáz hiányában védelmet nyújt az antioxidánsok ellen. Az alkilhidroxi-peroxidáz aktivitásért felel s enzimek szintén újszer célpontok lehetnek az új Mycobacterium elleni ellenszerek kifejlesztésében (9). A pyrazinamid, ami szintén egy prodrog az izoniacidhoz hasonlóan, in vivo célpontját eddig még nem sikerült azonosítani de számos, az emberiséget sújtó betegség esetén figyelemre méltó hatékonysággal alkalmazzák. A pyrazinamid elleni rezisztenciáért legf képpen a pnca gén mutációja felel s. Ez a gén egy olyan fehérjét kódol, amelynek pyrazinamidáz aktivitása van. A pyrazinamidáz enzim alakítja át a prodrog pyrazinamidot az aktív hatóanyaggá (10),(11). 8

9 Az egyik f probléma a fent említett gyógyszerekkel, hogy léteznek olyan M.tub. ágensek, amelyekre teljesen hatástalanok. Másodsorban ezeknek, a gyógyszereknek a használata egyfajta átfogó ismeretet és orvosi rutint igényel. A kezelést nem könny követni fert zött populációban f leg abban az esetben, ha a betegek nem értik meg, hogy a gyógyszereket akkor is szedni kell, ha már a közérzetük javuló tendenciát mutat. Harmadszor ezek a meglehet sen hosszú és komplex gyógyszeres terápiák nagyon drágák. Negyedszer különböz mellékhatások is jelentkezhetnek, (a közepes rizikófaktorúaktól a magasig, mint például a májgyulladás) legf képpen érzékeny betegek esetén, akik legyengült immunrendszerrel rendelkeznek és/vagy nincsenek optimális tápláltsági állapotban. Végül ötödször a gyógyszeres kezelést hetenkénti vérvétellel és májfunkció vizsgálattal kellene összekötni, ám ezek a tesztek költségesek továbbá az aktív együttm ködés az orvos és a páciens között elengedhetetlen. Mindebb l jól érzékelhet, hogy az újszer gyógyszeres kezelések rendkívül fontosak (12) A dutpáz, mint ígéretes célfehérje A dutpáz szerepe az él szervezetekben A dezoxiuridin trifoszfát nukleotidhidroláz (dutpáz) enzim a dutp hidrolízisét katalizálja dump-vé és inorganikus pirofoszfáttá az alábbi reakció alapján: dutp + H 2 O dump + PP i + 2H + A reakcióban a dutpáz enzim kofaktora a Mg 2+ ion (13),(14). A reakció a nagy energiájú foszfát hidrolízise miatt gyakorlatilag irreverzibilis. Ezzel a reakcióval az enzim lecsökkenti a sejtben a dutp szintet, miközben termeli a dump metabolitot, ami a dttp bioszintézisének alapvet prekurzora (a timidilát szintáz szubsztrátja). A dutpáz így m ködésével szabályozza a dutp/dttp szintet, alacsonyan tartva a dutp koncentrációját a sejtben. A DNS megkett z dés hibátlan kivitelezéséhez elengedhetetlen a nukleotidok megfelel arányának és koncentrációjának szabályozása, ezért a dutpáz élettani szerepe kiemelked en fontos és nélkülözhetetlen (15). A DNS-polimeráz adeninnel szemben azonos valószín séggel épít be uracilt és timint, mivel a két bázis közti különbséget -a metilcsoport meglétét, illetve hiányát- nem érzékeli. 9

10 Ezért a dutpáz enzim hiányában kialakuló magas dutp koncentráció uracilbeépülést eredményez a DNS-be. A DNS szekvenciában számos környezeti hatás változást, mutációt eredményezhet. A mutációk kiküszöböléséhez a génállomány folyamatos ellen rzésére és javítására van szükség. Erre a DNS-ben több javítómechanizmus is kialakult (pl.: a timidin dimerek kivágása, a nem komplementer bázispárok kivágása, stb.), melyek a már bekövetkezett módosítást észlelik és kijavítják, de megel zni nem képesek. Így a DNS-ben megjelen uracilt a sejtek hibaként érzékelik, és a báziskivágáson alapuló javítómechanizmus segítségével távolítják el. Ez a gyakori hiba kétféle folyamat eredményeként jelenhet meg a DNS-ben (16): a már említett magas dutp koncentráció miatti timin helyére történ beépülés, valamint a citozin spontán, oxidatív dezaminálása révén (17,18). A citozinból képz d uracil (1. ábra) káros, mivel a következ replikáció alkalmával guanin helyett adeninel alkot bázispárt és így örökletes pontmutáció jelenik meg a genetikai anyagban. Mivel a sejt nem tudja, hogy a DNS-be beépült uracil ártalmatlan (timin helyettes), vagy mutagén (citozinból képz dött) (19), (20), (21), ezért minden uracil eltávolítása szükséges a genetikai információ meg rzéséhez. H C N N C C O C N N C H N H H H N C N H C C H C N C 1 ' O c itozin oxid atív d ezam inálás O H H C C C N C N O urac il H C 1 ' C 1 ' H guanin C H 3 H N C N C 1 ' H C C N H C N N C ad enin H O H C C C H N C N C 1 ' O tim in (5-m etil-urac il) 1. ábra Citozin dezaminálása és a bázisok bázispárosodási tulajdonsága 10

11 Ezért a timin helyére való uracilbeépülést a dntp szintek pontos szabályozásával kell a sejtnek kivédenie, amit a dutpáz enzim kétfel l is biztosít. A dutpáz enzim hiányában, az osztódó sejtben a magas dutp/dttp arány jelent s uracil tartalmú DNS szintézisét okozza. Ez aktiválja az uracil kivágásán alapuló javítómechanizmust. A javítás azonban a továbbra is fennálló magas dutp/dttp arány mellett nem lehet sikeres, mert a DNS-polimeráz a kivágott uracil helyére újra uracilt épít be. Az így megnövekedett uracil tartalom feler síti a hiábavaló javítómechanizmust (hiperaktív m ködés), és kett sszál törésekhez, kromoszóma fragmentálódáshoz, majd a sejt halálához vezet (15), (22). Ezt a jelenséget más néven timinmentes sejthalálnak nevezik (2. ábra) (22). 2. ábra A dutpáz szerepe a dttp bioszintézisében és a DNS uracil mentességének biztosításában. A dutpáz enzim tehát kett s szerepet játszik a sejt normális m ködéséhez szükséges DNS integritás meg rzésében (3. ábra). Egyrészt megel zi a hibásnak min sül, ártatlan uracil tartalmú DNS létrejöttét, vagyis preventív hibajavító-funkcióval rendelkezik (11). Másrészt szerepe van a DNS hibajavításához és a DNS szintéziséhez egyaránt szükséges 11

12 nukleotid épít elemek megfelel szabályozásában. arányának biztosításában: részt vesz a dttp szint 3. ábra A dutpáz kulcsszerepe a dttp de novo szintézisében és a dutp szint csökkentésében (12) A de novo útvonal els dleges metabolitja az UMP (középszürke háttéren), mely glutamin, bikarbonát és ATP kiindulási anyagokból, hat enzim segítségével jön létre (az ábrán nincs jelölve). Az UMP képezi a kiindulási anyagot a többi pirimidin ribo- és dezoxiribonukleotid szintézise számára. A kinázok általában a foszfátlánc hosszára, a reduktázok pedig a cukorra nézve specifikusak csupán, míg a bázisok átalakítását katalizáló enzimek a cukor, a foszfát és a bázis részre egyaránt specifikusak. A pontozott vonallal jelölt útvonal csupán egyes prokariótákban (pl. E. coli) létezik, míg a szaggatott nyíllal jelölt dcmp dezamináz enzim az enterobaktériumokból hiányzik, de eukariótákban megtalálható. A dutp/dttp arány szabályozásának két kulcsenzime: a dutpáz és a timidilát szintáz (sötétszürke háttérrel, bekarikázva látható). 12

13 A dutpáz, mint új gyógyszeripari célmolekula A dutpáz enzim szerepe alapvet fontosságú az aktív DNS szintézist folytató sejtekben (23),(24). Ennek megfelel en az enzim jelenléte és aktivitása a sejt ciklusától és a szövet fejl dési állapotától függ módon szabályozódik (25),(26). A dutpáz enzim specifikus gátlásának lehet ségével sejtpusztulás indukálható, amellyel terápiás hatást érhetnek el a rákos, vagy egyes bakteriális és vírusos, fert z megbetegedések esetén. A rákellenes terápiákban, széles körben alkalmazzák a timidilát bioszintézisért felel s enzimeket gátló gyógyszereket. Mivel már a rákos sejtek kialakulása is nagyrészt annak tudható be, hogy a programozott sejthalál (apoptózis) útvonala bennük jelent s részben gátolt folyamat (27). Ezek közül is a legismertebb a timidilát szintetázt blokkoló fluorouracil, valamint a dihidrofolát- reduktáz gátlásáért felel s methotrexát, amelyek jelent s mértékben növelik a sejtben található dutp/dttp szintet (4. ábra), (28). Ez a hatás az aktív DNSszintézist folytató - például tumoros, illetve vírus által fert zött - sejtek esetében timinmentes sejthalálhoz vezet. Megfigyelték, hogy az említett gyógyszerek alkalmazása estén rezisztencia alakulhat ki, ami összefüggésbe állhat a kezelt sejtvonalakban kimutatható er sen megemelkedett dutpáz aktivitással. Az is bizonyítást nyert, hogy a dutpáz-szint genetikai manipulálással el idézett növelése egyes humán tumoros sejtvonalakban fluorouracil rezisztenciát vált ki (29),(30), valamint a dutpáz hiánya érzékenyebbé teszi a sejteket a timidilát szintázt gátló szerekre (31). A legújabb kutatási eredmények szerint a dutpáz enzim, a multidrog rezisztencia kialakulásában is részt vehet (32). A dutpáz antagonizmus esetleges kemoterápiás hatására utal az a tény is, hogy szubsztrát analóg inhibitorok humán rákos sejtvonalakon ugyancsak szelektív gátló hatással rendelkeznek, in vitro (33). A legfrissebb szakirodalomban publikált eredmények szerint a timin mentes sejthalál útvonala független a p53 fehérjét l (30), (34), így az apoptózis e formáját indukáló szerek p53 mutáns sejtekben is gyógyulással bíztató eredményeket produkáltak. A dttp bioszintézis els lépését gátló dutpáz antagonista hatékony alternatívát nyújthat a p53 funkció vesztett, valamint a fluorodezoxiuridinre rezisztenssé vált daganatok esetében is. 13

14 dutpáz antagonisták dutp dutpáz dump THF DNS Fluorouracil (FdUMP) TS DHF reduktáz Methotrexát dttp dtdp dtmp dihidrofolát 4. ábra Timin metabolizmus. Timin-mentes sejthalál a kemoterápiában. Timin-mentes sejthalál indukálásával ható napjainkban alkalmazott kemoterápiás szerek és célpontjaik a timin metabolizmusban. A dutpáz gátlása kiegészít vagy önálló terápiaként ígéretes. A dutpáz tehát fontos célpont a kemoterápiás gyógyszermolekula tervezések számára is, ezért szükséges az enzim minél pontosabb strukturális és funkcionális megismerése. A különböz kísérletekbe bevont fajok dutpáz enzimének karakterizálása, az aktív centrumban szerepet játszó aminosavak pontos térbeli elhelyezkedésének megismerése, mind hozzásegíti a kutatókat a kés bbi terápiás alkalmazásokhoz. A Mycobacterium tuberculosis evolúciója során szoros kapcsolatot alakított ki az emberi szervezettel ill. a humán szervekkel, amelyeken kívül nagymértékben életképtelennek tekinthet. Jelen dolgozatomban azonban csak a dutpáz enzimének és annak kapcsolatrendszerét vizsgálom. Az 5. ábrán nukleotidok átalakulása figyelhet meg. Az emberi szervezetben a sejtek a dtmp t több úton is el állíthatják úgymint: dcmp-b l, dutp-b l, timinb l, ezzel szemben a M.tub. csak a dutp-b l képes a dtmp-t szintetizálni, amit kizárólag a dutpáz enzim szintetizál dutp-b l. Tehát a M. tub. dutpáz enzimének esetleges gátlása esetén, az egyetlen útvonal is elzáródhat a dtmp szintetizálódása el tt. Így nem is alakulhat ki dttp, ami a DNS szintézisekor hiányozni fog. Ez végül a baktérium pusztulásához vezethet. 14

15 DNS polimeráz deamináz útvonal deamináz dutpáz Timidilát szintáz timidin Nukleozid difoszfát kináz és dtmp kináz Timidin kináz 5.ábra A M. tub. genomja sem a dcmp deamináz sem pedig a timidin kináz génjét nem tartalmazza, így nincs alternatív útvonal a dump keletkezésére, csak a dctp deamináz és a dutpáz által meghatározott dctp dutp dump útvonal létezik. 15

16 2. 3. A dutpáz szerkezete és reakciómechanizmusa A dutpáz enzimek negyedleges szerkezetük alapján legáltalánosabban homotrimer szervez dés ek, megtalálhatók a prokariotákban, az eukariótákban és a legtöbb vírusban egyaránt (36),(37) (6. ábra). Minden dutpáz enzimben öt konzervált szekvencia motívum található, melyek az aktív centrumban, vagy annak közelében helyezkednek el. Különféle fajokból származó dutpáz enzimek szekvenciája nagy hasonlóságot mutatnak az aktív centrum felépítésében és a magas szubsztrát-specifitásban (38). Monomer B Monomer C Monomer A 6. ábra A trimer dutpáz szerkezete. Az enzim egy szimmetrikus trimer, amelynek alegységei 152 aminosavból állnak (38), (39). A különböz enzimek alegységeit alkotó peptid láncok hosszúsága különböz lehet, de szerkezetük mégis jól fedésbe hozható egymással, néhány huroktól eltekintve. A különböz organizmusokból származó dutpázok között a korlátozott szekvencia azonosság a jellemz, mégis minden igazoltan dutpáz aktivitással rendelkez és dudp hidrolízist nem katalizáló fehérjében megtalálható az öt konzervált szekvencia motívum (38). A dutpáz enzimek többsége homotrimer enzim, azaz három teljesen azonos polipeptid láncból áll. Ez a trimer szervez dés viszonylag ritka az enzimek körében. További 16

17 érdekessége a szerkezetnek, hogy három szimmetrikus aktív hely található benne, és mindegyik kialakításában mindhárom fehérjealegység részt vesz (6. ábra). A fehérje alegységek harmadlagos szerkezete egy nyolcszálas ún. lekváros tekercs (jelly roll) -hordó, melyben az egyes szálakat -kanyarok kötik össze. (7. ábra). 7. ábra A tekercsszer szervez dés ideális esetben (A) és dutpázoknál (B).A: a -szálak összerendez dése ideális esetben, B: a -szálak kapcsolódása dutpázoknál. Az aktív centrumok, a kristályszerkezetek alapján, az alegységeket elválasztó felszíni mélyedésben találhatók, kialakításukban a három alegység a következ módon vesz részt; (8. ábra): Az egyik fehérjealegység a 3. szekvencia motívumból származik (8. ábra, a kék Tyr82), az a torzult antiparalell -hajt, ami az uracil koordinálásáért felel s. Az uracil beékel dik a -hajt be és a DNS-ben megszokott bázispárosodási hajlamnak megfelel en hidrogén-hidakkal kapcsolódik a f lánc-atomokhoz. Ez a bázis felismerési mechanizmus nagymértékben specifikus (40). 17

18 Asp26 Arg62 Arg130 Gln108 Asp79 Phe135 Tyr82 8. ábra Az, -imino-dezoxiuridin-trifoszfát (dupnpp) szubsztrátanalóg köt dése a dutpáz aktív centrumába A három alegység polipeptidláncát a zöld, kék és sárga szalagmodell mutatja. A centrumba köt d,, -iminodezoxiuridin-trifoszfát molekulát pálcika modell mutatja (atom szerinti színezés: C: szürke; N: kék; O: piros; P: narancs). A Mg 2+ kofaktor -ami a három foszfát csoportot koordinálja-lila van színnel jelölve. A másik fehérjealegység -hélix régiójának arginin és szerin aminosav oldalláncai, hidrogénkötéseket létesítenek a szubsztrát -foszfát csoportjának oxigénjével (8. ábra, 2. konzervált szekvenciamotívum, sárga Arg62). A harmadik alegység a C-terminális végével az aktív hely fölé hajlik, létrehozva ezzel az enzim zárt konformációját. Ez a C-terminális (kar) régió - ami minden alegységb l kilógva a másik alegységhez nyúlik át - a legtöbb kristályszerkezetben nem látszik, mivel az enzim ezen része flexibilis, és ezért nem lokalizálható. Itt helyezkedik el az 5. szekvencia motívum (8.ábra, zöld alegység). A jelenlegi irodalmi adatok szerint ez a szegmens a - és -foszfát csoportok pontos koordinálásában és az - foszfátkötés hasításában játszik valamilyen, részleteiben egyel re ismeretlen szerepet (40),(41). 18

19 Az enzim katalitikus mechanizmusáról szolgáltatnak fontos információt a 2004-ben közölt kristályszerkezeti elemzések (42). Ezekben a szerkezetekben azonosítható volt az a vízmolekula, amely a reakció indításáért felel s nukleofil támadásban vesz részt. Ezt a vízmolekulát (melyet 10. ábrán nucleophilic water elnevezéssel, és 336-os sorszámmal van jelölve), egy szigorúan konzervált aszpartát oldallánc koordinálja (Asp83 a 8. ábrán). A reakció sematikus lejátszódását szemlélteti a 9. ábra. Mg 2+ Mg 2+ E E-S + E-P + 2H + Apo-enzim Nukleofil támadás Reakció termékek 9. ábra A vízmolekula nukleofil támadása és szubsztrát átalakulása látható. 19

20 10. ábra Az M. tub. dutpáz katalitikus mechanizmusa kristályszerkezeti eredmény alapján. (a) Az aktív centrum sztereo ábrázolása. Az, -imino dutp atomok színei a megfelel atomok színei szerint vannak jelölve (C-fehér, O-piros, N-kék, P-sárga). Az aminosavak a konzervált motívum szerint vannak színezve. 1. számú motívum- kék, 2. számú motívum- zöld, 3. számú motívum- sárga, 4. számú motívumnarancssárga és az 5. számú motívum- piros. Az aktív helyet a három alegység együtt alkotja. Az 1, 2 és 4-es motívum kialakításában az A alegység m ködik közre, a 3. motívum felépítésében a B alegység, az 5. motívumban a C alegység. (b)-elektrons r ségi térkép a ligand, Mg 2+ és a koordinált víz molekulákra. (c)-a dutpáz reakció mechanizmusának sematikus ábrája. Az -foszforatomon a nukleofil támadást indító 336. sorszámú vízmolekula oxigén atomjáról sematikus nyíl indul ki. 20

21 2. 4. Az Európai Uniós pályázat stratégiája Ebben a részben vázlatosan mutatom be a diploma dolgozatom alapját nyújtó Európai Uniós pályázatot, és utalok a kapcsolódási pontokra. A pályázat legfontosabb célja egy olyan protokoll kifejlesztése, melynek segítségével lehet ség nyílik újszer gyógyszermolekula köt helyek és gyógyszer-fehérje komplexek azonosítására a Mycobacterium tuberculosis fehérjéken keresztül. Jelenlegi tudásunk az emberi genomról és a fehérjeállományról új kombinált keresést tesznek lehet vé a gyógyszermolekulák között. A felfedez technikákat gyakran nagy átbocsátó képesség módszerekként emlegetik. Ám kizárólag ezeknek, a kísérleteknek (megfelel en szilárd biológiai háttér nélkül) a lefolytatása alkalmatlan a gyógyszerkutatáshoz. Az EU-s pályázatban egy olyan eljárást szeretnénk kidolgozni, amelynek két f összetev je van. 1.) Olyan módszer kidolgozása, melynek középpontjában egy algoritmikus megoldás áll, amely arra képes, hogy feltérképezze a fehérje felületét, lehetséges köt helyeket keresve, a fehérje háromdimenziós képének segítségével. A legújabb adatokra és információkra támaszkodva, nagy átereszt képesség módszert használunk, amely páronként végzi a vizsgálatot. A két legfontosabb fázisban várunk ellenszer-fehérje párokat; az érdes felület els fázisban (Silico 1) és a még durvább második fázisban, a dokkoló mérésben (Silico 2). Ezt a programot a pályázat matematikus és informatikus résztvev i (ELTE, SZTAKI) hajtják végre. 2.) Egy szerkezeti és molekuláris biológiai eljárás kidolgozása, annak érdekében, hogy a gyógyszer-fehérje párok minél jobban illeszkedjenek. Az eljárásban variáljuk a közepes és alacsony átereszt képesség módszereket. Minden javasolt fehérjéhez körülbelül 1000 javasolt antagonista (=inhibitor jelölt molekula, drog, ligandum) van. Ezen párokra, az Enzimológiai Intézet enzimológiai és funkcionális sz r vizsgálatokat tervez és hajt végre. 21

22 Sz r vizsgálati lehet ségek 1.) Gyors és kvantitatív enzimaktivitási mérési módszer kidolgozása ligandumok hatásának vizsgálatára. A folyamatos mérésekhez egy UV-VIS spektrofotométert alkalmazunk, amellyel a spektrális jelek hiányában az enzim reakciókat páronként futtatjuk. Az enzim reakciók többsége ph változással jár. Ezért ha enyhén pufferolt indikátoros próbát alkalmazunk, akkor a változásokat nagyon érzékeny módszerekkel is követni lehet. Ha az egyes gyógyszerek er s bázisos vagy savas karakter nek bizonyulnak, akkor a só formájuk indikátor alapú enzim vizsgálatokhoz használható fel. Körültekint en megtervezett, kikísérletezett és nagy átereszt képesség tesztek segítségével a Mycobacterium tuberculosis aktív fehérjéi elérhet vé válnak a lehetséges gátló szerek tesztelésére. Ahhoz, hogy a nagy átereszt képesség tesztek eredményeit meger sítsük, a kiválasztott összetev k különálló tesztelésre kerülnek, az izolált fehérjéket, már korábban kikísérletezett tesztek segítségével vizsgáljuk. Jelenleg 72 nem homológ fehérje háromdimenziós szerkezete érhet el a Fehérje adat bankból (Protein Data Bank). A legtöbb (59 darab) ezek közül enzim, néhány ilyen enzimfehérje esetén korábbi tanulmányok alapján valószín síthet, hogy ezek támadása hatékony, újféle gyógyszermolekulák, kifejlesztéséhez vezethet. (EMBL Hamburg, Combinature Biopharm AG, Berlin). Ezek közé tartozik a dutpáz enzim is. 2.) Érzékeny módszer kidolgozása ligandum-dutpáz komplex kialakulásának vizsgálatára, kompetitív gátlószerek alkalmazásával. Ezzel a módszerrel azt tudjuk követni, hogy egy feltételezett, vizsgálandó antagonista molekula kompetitív módon gátolja-e a dutpáz enzim m ködését. A kompetitív gátlás itt arra utal, hogy az adott antagonista valószín leg, bár nem egyértelm en, az enzim aktív centrumába köt dik, a szubsztrátot onnan kiszorítva. Reményeink szerint a kompetitív gátlási kísérletekben az antagonista köt désén kívül, annak módjáról is további információt nyerünk. 22

23 Szekvencia analízis, munkahipotézisünk A M. tub. dutpáz enzim primer szerkezete ( aminosavak egybet s kódjával), szürke háttérrel kiemelve az 5. konzervált szekvencia látható alább: 1 MSTTLAIVRL DPGLPLPSRA HDGDAGVDLY SAEDVELAPG RRALVRTGVA VAVPFGMVGL 61 VHPRSGLATR VGLSIVNSPG TIDAGYRGEI KVALINLDPA APIVVHRGDR IAQLLVQRVE 121 LVELVEVSSF DEAGLASTSR GDGGHGSSGG HASL A M. tub. dutpáz aminosavsorrendjének összevetését elvégeztük több más faj analóg szekvenciájával (1.táblázat). Szerkezetét tekintve a dutpáz enzim aminosav szekvenciájának vannak konzervált régiói, amelyek nagy hasonlóságot mutatnak számos fajban. Ezen régiók közül is az ötödik a legérdekesebb a M. tub. szempontjából. Mycobacterium tub. "RGDGGHGSSG" Esherichia coli "RGEGGFGHSG" Homo sapiens s. "RGSGGFGSTG" Drosophila melanogaster "RGEAGFGSTG" 1. táblázat Néhány faj dutpáz enzimének 5. konzervált szekvánciájának aminosavsorrendje A kutatócsoport korábbi kutatási eredményei alapján az bebizonyosodott, hogy ezen 5. konzervált szekvencia kék színnel kiemelt aminosavak: a 145. H (hisztidin) és a F (fenilalanin) elég közel vannak az enzim aktív centrumához. Az aktív centrumban több aminosav vesz részt közvetlenül Van der Waals ill. ionos kötésekkel a dutp szubsztrát rögzítésében. Az általunk kiszemelt hisztidin esetében a szubsztráttal való kölcsönhatás szempontjából csak az aromás gy r k közötti átlapolás jöhetett szóba a hisztidin imidazol gy r je és a dutp uracil gy r je között. Emiatt lehet érdekes a szerepe az enzim aktivitásában. A fenti szekvenciaszakaszokból kiderül, hogy a M. tub. dutpáz kékkel kiemelt hisztidinje helyett számos faj esetében F (PHE) szerepel. Erre alapoztuk egyik feltevésünket, miszerint: az M. tub. ezen hisztidinje részben felel s lehet az enzim alacsony aktivitásáért. Az aktivitásban a magnéziumion jelenléte, más dutpázokhoz hasonlóan segíti az enzim katalitikus funkcióját, ugyanakkor a kinetikai mérésekben meghatározott k cat értékek jóval alacsonyabb enzimaktivitást jeleznek, mint amit más forrásokból származó dutpázoknál tapasztaltak. Máshol; a k cat =8-15 1/s, itt k cat =0,5 1/s (2.táblátat). 23

24 Enzim forrás k cat [1/s] E. coli Human 8-10 Ecetmuslica(Drosophila melanogaster) 7-10 Mason-Pfizer majomvírus (retrovírus) 1-2 M. tub. 0,5-1,5 2. táblázat k cat értéke több dutpázra (1997 Proteins, 2004, J. Biol. Chem., 2003, J. Biol. Chem) Ahhoz, hogy a fluoreszcens spektrofotometria számára láthatóvá, detektálhatóvá tegyük a fehérjénket a 145. hisztidint (His) pontmutáció segítségével kicseréltük triptofánra (Trp), ezt a pontot a 145.hisztidin ideális sztérikus elhelyezkedése miatt választottuk. A tervezés során abban bíztunk, hogy a His145Trp mutáns enzim segítségével képesek leszünk a kutatásba bevont inhibitor jelölt molekulákat aszerint sz rni, hogy milyen mértékben köt dnek az aktív centrumhoz. A köt dés mértékére a gerjesztett triptofán jelintenzitás-változásából következtethettünk Antagonisták és a dupnpp- szubsztrátanalóg Az ELTE-SZTAKI munkatársai által a Silico1 és Silico2 módszerekkel meghatározott molekulák közül 48 inhibitor jelölt molekulát (antagonistát) vontunk be a vizsgálatba. A kés bbiek során az inhibitor jelölt molekulákra csak sorszámaikkal fogok utalni ( oldal, 7/a, b táblázat). Az inhibitor jelölt molekulák általános tulajdonságai közül azt emelném ki, hogy f leg DMSO (dimetil-szulfoxid) és DMF (dimetil-formamid) oldószerekben oldódnak, bonyolult többségében aromás szerves vegyületek, molekulatömegük g/mol tartományba esik és mm-os a maximális oldhatóságuk. 24

25 Méréseket végeztem továbbá a dupnpp (, -imino-dutp) molekulával. A reakció els lépésének tanulmányozásához fiziológiásan releváns enzim-szubsztrát komplex szerkezet el állítása érdekében els ként el állítottunk egy olyan szubsztrát analóg ligandumot, amely a természetes szubsztráttal várhatóan analóg módon, és hasonló er sséggel köt dik az enzim aktív helyén, az enzimmel Mg 2+ jelenlétében alkotott komplexének élettartama viszont lényegesen hosszabb a természetes szubsztráténál. Az, -imino-dutp a dutp-hez hasonlóan dezoxi-uridin trifoszfát származék, de hasadó P O kötés helyett P N kötést tartalmaz. N 11. ábra - Az, -imino-dutp szubsztrátanalóg szerkezeti képlete A nitrogénatom oxigénénél kisebb elektronegativitása következtében a foszfátészterek imino analógjai jelent sen kisebb reaktivitással rendelkeznek, mivel általában az ezeket bontó enzimek a P N kötést jóval nehezebben, vagy egyáltalán nem hasítják a P O kötéshez képest. A foszfátészter kötést hidrolizáló enzimek többsége egyáltalán nem hidrolizálja az iminoanalógokat, mivel ezek az analógok ugyanúgy köt dnek az enzimekhez, mint azok természetes szubsztrátjai, kompetitív inhibitorként viselkednek. A 3. táblázat összefoglalva mutatja a dutpáz katalizált dutp és, -imino-dutp hidrolízis reakciókra vonatkozó kinetikai és ligandumkötési állandókat. 25

26 Nukleotid k cat (s -1 ) K M ( M) k cat /K M (M -1 s -1 ) dutp 11 0,5 1,4x10 7, -imino-dutp 2 x10-5 1,0 a 20 b 3. Táblázat dutpáz katalizált dutp és, -imino-dutp hidrolízis reakciók kinetikai és ligandumkötési állandói A bemutatott adatok 3-5 független mérés átlagolásából származnak. A k cat és K M meghatározások átlagos hibája 12% illetve 17% volt. a Az, -imino-dutp hidrolízis reakciót jellemz nagyon alacsony k cat érték, a K M meghatározását megbízhatatlanná tette, ezért itt a korábban meghatározott K d érték szerepel. Feltételezve, hogy a szubsztrát köt dése és a termékek távozása gyors a kémiai reakcióhoz képest, a K M -re és K d -re azonos értékek várhatók. E feltételezés jóságát a dutpázra egy korábbi kinetikai analízis igazolta. b k cat /K d A dutp-re és imino analógjára vonatkozó nagyon hasonló köt dési állandók (K M, K d, lásd 3. táblázat) a két hidrolizálható nukleotidra hasonló köt dési pozíciót és konformációt valószín sítenek, annak ellenére, hogy a hidrolízis sebessége majdnem 6 nagyságrenddel különbözik. E kinetikai és ligandumköt dési paramétereknek megfelel en az, -imino-dutp is a dutpáz enzim szubsztrátjának tekinthet. 26

27 3. Anyagok és módszerek klónozása Az M. tub. dutp-áz és a His145Trp mutáns M. tub. dutp-áz A dutpáz fehérjét kódoló 0.47 kb nagyságú génszakaszt a Mycobacterium tuberculosis H37Rv jelölés genomiális DNS-éb l, forward és reverz oligonukleotid primerekkel szaporítottuk fel PCR technika segítségével. Az N-terminális végre még hat hisztidinb l álló láncolt is terveztünk, hogy a fehérje tisztítást megkönnyítsük. A felszaporított dutpáz génszakaszt NdeI és BamHI enzimekkel emésztettük. A pet3a plazmidot, amibe a mi génünket klónozni akartuk, kétféle módon emésztettük. Ez a vektor tartalmaz egy ampicillin antibiotikum rezisztenciát kódoló génszakaszt, melynek közepén van egy PstI restrikciós enzim hasító hely. Az egyik emészt elegyben (I. emésztés) BamHI és PstI enzimekkel, a másikban (II. emésztés) NdeI és PstI enzimekkel vágtuk el a plazmidot. (12.ábra) Az emésztés lejátszódását agaróz gélen ellen riztük, majd gélb l kivágtuk és eluáltuk a megfelel fragmenseket. Az I. emészt elegyben ez a kisebb fragmenst jelentette, míg a II. emészt elegyben a hosszabb DNS fragmenst. Ezek után a három DNS szakaszt összeligáltuk, majd ezt a plazmidot BL21 (plyss) E. coli törzsbe transzformáltam fehérje termeléséhez. Ezzel a plazmiddal termelt fehérjét nevezzük vad típusúnak. Els re nagy kihívást jelentett volna a His145Trp M.tub. dutpázt tartalmazó plazmid elkészítése, ezért ezt a m veletet is a csoport többi tagjával közösen végeztük. A mutációt a QuikChange Mutagenesis Kit segítségével végeztük, amely esetben szintén meg kellett tervezni az oligonukleotid primereket ( reverz és forward) amelyek már tartalmazták a hisztidin bázisbármasa helyett a triptofán bázishármasát, ill. a primerek végére a komplementer végeket (hat bázisból álló részek ). 27

28 12. ábra A Mycobacterium tuberculosis dutpáz klónozási sémája. A színes téglalapok a jelölt restrikciós enzimek vágóhelyeit azonosítják. A mutáció kivitelezéséhez szintén PCR ( polimeráz láncreakció) reakciót alkalmaztam amihez: egy 0,5 ml-es PCR-cs be a következ ket mértem össze 50 µl reakcióelegyhez: 5 µl puffer + 38,5 µl deszt.víz + 1 µl plazmid ( a 6 hisztidinnel ellátott M. tub..dutpáz génjét tartalmazó plazmid) µl reverz ill. forward oligomer, amelyek a Trp (triptofán) bázishármasát tartalmazták + 1µl dntp mix és a végén pfu turbo és Taq polimerázt. Maga a h reakció programozható melegít s vízfürd n zajlott, egy ciklus a következ lépésekb l állt : denaturáció (95 C)- 30s, primerköt dés (55 C)-60s, DNS-szintézis (72 C)-60s, Ezt a folyamatot 19-szer ismételtettem meg. A reakció eredményeként vélhet en el állt a His145Trp mutáns M.tub dutpáz génjét tartalmazó plazmid, amelynek eredményességét megtisztítása után a szekvenáltatás igazolt, így tovább folytathattam a munkám. 28

29 3. 2. A fehérjék expressziója és feltárása Az M. tub. dutpáz vad típusú és a His145Trp mutáns enzim génjét tartalmazó pet plazmidokkal E. coli BL21 (plyss) sejteket transzformáltam. Ampicillin és klóranfenikol antibiotikumok alkalmazásával biztosítottam, hogy csak a plazmidot felvett sejtek szaporodjanak. Az ampicillin rezisztenciáért felel s gén a pet vektoron volt, a klóranfenikol rezisztencia génje pedig a plyss plazmidon, amelyet a BL21-es sejtek már tartalmaztak. A plyss plazmid továbbá tartamazza a T7 RNS polimerázt gátló lizozim génjét, hogy elkerüljük az esetleges dutpáz enzim IPTG hozzáadása el tti termel dését. A sejtek növekedését 500 ml Luria-Bertani tápoldatban az exponenciális növekedési szakasz eléréséig követtem. A növekedést a turbiditás mérésével (600 nm-n mért abszorbancia) követtem. Az exponenciális növekedés elérésekor a sejtkultúrát 0,5 mm izo-propil-tio-galaktozid hozzáadásával indukáltam, majd 4 óráig tovább növesztettem. A sejteket lecentrifugáltam, majd lízis pufferben feltártam. A feltárás során célunk, hogy megbontsuk a sejtfalat, és a plazmában található, oldható fehérjéket f leg a dutpázt sértetlenül oldatba vigyük. A sejtfal megbontásával azonban bizonyos proteázok m ködésbe lépnek, és rongálják a fehérjéket, ezért szükséges, hogy ezeket hatástalanítsuk, amit a lízis pufferbe adagolt EDTA-val és EGTA-val (amik a metalloproteázokat gátolják), valamint PMSF-fel érünk el (fenil-metil-szulfonil-fluorid, ami a szerin oldallánccal m köd enzimeket pl. tripszin, kimotripszin- specifikusan gátolja úgy, hogy velük kovalens komplexet képez). Továbbá adtam még DNázt, RNázt és DTT-t (ditiotreitol), amely megvédi az SH csoportokat az oxidálástól azáltal, hogy maga a DTT oxidálódik és lizozimot a sejtfal bontásához. A fenti adalékokkal és üvegreszelék együtt az oldatomat (a hatékonyabb sejtroncsolás érdekében) jégben állva 30 percig kevertettem mágneses kever vel, majd 3*2 perc szonikálás következett ekkor ultrahangos készülékkel szétroncsoltam a maradék sejttörmeléket. Újból jégben állva 30 perc kevertetés, majd 20 perc cenrifugálás rpp (rotáció/ perc) következett. Az itt keletkezett felülúszó a fehérjém oldata, ami rengeteg egyéb fehérjét, DNS-t tartalmazott, de ezt az oldatot már lehetett felvinni a Ni ion affinkromatográfiás oszlopra. 29

30 3. 3. Fehérjék tisztítási lépései Ni-ion oszlop affinkromatográfia A plazmidunk tervezésénél figyelembe vettük, hogy a fehérjetisztítást megkönnyíthetjük, ha a fehérje szekvencia N-terminális végére tervezünk még egy hat hisztidinb l (14.ábra) álló (MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH-) aminosavszakaszt, melynek eredményeképpen sokkal nagyobb valószín séggel fog megköt dni a hordozóhoz. Ebben a kromatográfiás gélben ugyanis Ni 2+ ionok vannak rögzítve a hordozóhoz, amelyek koordinációs kötésre képesek az imidazol gy r kkel, így a hisztidinnel (13. ábra). H N N Imidazol O 13. ábra NH 2 hisztidin H N N Az alábbi folyamatot kétszer hajtottam végre külön-külön a két fehérjeoldattal (vad típus és mutáns). A mintegy 4 cm magas Ni ionokat tartalmazó gyantára felvittem a sz rt tömény fehérje oldatomat. A számtalan egyéb fehérjével szennyezett oldatom az oszlopon elszínez dést okozott, és ezzel párhuzamosan megtörtént a koordinációs kötések kialakulása a fehérjém 6 hisztidinje és az oszlop Ni ionjai között (14.ábra). Az oszlopról a lassan lecsöpög átes t gy jtöttem. Ezután következett a mosás, erre két puffert használtam: HS (50 mm Hepes +300 mm KCl ph 7.5) LS (50mM Hepes + 30 mm KCl ph 7.5) A pufferekkel azokat a szennyez fehérjéket lehet leoldani, amelyek egyéb ionos kötéssel kapcsolódtak a Ni ionhoz ( izoelektromos pontjuktól függ en). A mosás menete a következ volt: El ször 2 térfogatrész LS pufferrel mostam az oszlopom, ami jelent s mennyiség egyéb fehérjék mellett a célfehérjémb l is leoldott egy kis mennyiséget, ez mindig el fordul ennek mértékét a kés bbi gélelektroforézissel állapítottam meg. Az átmosódott oldatból egy- 30

31 egy cseppet rendszeresen tettem a korábban Eppendorf csövekbe el készített 500 µl Bradford reagenshez, ami kék elszínez dét mutat fehérje jelenlétében. A kék szín árnyalatából lehet tájékozódni, hogy a leoldódóban lév fehérje koncentrációja hogyan alakul. Esetemben az LS puffer által lemosott oldat mélykék színe és annak halványodása a mosás során jelezte, hogy a szennyez fehérjék többsége távozott. Ezután a HS pufferrel folytattam a mosást. Itt már közel sem volt annyira nagy a leoldott fehérje mennyisége. A sós mosás befejezéseként még egy térfogatrész LS-sel mostam, ekkorra már a Bradford reagens semmilyen elszínez dést nem jelzett, így elkezdhettem a mosási folyamat következ fázisát. 14. ábra A sós mosást követ en, az imidazol két, egy nagyságrenddel eltér oldatát alkalmaztam, hogy kompetitíve kiszorítsa a hisztidint a Ni ionnal való ligandkötéséb l, emellett még el fordulhattak hisztidin tartalmú szennyez fehérjék is az oszlopon, de ezek közel sem annyira er s kötéssel rögzültek, mint az én hat hisztidines célfehérjém. Ezért el ször 2 térfogatrész híg imidazol oldattal (50mM imidazol, LS az oldószer) ezeket a szennyez, legalább egy hisztidinnel tapadt, fehérjéket távolítottam el. Ebben az esetben is volt egy jelent s leoldódó fehérje gradiens, ami bizonyította, hogy nagy mennyiségben maradt még a sós mosás után szennyez fehérje a célfehérje mellett. Az imidazolos mosási fázis következ lépése a 3 térfogatrész 0,5 M imidazol oldat volt, ami már képes a 6 hisztidint tartalmazó célfehérjém leoldására. A 0,5 M imidazol hozzadását követ en még gyakrabban kellett a Bradford reagenssel ellen rizni a leoldódott oldat fehérje tartalmát. Amint elkezdett mélyülni a kék szín, jelezvén, hogy megindult az oszlopról lefele a célfehérjém, megkezdtem gy jteni a leoldódott fehérjeoldatot egészen addig, amíg nagy fehérje koncentrációt mutatott az elkékült Bradford reagens. A mosási 31

32 folyamat végére el állt a célfehérjém híg oldata, ami jelent s mennyiség imidazollal szennyez dött. Az oszlopot végül 5 térfogatrész desztillált vízzel és 1,5 térfogatrész etanollal mostam Dialízis A dialízis célja, hogy a fehérje tisztítása során az oldatba bekerült imidazolt eltávolítsuk. Ehhez olyan membránt vettem igénybe, melyek desztillált vízzel való átmosás, és desztillált vízben történ felforralás után aktiválódtak. A membránokba belemértem a His145Trp mutáns fehérje oldatát (5ml), illetve a másikba vad típus 8ml-ét. Légmentesen lezártam a membránok mindkét végét és a 2 liter dialízis pufferbe ( 20 mm Hepes, 2 mm MgCl 2, 0,1 mm PMSF, 1 mm DTT ) helyezetem ket és egy éjszakára 4 C-on hagytam Membránsz rés Ehhez Amicon membránsz r t alkalmaztam. A m ködésének lényege, hogy 4,5 bar N 2 gáz által biztosított túlnyomás hatására, keverés és h tés mellett, a fehérjeoldat, víz, ion valamint 10 kda-nál kisebb fehérje tartalma átprésel dik egy membránon. Ezáltal betöményedik a fehérjeoldat Fehérjevizsgálati módszerek Gélelektroforézis, poliakrilamid gélelektroforézis (PAGE, SDS-PAGE) A fehérjék méret szerinti elválasztására alkalmazott gyakori módszer az elektroforézis. Adott ph-n a különböz fehérjék meghatározott számú pozitív vagy negatív töltéssel rendelkeznek. A molekulák töltésüknek megfelel en adott irányban el kezdenek vándorolni, az egyenárammal m köd elektródok között létrejött feszültségkülönbség miatt. Az egyes fehérjék különböz sebességgel mozognak relatív töltésük miatt, e különbség miatt lehet elválasztani ket egymástól. 32

33 Az akrilamid vizes oldatban gyökös polimerizációra képes megfelel katalizátorok jelenlétében. A reakció során nagy mólsúlyú lineáris polimer, poliakrilamid keletkezik. Amennyiben a megfelel keresztköt ágenst alkalmazzuk, a hosszú poliakrilamid láncok között hidak képz dnek, és térhálós szerkezet gél jön létre. Ebben a gélben vándoroltatjuk a fehérjéket az elektroforézis során. Az SDS-PAGE (sodium-dodecil-szulfátos-poliakril-amid-gélelktroforézis) a poliakrilamid gélelektroforézis fehérjék alegységszerkezetének, molekulatömegeloszlásuknak vizsgálatára felhasznált változata. Az SDS (nátrium-dodecil-szulfát) egy er sen anionos detergens. A fehérje mintákat SDS-sel és diszulfid hidakat bontani képes redukálószerrel kezelve, magas h mérsékleten radikális konformáció változások következnek be. A fehérjék közti kölcsönhatások megsz nnek, az alegység szerkezet felbomlik és a fehérjék denaturálódnak. Az SDS kitekeri a fehérjéket apoláros részével azok bels, hidrofób magját fellazítva. Mivel az SDS anionos detergens, a fehérjéket negatív töltéssel látja el, a fehérje saját töltését maszkírozza, így az SDS- fehérje komplexek töltés/tömeg aránya állandó lesz, függetlenül a fehérje eredeti fajlagos töltéss r ségét l. A köt dött SDS mennyisége egyenesen arányos a lánc hosszával, vagyis a fehérjék molekulatömegével. Ez a módszer kiválóan alkalmas preparált, illetve tisztított fehérje minták tisztaságának ellen rzésére. Gélelektroforézissel beazonosíthatóak a dutpázt tartalmazó frakciók, és azok tisztasága az enzimre nézve. SDS-PAGE esetén két különböz koncentrációjú gélt alkalmaznak. Az elválsztó gél fölé egy ún. koncentráló gélt polimerizálunk. Ennek akrilamid tartalma a futtató gélnél jóval alacsonyabb, annyira, hogy itt a molekulasz r hatás még nem érvényesül. A kis térfogatú fehérje mintát a koncentráló gél felszínére rétegezzük. Feszültség hatására a töltéssel rendelkez fehérje és a tank puffer anionjai belépnek a koncentráló gélbe és a fehérjék vékony sávban vándorolnak a futtató gél felszínéig. A 12%-os poliakrilamid gél készítését azzal kezdtem, hogy az elválasztó gél oldatát (0.05 ml 10%-os SDS, 1.25 ml elválasztó puffer, 1.5 ml 40%-os akrilamid, 0,04 ml 40%-os N, N -metilén-bisz-akrilamid, 50 µl 10%-os APS, 10 µl TEMED két álló helyzetben lév üveglap közé öntöttem. Az elválasztó gél polimerizációja után rárétegeztem a tömörít gél oldatát (0.025 ml 10%-os SDS, ml tömörít puffer, 0.25 ml 40%-os akrilamid, 25 µl 10%-os APS, 5 µl TEMED. Ebbe egy fés t helyeztem,amellyel kialakítottam a mintafelvitel számára a zsebeket a tömörít gélben. A gélelektroforézis esetén a gél megszilárdulása után, a gélt a futtató kádba tettem majd a fés t óvatosan kihúztam. A futtatókádat futtató pufferrel töltöttem fel. A mintákhoz velük 33

34 azonos mennyiség mintakoktélt adtam (3,55 ml desztillált víz; 1,25 ml, 0,5 M Tris-HCl ph=6.8; 2,5 ml glicerin; 2,0 ml 10 % SDS; 0,2 ml 0,5 % brómfenolkék; 350 mm DTT-t kell belerakni) aminek feladata, hogy denaturálja a mintát, kitekerje a fehérjét, valamint tartalmaz egy kék festéket, aminek segítségével nyomon lehet követni az elválasztást a gélen. A futtatás után a fehérjéket a gélben láthatóvá kellett tennem ehhez Coomassie Brilliant Blue-t használják, segítségével a gél keresztmetszetét l és az adott fehérje speciális fest dési tulajdonságaitól függ en akár már 1 µg fehérje is jól detektálható Fehérje koncentráció meghatározása A fehérjék mennyiségi meghatározására sokféle módszert alkalmaznak; Biuret, Lowry, Folin-Ciocalteau, abszorbanciás mérések a Lambert-Beer ( A c l ) törvény alkalmazásán alapulva, pl. Bradford módszere. Én az UV-VIS spektrofotometriás módszert alkalmaztam, amelynek lényege, hogy a fehérjékben általában lév tirozin (Tyr) ill. triptofán aromás aminosavaknak 280 nm-nél mérhet elnyelése van. A mérés két kvarc küvettát igényelt. Az egyikbe a gélsz réshez használt puffert ( referenciának ), a másikba a fehérje oldatom 10-szeres hígítása került. Majd felvettem a fehérje oldat spektrumát nm között. 280 nm-nél és 325 nm-nél leovastam az abszorbanciákat és ezek különbségével számoltam tovább. A koncentráció számításhoz még szükségem volt a fehérjém extinkciós koefficiensére ( ), amely M -1 cm -1 mértékegység, a fehérjeoldat elnyelését adja meg ( l =1 cm a küvetta átmér je. A számítást a Lampert Beer törvény alapján számítottam A A c vad l hígítás A mérési eredményemet még egy automatizált analizátorral NanoDrop TM ND-1000-el is meger sítettem. 34