A DNS-javító dutpáz enzim kölcsönhatása kismolekulás és makromolekulás ligandokkal

Átírás

1 Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem A DNS-javító dutpáz enzim kölcsönhatása kismolekulás és makromolekulás ligandokkal DIPLOMAMUNKA Témavezető: Dr. Vértessy G. Beáta Konzulens: Dr. László Elemér Készítette: Pongrácz Veronika Budapest 2002.

2 Köszönetnyilvánítás Köszönettel tartozom Dr. Vértessy Beátának, aki lehetővé tette számomra, hogy a kutató csoportjában dolgozhassam és mint témavezető megismertetett a téma alapjaival, irányított munkámban és segített a felmerülő problémák megoldásában. Köszönöm Dr. Friedrich Péter professzornak, az Enzimológiai Intézet igazgatójának, hogy engedélyezte munkámat az intézetben. Szeretnék köszönetet mondani a csoport minden tagjának, akik segítségemre voltak, megteremtették azt a kellemes légkört a laborban, amely nagyban megkönnyítette a munkámat. 2

3 Tartalomjegyzék A DNS-javító dutpáz enzim kölcsönhatása kismolekulás és makromolekulás ligandokkal...1 Köszönetnyilvánítás...2 Tartalomjegyzék...3 Összefoglalás Irodalomi áttekintés A dutpáz szerepe A dutpáz szerkezete A dutpáz potenciális szerepe a gyógyászatban Gátlás fehérje inhibitorral A Drosophila melanogaster dutpáz Az ecetmuslica dutpáz aktivitását gátló fehérje Gátlás és mechanizmus vizsgálat α,β-imido-dezoxiuridintrifoszfáttal (dupnpp-vel) MPMV-NC dutpáz Anyagok és módszerek A dutpáz preparálása Drosophila lárva extrakt előállítása A mérésekben felhasznált módszerek elmélete UV spektroszkópia SDS-poliakrilamid-gélelektroforézis Biacore rendszer Cirkuláris dikroizmus spektroszkópia FPLC ( Gyors Fehérjeelválasztási Folyadék Kromatográfia ) Felhasznált anyagok beszerzési forrásai Eredmények és értékelésük A dutpáz szubsztrátanalóg liganddal történő kölcsönhatásának vizsgálata dudp enzimatikus szintézise dudp tisztítása dudp gátlás mérése MPMV-NC dutpáz és dudp kölcsönhatásának vizsgálata CD spektroszkópiával közeli UV tartományban MPMV dutpáz és dudp kölcsönhatásának vizsgálata CD spektroszkópiával közeli UV tartományban Drosophila dutpáz vizsgálata CD spektroszkópiával A dutpáz makromolekulás liganddal való kölcsönhatásának vizsgálata A dutpáz immobilizálása a szenzor csipre Drosophila lárva extrakttal elvégzett mérések...44 Eredmények összefoglalása...51 Irodalomjegyzék

4 Rövidítések jegyzéke AMBIK ATP BSA CD dctp DTT dttp dudp dump dupnp dupnpp dutp dutpáz EDC EDTA FPLC HEPES IPTG LB MPMV NC NHS PMSF PPi RU SDS SPR TRIS TES UMP UTP ammónium-hidrogén-karbonát adenozin trifoszfát Bovine Serum Albumin cirkuláris dikroizmus dezoxi-citozin-trifoszfát ditio-treitol dezoxi-timidin-trifoszfát dezoxi-uridin-difoszfát dezoxi-uridin-monofoszfát α,β-imido-dezoxi-uridin-difoszfát α,β-imido-dezoxi- uridin-trifoszfát dezoxi-uridin-trifoszfát (dezoxi-uridin-trifoszfát)-nukleotid hidroláz N-etil-N'-(dimetil-aminopropil)karbodiimid-hidroklorid etilén-diamin-n,n,n',n'-tetraecetsav Fast Protein Liquid Chromatography (N-[2-hidroxietil]piperazin-N-2[2-etánszulfonsav] izopropil-tio-galaktozid Luria-Bertani (tápoldat) Mason Pfizer majom vírus Nukleokapszid N-hidroxiszukcinimid fenil-metil-szulfonil-fluorid inorganikus pirofoszfát resonance unit nátrium-dodecilszulfát surface plasmon resonance trisz-(hidroximetil)-aminometán N-tris[hidroximetil]metil-2-amino-etán-szulfonsav uridin-monofoszfát uridin-trifoszfát Összefoglalás A dezoxiuridin trifoszfát nukleotidhidroláz (dutpáz) enzim a dutp pirofoszforolízis katalizálja az alábbi reakció alapján: dutp dump + PPi A folyamat nagyenergiájú foszfát hidrolízise miatt gyakorlatilag revezibilis, ezért egyirányú nyíllal írható le. A dutpáz ezzel a reakcióval, a dutp/dttp-szint hatékony ellenőrzése révén megelőzi az uracil DNS-be való beépülését. Az enzim hiányában kialakuló magas dutp/dttp arány uraciltartalmú DNS-t eredményez, amely a báziskivágáson alapuló javítómechanizmus hiperaktivitásán keresztül kromoszómafragmentálódáshoz vezet. 4

5 Az enzim esszenciális szerepére utal, hogy nem csupán eu- és prokariotákban van jelen, de herpeszvírusok és retrovírusok is egyaránt kódolják. A DNS-metabolizmusban és javításban játszott fontos szerepe, továbbá expressziójának sejtdifferenciálódástól függő kontrollja miatt ez a fehérje új célpont lehet antivirális és antitumor hatású vegyületek kifejlesztésében. A dolgozat célkitűzése az volt, hogy megvizsgáljam a dutpáz enzim és annak aktivitását gátló molekulák kölcsönhatását. Ezen belül vizsgáltam a nem-hidrolizálható szubsztrátanalóg dudp gátlását; spektroszkópiai módszerrel tanulmányoztam a kismolekulás szubsztrátanalóg ligandok és Drosophila melanogaster (ecetmuslica) illetve Mason Pfizer majomvírus (onkogén retrovírus) dutpáz enzimei között létrejövő komplexeket; valamint nyomon követtem makromolekulás inhibitorok és az ecetmuslica dutpáz kapcsolódását. 5

6 1. Irodalomi áttekintés 1.1. A dutpáz szerepe A környezetünkben található mutagén ágensek a DNS alkotóelemeinek kémiai átalakítása révén örökletes változásokhoz vagy akár a sejt elpusztulásához vezethetnek [1]. Ezért a DNS integritásának védelmére több javítómechanizmus is létezik, melyek a keletkezett hibát kijavítják, de megelőzni nem tudják. Egy gyakori hiba a DNS uraciltartalmának növekedése, mely esetén báziskivágáson alapuló javító mechanizmus lép életbe. A javító mechanizmus hiperaktív működése kromoszóma fragmentálódáshoz vezet. Ez a sejt halálát okozza (apoptózis) [2]. A DNS-ben megjelenő uracilhibát két folyamat is előidézheti, a citozin spontán bekövetkező oxidatív deaminálása és a timin uracillal való helyettesítése [3]. A dezoxiuridin trifoszfát nukleotidhidroláz (dutpáz) enzim megakadályozza az uracil DNS-be való beépülését és így egyedi módon preventív DNSjavító szerepet játszik [2]. A dutpáz enzim létezését először 1961-ben Bertani mutatta ki Escherichia coli extraktban. Felfedezték az enzim specificitását dutp-re nézve és vizsgálták a Mg2+ jelentőségét a reakcióban [4]. Azóta is számos kutatás folyik az enzim jobb megismerése céljából. A dutpáz által katalizált reakció dezoxiuridin trifoszfát (dutp) hidrolízise dezoxiuridin difoszfáttá (dump) és pirofoszfáttá (PPi). (1. ábra) 6

7 1. ábra dutp hidrolízise dutpáz enzim által A termékek: UMP, inorganikus pirofoszfát és n számú proton, ahol n függ a ph-tól és a fémion koncentrációjától 2+ A Mg, mint kofaktor vesz részt a reakcióban A hasítás az α és β foszforatomok között lévő foszforanhidrid kötésen megy végbe [5]. A reakció végbemeneteléhez egy kétértékű fémion, mint kofaktor is szükséges. A pontos reakciómechanizmus nem ismert. Feltételezhető, hogy a katalitikus komplexben a szubsztrát dutp a fémion segítségével lép kölcsönhatásba az α foszfát csoport felé irányuló valamilyen katalítikus oldallánccal illtve esetleg egy vízmolekulával. A β foszfátnak szintén szerepe lehet a fémmel való kötés kialakításában [6]. A dutpáz által katalizált reakció két szempontból is fontos: egyrészt a termék dump a de novo dttp szintézis prekurzora, másrészt a reakció alacsonyan tartja a sejtbeli dutp/dttp arányt. (2. ábra) 7

8 2. ábra A dutpáz szerepe a dttp-bioszintézisben és a DNS uracilmentességének biztosításában A DNS-be beépülő pirimidin dezoxiribonukleotidok bioszintézisének elsődleges metabolitja az UMP, amely glutamin, bikarbonát és ATP kiindulási anyagokból több enzim közreműködésével jön létre. A deoxiribonukleotidokat előállító reakciókat reduktázok és kinázok katalizálják. A nukleotidkinázok és reduktázok nagymértékben specifikusak a foszfátcsoportok számára nézve csakúgy, mint az uracilgyűrűt citozinná, illetve timinné alakító aminálási, illetve metilezési reakciókat katalizáló enzimek. Az UMP prekurzorból mind a kilenc lehetséges pirimidin deoxiribonukleotid létrehozható, d(c,u,t) (mono, di, tri)p. (3. ábra) A dctp/dttp arány hatékony szabályozása érdekében azonban az aminálás a deoxiribonukleotid szinten megfordítható. Eukariótákban a deaminálás a dcmp-ből történik dump-vé, amit a dtmp szintáz rögtön felhasznál. Prokariótákban a dctp deamináz dutp-t termel, melyből a dutpáz dump-t hoz létre. Mind a pro-, mind az eukariótákban UMP-ből kiindulva is képződik dutp. A dutp a dutpáz enzim révén irányítható a dttp szintézis felé [7]. 8

9 3. ábra A pirimidin dezoxinukleotid szintézis de novo útja A pontozott nyíl csak az E. coliban és más enterobaktériumokban, a szagatott nyíl E. coliban nem, de más előlények többségében megfigyelt enzimaktivitását mutat A dutpáz által katalizált reakció másik, igen fontos szerepe a sejt dutp/dttp arányának alacsony szinten tartása [2]. Egy enzim életteni szerepe gyakran megállapítható olyan fenotípusok vizsgálatából, melyek a kódoló gének mutációja következtében csökkent enzimaktivitást mutatnak. Ilyen E. coli mutánsok (dut-) fenotípusos tulajdonságai a következőek: a DNS replikáció közbenső termékeire emlékeztető rövid DNS fragmentek (Okazaki fragment) felhalmozása hasonlóan a DNS polimeráz I-et vagy DNS ligázt kódoló gének null mutációja esetén tapasztaltakhoz; megnövekedett rekombinációs gyakoriság és a mutációk számának növekedése. Ezek a fenotípusos jellemzők közvetlenül nincsenek összefüggésben a dutpáz már ismert katalitikus aktivitásával és arra utalnak, hogy a dut fenotípusát a kivágáson alapuló javítómechanizmus enzimeinek aktiválása okozza [8]. Ezen fenotípus közvetlen oka az, hogy dutpáz hiányában a dutp-szint összemérhető a dttp-szinttel, ekkor a DNS polimeráz adeninnel szemben azonos valószínűséggel építhet be timint és uracilt, mivel a két bázis közötti különbséget a metilcsoport meglétét illetve hiányát nem érzékeli [9-11]. A DNS-ben megjelenő uracilt hibaként észleli a báziskivágáson alapuló javítómechanizmus, melynek elsődleges feladata a citozin spontán oxidatív deaminálásából származó mutagén uracil eltávolítása [12,13]. Ez a báziskivágáson 9

10 alapuló javítómechanizmus az uracil-dns-glikozidáz enizmmel indul, mely felismeri az uracilt a DNS-ben. A javítás során újra szerepet játszik a DNS polimeráz, amikor a kivágott bázis helyére újat akar beépíteni [14]. dutpáz hiányában a magas dutp szint mellett ebben a lépésben könnyen visszakerül az uracil a DNS-be, vagyis a javítómechanizmus így hiábavaló ciklussá degradálódik [2]. Ezen enzimek együttes működése eredményezi a DNS szál hasítását uracil tartalmú helyeken. Vagyis dutpáz hiányában a megemelkedett dutp koncentráció az uracil DNS-be való megnövekedett beépüléséhez vezet, mely a DNS szál fragmentálódását eredményezi [15]. A kromoszóma fragmentálódása a sejt halálát okozza. Ezt a folyamatot timinmentes sejthalálnak nevezzük, mert kiindulásáért a dttp alkotóelem hiánya felelős [2] A dutpáz szerkezete Negyedleges szerkezetük alapján a dutpáz enzimek három különböző csoportba sorolhatók: monomer, homodimer vagy homotrimer. A homotrimer forma (4. ábra), mely a legáltalánosabb, megtalálható a prokariótában, az eukariótákban és a legtöbb vírusban [16-18]. Mindegyik enzimben öt konzervált szekvenciamotívumot azonosítottak, melyek az aktív centrumban vagy annak közelében helyezkednek el. Annak ellenére, hogy ezek a szerkezetek igen különböző fajokból származnak, hasonlóságot mutatnak az aktív centrum felépítésében és magas szubsztrát specificitásban [19]. 4. ábra Humán dutpáz szalagmodellje A három alegység három különböző színnel szerepel 10

11 Monomer dutpázt emlős szervezeteket fertőző herpeszvírusok kódolnak az örökítőanyagukban. Tartalmazzák ugyanazokat a konzervált szekvenciamotívumokat, mint a homotrimer forma, de más sorrendben [19]. A dimer dutpáz megtalálható protozoákban és Campylobacter jejuni baktériumban [20]. A dimer szerkezetű enzim ellentétben a homotrimer és monomer formákkal nem kódolja az öt konzervált szekvenciamotívumot. Szubsztrátspecificitása alacsonyabb és képes a dudp hidrolízisére is, amely egyébként a másik két fajta enzim aktivitását gátolja [21]. Az E. coli dutpáz háromdimenziós szerkezetét röntgenkrisztallográfia segítségével határozták meg. Az enzim egy szimmetrikus trimer, amelynek alegységei 152 aminosavból állnak [22]. A különböző enzimek alegységeit alkotó peptidláncok hosszúsága különböző lehet, de szerkezetük mégis jól fedésbe hozható egymással, néhány huroktól eltekintve. Annak ellenére, hogy a különböző organizmusokból származó dutpázok között a korlátozott szekvenciaazonosság a jellemző, mégis minden igazoltan dutpáz aktivitással rendelkező és dudp hidrolízist nem katalizáló fehérjében megtalálható ugyanaz az öt konzervált szekvencia motívum [19]. A homotrimer dutpázok alegységeinek a magját β-szálak alkotják. Az egyetlen rövid α-hélix a trimer felületén helyezkedik el. A β-szálak hurkokkal kapcsolódnak össze és ún. lekvárostekercsbe szerveződnek [20]. A fehérjeszerkezetben a piskótarétegek az egyes βszálaknak felelnek meg az összetartó lekvár ragasztó szerepét a két β-szál közötti hidrogénhidak jelentik [2]. Az ideális lekvárostekercset alkotó β-szálak antiparalell módon rendeződnek össze (4. ábra A), de a dutpáz esetében némely β-szálak paralell módon kapcsolódnak [22]. (5. ábra B) A B 5. ábra Lekvárostekercs szerveződés ideális esetben (A) és dutpázoknál (B) 11

12 A homotrimer harmadlagos és negyedleges szerveződése nem választható el, mert az egyik alegység lekvárostekercsének egyik β-szála a szomszédos alegységből származik. (5. ábra B) Ez a szerveződés rendkívül nagy stabilitást biztosít a dutpáz trimernek [2]. Az dutpáz aktív centrumának kialakítása tudomásunk szerint egyedülálló. A trimer enzimben három szimmetrikusan létrejövő aktív centrum van és mindegyik aktív centrum felépítéséhez mind a három alegység és ezen belül is az öt konzervált szekvencia motívum hozzájárul [2]. Az 1, 2 és 4 szekvencia motívumokat az egyik, a 3-at egy másik, az 5-et pedig a harmadik monomer szolgáltatja [23]. Az öt konzervált szekvencia motívum a szubsztrát felismerésben és a specificitás biztosításában jelentős szerepet játszik. A dutp nukleozid részének felismerése a 3. szekvencia motívum feladata. Két antiparalell β-szál összekapcsolódik egy hurok segítségével és így kialakítják a β-hajtűt. A hajtű nyitott vége a két szálat összekötő hidrogén hidaknak köszönhetően elkeskenyedik, míg a másik végén, ahol a hurok összeköti a két β-szálat, ezek a hidrogén hidas kölcsönhatások hiányoznak és itt kiszélesedik a β-hajtű [24]. Az uracil gyűrű funkciós csoportjaival a β-szálak gerincatomjai hoznak létre hidrogén hidakat, a DNS-ben előforduló bázispárosodás mintájára. Ez az elrendezés nem komplementer a citozin bázissal, így az nem tud a β-hajtűvel kapcsolatot kialakítani. A timin kizárásáért sztérikus gát felel, a timin 5-metilcsoportja ütközne a βhajtű falával. A szűk dutp-re szabott aktív centrumba a purinbázisok nem férnek be. A nagymértékű specificitás különösen azért fontos, hogy megakadályozza más foszfáttartalmú nukleotidok hiábavaló hidrolízisét [25]. A dutp és az UTP szerkezetük szempontjából igen közel állnak egymáshoz. Ahogyan az UTP az RNS szintézis egyik szükséges metabolitja, úgy az is alapvetően fontos, hogy a dutpáz rendelkezzen a szubsztrát pentóz részére vonatkozó specificitással [5]. A dezoxiribóz specifikus felismerő része a 3. konzervált szekvenciamotívumbeli tirozin oldallánc, amely a β-hajtű alján foglal helyet, átlapol a dezoxiribóz gyűrűvel és sztérikusan kizárja a ribonukleotidok kötődését [25]. E. coli dutpáz esetében a tirozin oldallánc kémiai módosítása az enzim aktivitásánk elvesztését eredményezte [26]. A szubsztrát foszfátláncának megkötéséért egy másik monomerhez tartozó 2. és 4., továbbá a harmadik monomerhez tartozó 5. szekvenciamotívum együttesen felelős, konzervált bázikus oldalláncaik elektrosztatikus kölcsönhatások révén koordinálják a foszfátokat. Külön jelentőséggel bír az 5. motívum konformációváltozása. Ez a szegmens a 12

13 legtöbb kristályszerkezetben nem lokalizálható, flexibilitásért a magas glicintartalma felelős [27]. 13

14 1.3. A dutpáz potenciális szerepe a gyógyászatban Az enzim nullmutációja mind prokarióta, mind eukarióta szervezetekben letális [8]. A dutpáz aktivitás a sejtciklustól és a fejlődési állapottól függő módon szabályozódik, magas enzimaktivitás csak aktív DNS szintézist folytató sejtekben figyelhető meg. Ilyen sejtek a rákos szövetek sejtjei, továbbá a vírusfertőzött sejtek. A dutpáz enzim gátlásával specifikusan megállítható tehát ráksejtek és vírusfertőzött sejtek növekedése [28]. A 2. ábra alapján ez a hatás kromoszóma fragmentálódással járó timinmentes sejthalál révén következik be. Szintén timinmentes sejthalált idéz elő két másik, a klinikai gyakorlatban széleskörben használt rákellenes gyógyszer, a methotrexát és a fluorodezoxiuridin, ezek hatékonysága azonban rezisztencia kialakulása miatt idővel lecsökken. Kimutatták, hogy a fluorodezoxiuridinnal szembeni rezisztencia kialakulása együttjár a dutpáz aktivitás növekedésével egyes rákos sejtvonalakban [29]. Valószínűsíthető tehát, hogy a kemoterápia hatékonysága növelhető lenne dutpáz antagonisták használatával. (6. ábra) A dutpáz gátlása alapvetően két módon képzelhető el: egy szabályozó fehérje révén illetve valamilyen szubsztrátanalóg ligandummal. DNS UTP dutp dttp dutpáz UDP dudp UMP dump dutpáz antagonista FdUMP dtdp dtmp timidilát szintáz 5, 10-Metiléntetrahidrofolát Dihidrofolát Dihidrofolát reduktáz Methotrexát 6. ábra Timidilát metabolizmus gátlásának lehetőségei 14

15 1.4. Gátlás fehérje inhibitorral A Drosophila melanogaster dutpáz A diplomamunkám készítése során elvégezett kísérletek egy részét Drosophila dutpáz felhasználásával végeztem. Ennek oka az, hogy ez az enzim magas fokú szerkezeti hasonlóságot mutat az emberi dutpáz kristályszerkezetével. Ugyanakkor a monomer és az aktív centrum felépítése sokban hasonló a bakteriális és retrovirális enzimek szerkezetéhez [30]. A dutpáz expressziója fejlődési állapottól függő szabályozás alatt áll [28] ben úgy találták, hogy az embrió az egyetlen szakasz a Drosophila életciklusában, amikor az enzim jelenléte megfigyelhető [31]. Így az enzim D. melanogaster embrióból izolálható. Megfigyelték, hogy az enzim aktivitása az embrionális szakasz után lecsökken, vagyis megnő annak a lehetősége, hogy uracil épüljön be a DNS-be [28,31]. Giroir és Deutsch szerint az ecetmuslica dutpáz fizikai paraméterei -például a molekulatömeg, mely Drosophila dutpáz esetében 46 kda- igen hasonlóak a Bacillus subtilisből illetve humán embrionális sejtekből származó dutpáz jellemzőihez. Az enzim ph optimuma 6 és 10 ph között van. A Drosophila dutpáz optimális működéséhez szükség van valamilyen kétértékű fémion jelenlétére. Ezt kísérletekkel igazolták, amikor a reakcióelegyhez EDTA-t adagoltak és ennek eredményeként az enzim aktivitása jelentősen lecsökkent, Mg2+és Mn2+ hozzáadása pedig megszüntette az EDTA gátló hatását [31]. Fiser és Vértessy 2000-ben azonosították az ecetmuslica dutpáz szekvenciáját, adatbázisban végzett homológ szekvencia kereséssel. Megállapították, hogy az ecetmuslica dutpáz a szokásos konzervált motívumokon kívül tartalmaz egy 28 aminosavból álló, alaninban és prolinban gazdag peptidszegmenst, a fehérje karboxi terminálján. Ez a szegmens nem mutat szekvenális hasonlóságot más dutpáz szekvencia részletekkel [30]. 15

16 Az ecetmuslica dutpáz aktivitását gátló fehérje Az ecetmuslica dutpáz aktivitásának a fejlődési állapottól függő szabályozását [31] transzkripciós mechanzimus vagy egy endogen inhibitor okozhatja. Annak eldöntésére, hogy létezik-e egy ilyen gátló hatású molekula, tisztított embrionális dutpázt és a Drosophila többi fejlődési szakaszából nyert extraktokat vizsgáltak [35]. Az enzim és extraktok összekeverése után a legtöbb sejtextraktnak nem volt hatása a dutpáz aktivitásra, egyedül az első larva állapotból származó extrakt esetén figyeltek meg enzim aktivités csökkenést. Az enzim és a szubsztrát koncentrációját állandó értéken tartása és a lárva extrkat mennyiségének növekedése az embrionális dutpáz aktivitásának teljes elvesztéséhez vezetett, a dutpáz mennyiségének növekedésével pedig az inhibíció mértéke csökkent [32]. Előzetes vizsgálatok során kiderült, hogy ez az inhibitor molekula hőstabil fehérje, így a következő tisztítási eljárást végezték el. A hőkezelt extraktot epoxi-aktivált Sepharose 6B gyantához kapcsolt embrionális dutpázt tartalmazó affinitás oszlopra vitték fel, majd az inhibitort magas ph-jú pufferrel eluálták. Az inhibitor fehérje relatív molekulatömege, melyet poliakrilamid-gélelektroforézis vizsgálattal állapítottak meg, 60 kda. A szerzők nem vizsgálták a javasolt inhibitor fehérje szekvenciáját, így az egyelőre nem azonosítható [32] Gátlás és mechanizmus vizsgálat α,β-imido-dezoxiuridintrifoszfáttal (dupnpp-vel) A dutpáz enzim aktív centrumainak felépítésében részt vevő öt konzervált szekvenciamotívum közül az ötödik a peptidlánc C-terminális végében található. Ez a szegmens a legtöbb kristályszerkezetben nem lokalizálható. Ismeretes, hogy a katalítikus ciklus során a dutp kapcsolódása az E. coli enzimhez az 5. motívum rendeződéséhez vezet, míg dutp távollétében ez a szegmens kevésbé rendezett [33]. Flexibilitását magas glicintartalmának köszönheti. A C-terminális katalítikus ciklusbeli szerepének vizsgálatához olyan E. coli enzimet használtak, mely 5. szekvenciamotívumának utolsó 11 aminosav oldalláncát limitált tripszinolízissel eltávolították. A tripszinnel emésztett enzim aktivitása 120 perc múlva 5% alá csökkent. dudp jelenléte a mérés során nem volt hatással az aktivitás csökkenésének 16

17 mértékére. Továbbá a dudp kötődése az enzimhez függetlenül attól, hogy az 5. motívum hiányzik-e a dutpáz enzimből vagy sem, nem változott meg [27]. A dutpáz ligand által előidézett konformáció változás vizsgálatára használják a dupnpp szubsztrátanalóg molekulát, amelyben az α és a β foszforatomokat összekötő oxigént imido csoport helyettesíti. A dutpáz ezt az imido kötést nem tudja elhidrolizálni. Ennek a molekulának illetve a dudp-nek a természetes és a tripszinnel emésztett enzimmel (melyből az 5. szekvenciamotívum hiányzik) való kölcsönhatását vizsgálták közeli és távoli UV tartományban cirkuláris dikroizmus spektroszkópiával. 7. ábra A B Az ép és az 5. motívumban csonkolt E. coli dutpáz kölcsöhatása dupnpp-vel és dudp-vel távoli (A) és közeli (B) UV tartományban [33]. A: Az eredeti dutpáz dupnpp-vel (folytonos vonal), illetve dudp-vel (szaggatott) való kapcsolódása során indukált differencia spektrum. A pontozott vonal a csonkolt enzim és dupnpp komplexálódása által indukált differencia spektrum. B: Az eredeti dutpáz dupnpp-vel (folytonos vonal), illetve dudp-vel (szagatott) való kapcsolódása során indukált differencia spektrum. A pontozott vonal a csonkolt enzim és dupnpp komplexálódása által indukált differencia spektruma. A szubsztrátanalóg dupnpp kölcsönhatása az enzimmel egy negatív csúcsot eredményez a távoli UV tartományban mért CD differencia spektrumon.(7. ábra A, folytonos vonal) Ennek oka az, hogy a ligand kötődése a fehérje konformációváltozását idézi elő. Ez a változás csak a trifoszfát analógra jellemző, dudp esetében nem figyelhető meg. (7. ábra A, szagatott vonal) A tri- és difoszfát ligandok dutpázhoz történő 17

18 kapcsolódása közti különbség a közeli UV tartományban mért differencia spektrumokon is jelen van. (7. ábra B) Az dupnpp kötődése egy negatív differencia csúcs megjelenéséhez vezet 260 nm hullámhossznál, míg a dudp 270 nm-nél eredményez pozitív csúcsot. 260 nm-nél sem önmagában a ligand, sem a fehérje nem mutat észlelhető CD jelet. A spektrális jeleket titrálási kísérletekben követve meghatározták a disszociációs állandókat. Eszerint az dupnpp kötődése az enzimhez erősebb, mint a dudp kötődése vagyis a szubsztrátanalóg γ-foszfát része fontos az enzimmel való kölcsönhatás kialakításában. Távoli UV tartományban a tripszinnel emésztett enzim és a dupnpp komplex kialakulása nem jelez konformáció változást, (7. ábra A, pontozott vonal) a közeli UV tartományban pedig a dudp-nem emésztett enzim komplexéhez hasonló CD jelet hoz létre. (7. ábra B) A fenti kísérleteket összefoglalva a bakteriális enzim dupnpp-vel kialakított komplexe egy jelentős konformáció változást idéz elő a fehérje szerkezetében, míg dudp esetében ez nem történik meg. Ez a konformációváltozás a dutpáz C-terminális részének köszönhető, mivel eltávolítása esetén ez a változás megszűnik. Az enzim C-terminális része tehát fontos szerepet tölt be a szubsztrát aktív centrumba való megkötésében [33]. A katalitikus ciklus során a C-terminális 5. motívum aktív centrum fölé hajolva egy zárt konformációt hoz létre. A reakció végbemenetele után a C-terminális visszanyeri flexibilitását, az aktív centrum kinyílik, elősegítve ezzel a termék távozását. Humán enzim esetén az irodalmi kristályszerkezeti adatok szerint a hidrolízist követően létrejövő enzimdump komplex megtartja a zárt konformációt, így a termék távozása egyelőre nem érthető [34]. 18

19 1.6. MPMV-NC dutpáz A Mason-Pfizer majomvírus (MPMV, D-típusú onkogén retrovírus) dutpázt kódoló génje a gag-pol genomrészletek között, a retroviális nukleokapszid fehérje génjét követően, a különálló pro leolvasási keretben helyezkedik el. A B és D típusú retrovírusok esetében két keretugrás szükséges a gag-pro-pol genomban kódolt molekulák expressziójához. Az első keretugrás helye a genom gag-pro határán, a nukleokapszid fehérje (NC) transzlációs stop kodonjánál található. A keretugrás révén átíródott fehérje, melyet p30-nak hívnak, az NC fehérjével kovalensen kapcsolódott dutpáz enzim [35]. (8. ábra) gag pol pro NC p14 NC DU p30 8. ábra A dutpáz (DU) és a nukleokapszid fehérje gén (NC) elhelyezkedése a genomban Ismert, hogy a nukleokapszid fehérje fontos a virális genom becsomagolásában, továbbá jelentős szerepe van a reverz transzkripció folyamata során a nukleinsavakkal való kölcsönhatásban. Feltételezhető, hogy a dutpáz enzim kovalens kapcsolódása a nukleokapszid régióhoz lehetővé teszi az enzimaktivitás nukleinsavakhoz való lehorgonyzását, így az aktivitás adekvát lokalizációját. Ezen lehetőségek tanulmányozására a Vértessy laboratóriumban klónozták az MPMV-NC dutpázt és az MPMV dutpázt. Diplomamunkámban ezeket a fehérjéket is vizsgáltam. 19

20 2. Anyagok és módszerek 2.1. A dutpáz preparálása Transzformálás A különböző szervezetekből származó dutpázt az adott élőlény dutpáz génjét tartalmazó baktériumokkal termeltetjük. Transzformálás során D. mel., MPMV illetve MPMV-NC dutpázt kódoló gént tartalmazó pet-3 illetve pet-11b plazmidot juttatunk BL21(DE3)pLysS kompetens E.coli sejtekbe. A célunk az volt, hogy az E.coli sejtek elszaporításával minél több dutpázt termeltessünk. A bevitt plazmidok oldatainak koncentrációi : 0.28, 0.11, 0.23 mg DNS/ml a D. mel. dutpáz illetve az MPMV dutpáz és MPMV-NC dutpáz géneket tartalmazó plazmidok esetében. Transzformálás során 0.2 µg/ml tesztplazmidot is használunk. A tesztplazmidot tartalmazó sejtek megjelenése a táptalajon a transzformálás eredményességét mutatja. A tápoldat antibiotikum tartalma (ampicillin, kloramfenikol) biztosítja, hogy csak a transzformált sejtek nőjenek ki. PLysS plazmid kloramfenikol rezisztencia gént, a pet-3 és pet-11b ampicillin rezisztencia gént tartalmaz. 20 µl E. coli sejtszuszpenzióba 1 µl plazmid DNS-t pipettázunk. Óvatos összerázás és pár perc jeges inkubálás után 30 másodpercre 42 C-os vízfürdőre tesszük. A hősokk hatására a sejtfal átjárhatóvá lesz a plazmid számára. 2 percre újra jégbe tesszük az elegyet. 80 µl SOC tápoldatot adunk a szuszpenzióhoz, majd 37 C-on 1 órán át rázatjuk. A transzformált sejteket tartalmazó szuszpenzióból 10 és 25 µl-nyi mennyiségeket antibiotikumot tartalmazó táptalajra szélesztünk. Egy éjszakai 37 C-os inkubálás után egy telepből tovább szélesztünk új táptalajra. Expresszió A szintézis indukciójához a T7 bakteriofág expressziós rendszert használjuk fel. Az E.coli genomjában a lac promoter ellenőrzése alatt áll a T7 RNS polimeráz génje. A lac promotert IPTG-vel indukálva a polimeráz expressziója elindul. Az így termelődött RNS polimeráz tevékenységét a pet3 plazmidon lévő T7 promoter régió a plazmidra irányítja. A T7 promoter szakasz után a dutpázt kódoló gén helyezkedik el. Így IPTG segítségével a dutpáz expresszióját el tudjuk indítani. 20

21 A kiszélesztett baktérium telepeket kaccsal folyékony tápoldatba visszük át. Egy táptalajos lemezzel oltottuk be a 0.5 l LB tápoldatot, amely ampicillint és tetraciklint tartalmaz, szuszpendáljuk a telepeket. 37 C-on rázógépen inkubáljuk a sejteket. Adott időközönként mintát veszünk és az optikai denzitás spektrofotometriás mérésével (600 nm) a sejtkoncentráció változását figyeljük. Ha a sejtek elérték a logaritmikus növekedési fázis elejét IPTG-vel (izopropil-tiogalaktozid) indukáljuk a dutpáz szintézist. Indukálás után mintegy négy óra hosszat termeltetjük az enzimet, majd lecentrifugáljuk a sejtszuszpenziót. Indukálás előtt illetve után vett mintákat gélelektroforézissel vizsgáljuk. Az alábbi gélen (9. ábra) az expresszió utáni, sorrendben, MPMV dutpázt (1.) és MPMV-NC dutpázt (2.) expresszáló sejtminták láthatók. MPMV-NC esetében működik igazán jól az expresszió (nyíllal jelölt csík). Az MPMV dutpáz expresszió kevésbé jó, ezért nem ez a csík a legerősebb. A kétféle Drosphila dutpáz expressziója a 10. ábrán látható, melyeket a fejezetben részletesebben be fogom mutatni. A Drosophila fehérjét jelentő csíkokat nyíllal jelöltem ábra MPMV (1.) és MPMV-NC (2.) dutpáz enzim expressziója. A harmadik oszlop a molekulatömeg marker. 21

22 ' 2' 3' 10. ábra A rövd (1, 2, 3) és a hosszú (1', 2', 3') Drosophila dutpáz expressziója IPTG hozzáadása előtt és után illetve tisztítás után Sejtfeltárás A sejtfeltárás lényege, hogy megbontsuk a sejtfalat és az oldható fehérjéket, legfőképpen a dutpáz-t sértetlenül oldatba vigyük. A felnövesztett tápoldat 1/10 részének megfelelő mennyiségű lízis pufferben jégen felszuszpendáljuk a sejteket.(150 mm NaCl, 50 mm TRIS, 1 mm EDTA, 2 mm DTT, 0,5 mm PMSF, ph = 8,00) A PMSF (fenil-metil-szulfonil-fluorid) a sejtfal megbontásakor működésbe lépő proteázokat irreverzibilisen gátolja, a DTT (ditio-treitol) megvédi a szabad SH csoportokat az oxidálódástól úgy, hogy önmaga oxidálódik. Mivel bomlékonyak, mindig frissen adjuk a pufferhez. 50 ml pufferhez 50 mg lizozimet adagolunk, majd késhegynyi DNáz-t és RNáz-t. 30 percig jégen kevertetjük az oldatot. Ezután 3-szor 60 másodperces szonikálás következik, majd 0,1 %-os deoxikólsavat adunk hozzá. Újabb 30 percig jégen kevertetjük a szuszpenziót. 25 perces fordulatszámú centrifugálás után a csapadékot újra felszuszpendáljuk 1 M NaCl-t is tartalmazó lízis pufferben és lecentrifugáljuk. Az MPMV dutpáz az első centrifugálás után kapott felülúszóban, míg az MPMV-NC dutpáz a második centrifugálás utáni felülúszóban található. A felülúszót egy éjszakán át hidegszobában dializáljuk. A dialízishez felhsznált puffer: 50 mm TRIS, 50 mm NaCl, 0,1 mm PMSF, 1 mm DTT, ph = 7,05. A dutpáz ioncserélő kromatográfiás elválasztása Gradifrac készüléken Q-Sepharose illetve az MPMV-NC dutpáz elválasztása CM-Sepharose anioncserélő gyantán történik. 22

23 2.2. Drosophila lárva extrakt előállítása A Drosophila petékből kikelt lárvákat vízzel eltávolítjuk a táptalajról, majd lízispufferrel (10 mm TRIS, 40 mm KCl) átmosva lefagyasztjuk. A részben felolvasztott lárvákhoz kb. feleannyi mennyiségű lízis puffert, majd proteázgátlót (0,5 mm PMSF, 2 mm benzamidin) és DTT-t adagolunk. Kevergetés után félig jeges állapotban 3x1 percig szonikáljuk és vékony injekciós tűbe felszíva roncsoljuk a sejteket. Ezt háromszor megismételjük és a már teljesen felolvadt lárva extraktot fordulatszámon 20 percig centrifugáljuk. A felülúszó sterilszűrése után megkapjuk a nyers extraktot, amelyet forralás után újra leszűrünk és felhasználjuk a mérésekhez. 23

24 2.3. A mérésekben felhasznált módszerek elmélete A pontos kísérleti körülmények az egyes kísérletek leírásánál, az Eredmények és Értékelésük fejezetben található, mivel a diplomamunka készítése során végzett mérések sokfélesége és a körülmények egyedi beállítása miatt ezt a tárgyalási módot alkalmasabbnak találtam UV spektroszkópia Az anyagok ultraibolya és látható színképtartományba eső fényabszorbciója a molekulák elektronszerkezetétől függ, az abszorbció során az elektronok alapállapotból magasabb energiájú pályára kerülnek. A nm közötti tartományt gyakorlati okokból 3 részre, nevezetesen látható ( nm), közeli ultraibolya ( nm) és távoli vagy vákuum ultraibolya ( nm) tartományra osztjuk. Az ebben a tartományban lejátszódó fényabszorbció a molekulák elektronenergiáját változtatja meg azáltal, hogy egy kötő pályán (σ,π) lévő vegyértékelektront, vagy nem kötő pályán (n) lévő, ún. magános elektronpár egyik elektronját a legkisebb energiájú, be nem töltött lazító pályára (σ*,π*) emeli. A felvett energia az alap és gerjesztett állapot energiakülönbségétől függ, minél kisebb az állapotok közti energiadifferencia, annál nagyobb az abszorbeált fény hullámhossza. A közeli ultraibolya színképtartományba eső fényabszorbciókhoz tartozó gerjesztési energia a kötési energiákkal azonos nagyságrendbe esik. Oldatok esetében a fényabszorbció mértéke az elektrongerjesztés típusán kívül az oldat koncentrációjától és az alkalmazott küvetta rétegvastagságától függ, mely a Lambert-Beer törvény szerint a következő alakban írható fel: log(1/t)=log(i0/i)=ε*c*d=a ahol T=I/I0 az oldat transzmissziója, I0 az oldatba belépő monokromatikus fény intenzitása, I az oldatból távozó monokromatikus fény intenzitása, ε a moláris abszorbciós koefficiens, c az oldat koncentrációja mol/dm3 egységben, d a küvetta rétegvastagsága cm egységben, A az oldat abszorbanciája. 24

25 A spektrofotométerek a vizsgálandó anyag transzmisszóját (T) vagy abszorbanciáját (A) a hullámhossz vagy a hullámszám függvényében rajzolják fel. Ez az anyag abszorpciós spektruma. Az UV színképek döntő többségét oldatban vesszük fel, amelynél az abszorbancia 0,1-0,8 értékek között mérhető a legpontosabban. A méréshez kvarcküvettákat használunk SDS-poliakrilamid-gélelektroforézis Ezt a módszert preparált, illetve tisztított minták tisztaságának ellenőrzésére használtuk. SDS, (Na-dodecilszulfát) anionos detergens jelenlétében a fehérjék denaturálódnak. A denaturálódott fehérjéket poliakrilamid gélen választjuk el.a denaturáció mechanizmusa az, hogy a fehérjéhez kötődő negatív töltésű dodecil-szulfát anionok elektrosztatikus kölcsönhatás révén a polipeptidlánc kitekeredését indukálják. A gélre vitt minták DTT- t is tartalmaznak, hogy redukálja a diszulfid hidakat és megakadályozza S S hidak keletkezését. Egységnyi kitekeredett fehérjelánchoz különböző fehérjék esetén azonos mennyiségű SDS kötődik, így a fehérje komponensek tömeg/töltés aránya állandó. Így a fehérjék molekulatömegük sorrendjében válnak el a gélen. A legkisebb molekulák jutnak át rajta a leggyorsabban.kísérleteink során 14%-os gélt használtunk, a futtatás után a géllapokat Coomassie Brilliant Blue R 250 festékkel festettük meg. Az SDS-poliakrilamid gélen szétválasztott és megfestett mintákat denzitometriás módszerrel értékeltük ki Biacore rendszer A BIACORE rendszer két molekula közötti kölcsönhatás vizsgálatának eszköze. A rendszer használatával lehetségessé válik a molekulák közötti kölcsönhatások időben történő mérése. A BIACORE magas fokú automatizáltsága lehetővé teszi reprodukálható mérések kivitelezhetőségét, a másik nagy érdeme pedig, hogy nagyon kis mennyiségű minta elegendő a mérések elvégzéséhez illetve egy vizsgálat rövid időt vesz igénybe. A BIACORE rendszer egy szenzor csip felületére immobilizált molekula és a csip mellett áramló oldatban lévő molekulák közötti kölcsönhatást vizsgálja. A csipet üveg, arany és dextrán rétegek alkotják. A módszer a szenzor fém felülete mellett áramló oldat törésmutatójában bekövetkezett változás mérésére a felületi plazmon rezonancia (surface plasmon resonance, SPR) optikai jelenségét használja fel. A specifikus kölcsönhatások a felület és az áramló oldatban lévő molekulák között a felület közvetlen közelében 25

26 megváltoztatják az oldat koncentrációját, mely hatással van a törésmutatóra. Ez a változás SPR jel formában időben folyamatosan követhető, így közvetlenül ellenőrizhető a molekuláris kölcsönhatások folyamta. Két különbözõ refraktív indexű anyag határfelületén a beeső fény egy bizonyos szög felett visszaverődik (ezt nevezzük teljes belső visszaverődésnek, TIR), ugyanakkor az elektromágneses tér egy komponense - evaneszcens hullám- behatol az alacsonyabb refraktív indexű közegbe. Ha az evaneszcens hullám kölcsönhatásba lép egy vezető tulajdonságú anyaggal, mint a fém, akkor átjutva a fém rétegen elektromágneses hullámokat gerjeszt, melyek tovább terjednek a fém felszín és a minta oldat határfelületéhez. Ezt a jelenséget hívjuk felszíni plazmon rezonanciának (SPR). Ha az SPR jelenség megvalósul, akkor a beeső fény energiája a plazmonoknak adódik át és intenzitása egy karakterisztikus szögnél mérve jelentősen lecsökken (SPR szög).az SPR szög többek között függ azon közeg refraktív indexétől, amelybe az evaneszcens hullám bejutott (a fémfelület meg nem világított oldalán). Ezt a refraktív indexet a fémfelületen lévő anyagmennyiség befolyásolja. Ha a mérőcellában áramoltatott molekula kölcsönhatásba lép a fémfelülethez immobilizálttal, akkor megváltozik a fémlemezen lévő anyagmennyiség. Ez okozza a refraktív index változásán keresztül az SPR szög változását, amit detektálunk. 11. ábra SPR detektáló rendszer 26

27 A detektált jel egysége a resonance unit (RU), melynek ezerszerese az SPR szög 0,1 változásának felel meg. Az SPR jel változását a szenzorgramon követjük végig. A Biacore rendszer fényforrása egy 760 nm hullámhosszú fényszóró dióda, amely által kibocsátott fényt egy háromszög alakú prizma fókuszálja a szenzor csip felületére. Ha a mérés alatt az enzim molekula kölcsönhatásba lép az áramló oldatban lévő valamely molekulával, akkor a szenzorgramon a következő görbe jelenik meg. (12. ábra) Az oldat és az adszorbeált biomolekulák hatására a felszíni réteg refraktív indexének változásából alakul ki az SPR jel. [36] STOP START 12. ábra SPR jel A START nyíl az injektálás kezdetét, a STOP a befejezést jelöli. Általában a mért paraméterek a jel változásának a mértéke (binding kinetics) és a jel a minta injektálása előtti és utáni különbsége (amount bound) Cirkuláris dikroizmus spektroszkópia A CD spektroszkópia a polarizált fény és egy optikailag aktív anyag kölcsönhatásán alapul. A lineárisan polarizált fénysugár felbontható két cirkulárisan polarizált, jobbra és balra forgó komponensre, amelyek azonos fázisban vannak és amplitúdójuk is megegyezik. Egy optikailag aktív molekula fényelnyelése a lineárisan polarizált fény két, cirkulárisan polarizált fénykomponenséből különböző mértékű, ezért az optikailag aktív molekulán átengedett lineárisan polarizált fény elliptikusan polarizálttá válik és a polarizáció iránya a polarizáció eredeti síkjához képest adott szöggel elfordul. Ez a cirkuláris dikroizmus (CD) jelensége. 27

28 Az optikailag aktívmolekulának az egyes komponensekre vonatkozó moláris abszorpciós koefficiensei különbözőek: ε = εb - εj 0 A hullámhossz függvényében mérve az abszorpciós koefficiensek különbségét megkapjuk az optikailag aktív mintára jellemző CD spektrumot. A CD spektrométerrel a balra és jobbra polarizált fénykomponensek abszorpciójának különbségével ( A) arányos ellipticitást (θ) mérjük, melyek között a következő összefüggés áll fenn: θ = 2,303( Ab A j ) 4 A CD mérőszámaként a ε-t vagy az ezzel arányos moláris ellipticitást ([θ]) használjuk: [θ]= 3300 ε A méréshez használt műszer a CD spektropolariméter. Található benne egy UV fényforrás, amely fényét először kvarc prizmák lineárisan polarizálják. A monokromatikus, lineárisan polarizált fény ezután a modulátorba jut, amely felváltva állít elő belőle jobbra illetve balra cirkulárisan polarizált fényt. A vizsgálandó oldat egy speciális kvarc küvettában helyezkedik el, amely az UV fényt teljesen átengedi és nincsen optikai aktivitása. A küvetta hőmérsékletét egy vizes termosztáttal segítségével állíthatjuk be. A mintán áthaladt cirkulárisan poláros fény a detektorba jut, ami detektálja a CD jelet ( ε). A CD spektroszkópia egyik fő alkalmazási területe a fehérjék szerkezetvizsgálata, mivel a CD spektrum nagymértékben függ a vizsgált fehérje másodlagos szerkezetétől és nagyon érzékeny a szerkezet változásaira. A CD spektrumok szerkezetvizsgálat szempontjából két tartományát különböztetjük meg. A távoli UV tartományban (180nm-240nm), amely megfelel a peptidkötés fényelnyelési tartományának, mért CD spektrumból a fehérje másodlagos szerkezetére lehet következtetni (α-hélix, β-lemez). A CD spektrum természetesen még egyszerű molekulák esetében sem egyetlen jelből áll, hanem több különböző előjelű bonyolult sáv átfedéséből jön létre, mivel egy molekulában több különböző elektronátmenet gerjesztés lehetséges. A spektrumot azonban fel lehet bontani az egyes elektronátmeneteknek megfelelő sávokra. Adott módszerrel a másodlagos szerkezetek aránya jól megbecsülhető a távoli UV CD spektrumból egy fehérjében. 28

29 A közeli UV tartományban (240nm-340nm), ahol az aromás aminosav oldalláncok elnyelése a jellemző, a felvett CD spektrum a fehérje térszerkezetére és annak megváltozására ad információt. Az aromás oldalláncok egymáshoz képest vett térbeli elhelyezkedése nagymértékben befolyásolja a spektrumot, melynek változásából következtethetünk a fehérje térszerkezetének megváltozására. Jól lehet vizsgálni a ligandok fehérjéhez való kötődését, mivel a kötődés okozta konformáció változás perturbálhatja a fehérje CD spektrumát. A távoli UV tartomány CD spektrumának intenzitása három nagyságrenddel nagyobb, mint a közeli UV CD spektrum intenzitása. [37] FPLC ( Gyors Fehérjeelválasztási Folyadék Kromatográfia ) A kromatográfiában egy szilárd és azon átáramló mozgó fázis közötti megoszlás következtében megy végbe az elválasztás. A kromatográfiás folyamat tehát a mintakomponenseknek az állófázisban való keresztülhaladása során végbemenő ismételt szorpciós-deszorpciós folyamatok eredménye. Az egyes mintakomponensek megoszlási együtthatói közötti különbségek hatására megy végbe a komponensek elválasztása. Bármely időpillanatban a mozgófázisban található molekulák relatív mennyisége határozza meg azt, hogy a komponens milyen gyorsan halad át az oszlopon. A detektor (a mi esetünkben UV detektor) az elválasztás kezdete óta eltelt idő függvényében ábrázolja a különféle komponensek koncentrációját. AZ FPLC az ún. adszorpciós kromatográfiák közé tartozik, vagyis az állófázist nagy fajlagos felületű szilárd szemcsék alkotják, a minta komponenseinek retencióját az okozza, hogy reverzibilisen kötődnek az állófázist alkotó szemcsék felületéhez. A regisztrált kromatogram négy, a kapott elválasztás jellemzésére alkalmas tulajdonsággal írható le. Először is ideális esetben minden komponens szimmetrikus haranggörbe (Gauss-görbe) alakkal jellemezhető csúcs formájában lép ki az oszlopból és minden csúcs a komponens anyagi minőségének jellemzésére alkalmas, meghatározott idő eltelte után hagyja el az oszlopot. A minta injektálása és az oszlop végén a csúcsmaximum megjelenése között eltelt idő retenciós időnek nevezzük (tr). A harmadik jellemző a szomszédos csúcsok retenciós idejének különbsége. Minél nagyobb ez a különbség, annál könyebben választható el a két komponens. Végül pedig minden komponensre jellemző a tb sávszélesség. A folyadékkromatográfiában az oszlop hatékonyságának jellemzésére az N elméleti tányérszámot használják: 29

30 N = 16(tR/tB)2, N tehát megadja, hogy az adott oszlop, adott komponens esetén mennyire alkalmas keskeny sávok (kis tb) és jó elválasztások megvalósítására. Az oszlop N elméleti tányérszáma arányos az oszlop L hosszával: N = L/H, ahol a H arányossági tényező, amely az elméleti tányérok közötti távolságot illetve az egy elméleti tányérral ekvivalens töltésmagasságot fejezi ki. Kisebb H érték hatékonyabb oszlopot, nagyobb N értéket jelent. A folyadékkromatográfiás gyakorlatban mindig kis H, azaz maximális N érték elérésére törekszünk. Ennek eléréséhez apró szemcséjű oszloptöltetre, lassan áramló eluensre, lehetőleg kis viszkozitású oldószerre, nagyobb elválasztási hőmérsékletre és hosszú oszlopokra van szükség. Az FPLC technika a hagyományos folyadékkromatográfia és a HPLC technika között foglal helyet, mind hatékonyságát, mind műszerezettségét tekintve. Az elválasztást megnövelt nyomáson végezzük. Az FPLC technikát dutpáz katalízise során képződő dump és a visszamaradó dutp elválasztására használjuk. Ezért Mono Q anioncserélő oszlopt alkalmaztunk, melyen a mono- és trifoszfát csoportok eltérő nagyságú negatív töltéseik miatt különböző mértékben képes megkötődni a termék dump és az esetleg visszamaradt dutp. 30

31 2.4. Felhasznált anyagok beszerzési forrásai Ampicillin DTT dudp dutp EDC EDTA Etanol Etanolamin HBS IPTG Lizozim MES MgCl2 NaCl NHS P20 PMSF TES A-2804 Sigma ,4 g/mol Reanal ,25 g/mol D-3626 Sigma Lot 127F ,2 g/mol D-4001 Sigma Lot 48H ,1 g/mol Biacore AB Reanal ,24 g/mol Budapest Szeszgyár Biacore AB Lot Biacore AB 013 Serva ,3 g/mol Reanal 121í8 M-8250 Sigma Lot 71H ,2 mg/ml Reanal analítikai tisztaságú Reanal ,44 g/mol Biacore AB Biacore AB BR p-7626 Sigma 174,2 g/mol T-1375 Sigma Lot 54H ,2 g/mol 31

32 3. Eredmények és értékelésük 3.1. A dutpáz szubsztrátanalóg liganddal történő kölcsönhatásának vizsgálata Diplomamunkám készítése során vizsgáltam a dudp dutpázra gyakorolt gátló hatását. Ez az enzim szubsztrátanalóg kapcsolat már ezt megelőzően E. coli enzimmel elvégzett kísérletek tárgya volt. Ekkor azt is megállapították, hogy a dudp molekula gátolja a dutpáz aktivitását. Célom az volt, hogy hasonló kísérleteket végezzek MPMV-NC, MPMV és Drosophila dutpáz enzimekkel, továbbá a dudp-dutpáz komplex disszociációs állandóját meghatározzam dudp enzimatikus szintézise A dutp + dump dudp reakció, melyet a nukleozid-monofoszfát-kináz katalizál egy egyensúlyi folyamat, amelynek során dudp szintetizálódik. Hogy a reakció lefolyása után kapott elegy valóban nagyobbrészben dudp-t tartalmaz-e, enzimaktivitási mérésekkel megállapíthatjuk, mivel a dudp már alacsony koncentrációban gátolja a dutpáz enzimet dudp tisztítása A fent említett dudp előállítási reakciója során dudp mellett dump és dutp is marad a reakcióelegyben. Tiszta dudp előállítása céljából FPLC-t, azaz gyors fehérjeelválasztási folyadék kromatográfiát alkalmaztunk, Mono Q anioncserélő oszloppal. Az oszlopon a mono-, di, és trifoszfát csoportok eltérő számú negatív töltéseik miatt különböző mértékben képes megkötődni a dump, a dudp illetve dutp. Először átmossuk az oszlopt 60mM "A" (AMBIK Ammonium-bikarbonát) pufferrel, majd beinjektáljuk a mintát. Újra mossuk "A" puferrel az oszlopot, hogy azok a komponensek, melyek nem tudtak kötődni az oszlopon kimosódjanak. Ezután "B" gradienst alkalmazunk.(600mm AMBIK) A növekvő sókoncentráció következtében az oszlopon kötődött molekulák távoznak. 32

33 A tisztítandó mintát 50 és 500 µl-enként vittük fel a kromatográfiás oszlopra. A kromatogramon megjelenő csúcsokat külön kémcsövekbe szedtük. A lejött frakciókat lefagyasztottuk, majd töményítés céljából liofilizáltuk és visszaoldottuk desztillált vízben dudp gátlás mérése A mérés kivitelezése A mérést JASCO V550 fotométerrel végeztem el. Az enzim által katalizált dutp dump + PPi reakció során protonok szabadulnak fel, melyeknek a mennyisége egyenesen arányos a képződő dump mennyiségével. A felszabaduló protonok mérhető mértékben savanyítják a közeget. A méréshez a puffer 1 mm TES-t, 150 mm KCl-ot, 40 µm fenolvörös indikátort és 5 mm MgCl-ot tartalmaz, így a ph változást a fenolvörös színváltozásán keresztül követjük, 559 nm-en mérve az oldat abszorbanciáját. enzim dutpáz mM 50mM 50mM 50mM 50mM 50mM 50mM 50mM 50mM dutpáz 50mM szubsztrát dutp inhibitor dudp 32µM 32µM 32µM 32µM 32µM 32µM 32µM 32µM 32µM dutp 0 40µM 200µM 300µM 400µM 500µM 600µM 700µM 800µM dump 32µM 800µM kezdeti sebesség [Abs/min] 0,107 0,106 0,1092 0,08 0,071 0,0697 0,0708 0,057 0,0506 kezdeti sebesség [Abs/min] 0,11 1. táblázat Az aktivitásmérés eredményei A mérési eredmények (1. táblázat) mutatják, hogy a dudp mennyiségének növekedése az aktivitás csökkenését eredményezi. 300 µm dudp hozzáadása már gátolja a reakciót. Kontroll mérésként 800µM mennyiségű dump-t adtunk a reakcióelegyhez, mivel ez is a 33

34 dutpáz inhibitora, de jóval gyengébb, mint a dudp. A kapott kezdeti sebesség értéke 0,11 1 /min lett, amely mutatja, hogy a dudp valóban jobb inhibitor, mint dump. A mérés célja egyben az is, hogy az inhibitor disszociációs állandóját meghatározzuk. Ehhez a mérési eredményeket Webb féle módszerrel ábrázoltam (13. ábra), amelynek egyenlete: tgα = KI(1+[S]/KM). [38] 6 v0/(v0-vi) ,001 0,002 0,003 0,004 0,005 1/[I]. 13. ábra Webb ábrázolás A kapott egyenes egyenlete: y = 872,85x + 1,0282 A Webb ábrázolás során kapott egyenes egyenletéből és irodalmi adatokból vett KM értékből [27] az enzim-ligand komplex inhibíciós állandója meghatározható. 872 = KI(1+32µM/0,28µM) Az egyenletből kiszámolva KI = 7,56 µm MPMV-NC dutpáz és dudp kölcsönhatásának vizsgálata CD spektroszkópiával közeli UV tartományban Vizsgálataink célja az volt, hogy MPMV-NC illetve MPMV dutpáz enzimek esetében megvizsgáljuk azt, hogy a dudp aktív centrumba való kötődése által indukált 34

35 komformáció változás perturbálja a fehérje CD spektrumát illetve hogy az enzim ligand komplex disszociációs állandóját meghatározzuk. Mérés kivitelezése A méréseket Jasco J-720 Spectropolariméterrel végeztem. A spektrumokat 50 mm TRIS, 0,3 M NaCl, 10 mm MgCl2, 1 mm DTT összetételű pufferben vettem fel. Ennek megfelelően ez volt az alapvonal. Megmértem az enzim és különböző koncentrációkban (30µM-90µM) a dudp spektrumát továbbá az enzim ligand komplex által indukált spektrumokat, amikor a minta növekvő koncentrációban tartalmazott dudp-t. A fontosabb mérési paraméterek: Hullámhossz: nm Küvettaúthossz: 1 cm Pásztázási sebesség 50 nm/perc Érzékenység: 100 mdeg Sávszélesség: 0,5 nm A mérések eredménye szerint a dudp ligandnak (14. ábra fekete vonal) 270 nm nél maximumot mutató spektruma van. A koncentrációjának növelésével ez a maximális ellipticitási érték lineárisan növekszik. A dutpáz által indukált CD spektrumból (14. ábra piros vonal) kiderül az, hogy a minta a fehérje mellett más összetevőt is tartalmaz. Az enzimoldatot előzetesen UV spektrofotométeren a koncentrációjának meghatározása céljából vizsgáltuk. Ekkor kiderült a kapott spektrumból, hogy 260 nm-nél jelentős elnyelése van a mintának, ami arra utal, hogy nagy mennyiségben tartalmaz nukleotidokatt. DNáz-os kezeléssel próbáltuk eltávolítani, de nem jártunk sikerrel és ezért az UV spektrumból nem tudtuk kiszámolni a fehérjekoncentrációt. Az enzim dudp inhibitorral való titrálása során a dudp koncentráció növekedésével az indukált spektrumok maximuma is egyre nagyobb ellipticitás értéket vett fel. Egy adott dudp koncentrációnál az enzim ligand komplex által indukált spektrumot (14. ábra kék vonal) összehasonlítottam az enzim és a ligand spektrumainak az összegével (14. ábra zöld vonal). Az irodalomból már megismert E. coli dutpáz és a Drosophila dutpáz késöbbiekben ismertett hasonló spektrumaik jelentősen különböznek. MPMV-NC dutpáz esetében nincs nagy eltérés a két spektrum között, amely a dudp által okozott komformáció változást jelenthetné. 35