SZAKDOLGOZAT. BÉKÉSI ANGÉLA ELTE TTK V. éves kémia tanár szakos hallgató

Átírás

1 SZAKDOLGOZAT BÉKÉSI ANGÉLA ELTE TTK V. éves kémia tanár szakos hallgató A FUNKCIONÁLISAN KOMPETENS VANADIL(IV) KATION SPINCÍMKE A dutpáz ENZIM AKTÍV CENTRUMÁBAN Témavezető: Dr. Vértessy G. Beáta MTA SzBK Enzimológiai Intézet Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Budapest, 2001.

2 2 Tartalomjegyzék Köszönetnyilvánítás 3 Rövidítések jegyzéke 4 Bevezetés, célkitűzés 5 1. A dutpáz Szerepe az élő szervezetben A dutpáz enzimcsalád képviselői A trimer dutpáz szerkezete A dutpáz, mint új target molekula gyógyszerszintézisek számára EPR-ENDOR vizsgálatok szerepe a dutpáz-katalízis mechanizmusának leírásában A vanádium oxidációs állapotai és a vanadil kation jellemzői 2. Anyagok és módszerek A felhasznált módszerek elmélete dutpáz preparálása Kinetikai analízis CD spektroszkópia Izotermális titráló mikrokalorimetria (ITC) FPLC (Gyors fehérjeelválasztási folyadék kromatográfia) Nagyfeloldású szerkezet elemzése Felhasznált anyagok Általános vegyszerek Eredmények és értékelés Vanadil hatása az enzimaktivitásra A vanadil katalitikus kompetenciája (FPLC) Kezdeti sebesség meghatározása Részletes kinetikai analízis (KM, vmax, kkat) dudp-dutpáz komplex vizsgálata CD spektroszkópiás eredmények A komplexálódás termodinamikai paramétereinek meghatározása (ITC) Feltételezett szerkezet 50 Eredmények összefoglalása 53 Irodalomjegyzék 54 2

3 3 Köszönetnyilvánítás Köszönettel tartozom Dr. Vértessy Beátának, aki lehetővé tette számomra, hogy a kutatócsoportjában dolgozhassam, és mint témavezető megismertetett a téma alapjaival, irányított a munkában, és segített a felmerülő problémák megoldásában. Köszönöm Dr. Friedrich Péter professzornak, az Enzimológiai Intézet igazgatójának, hogy engedélyezte munkámat az intézetbenben. Szeretném megköszönni Dr. Vonderviszt Ferencnek, hogy lehetővé tette számomra a Veszprémi Egyetemen az izotermális titráló mikrokaloriméter használatát és Gugolya Zoltánnak, hogy tanácsaival segítette az ottani munkámat. Köszönettel tartozom továbbá Dr. Marvin Makinen professzornak és Dr. Musztafi Devkumarnak az University of Chicago Biokémiai és Molekuláris Biológiai Tanszékén, együttműködésüknek köszönhetők a dutpáz enzimmel végzett EPR-ENDOR vizsgálatok. A csoport minden tagjának és minden munkatársnak köszönöm a jó, baráti légkört és minden segítséget, amit a munkámhoz nyújtottak. 3

4 4 Rövidítések jegyzéke AMBIK CD dntp DTT dttp dudp dump dutp dutpáz EDTA EGTA ENDOR EPR FPLC IPTG ITC LB MOPS PMSF PPi TES TFB VOacac VOSO4 α-β-imino-dutp ammónium-hidrogén-karbonát Cirkuláris Dikroizmus dezoxi-nukleotid-trifoszfát ditio-treitol dezoxi-timidin-trifoszfát dezoxi-uridin-difoszfát dezoxi-uridin-monofoszfát dezoxi-uridin-trifoszfát (dezoxi-uridin-trifoszfát)-nukleotido-hidroláz etilén-diamin-n,n,n,n -tetraecetsav etilénglikol-bisz[β-aminoetiléter]-n,n,n,n -tetraecetsav Electron Nuclear Double Resonance Electron Paramagnetic Resonance Fast Protein Liquid Chromatography izopropil-tio-galaktozid Izotermális Titráló Mikrokalorimetria Luria-Bertani (tápoldat) 3-[N-morfolino]propán-szulfonsav fenil-metil-szulfonil-fluorid anorganikus pirofoszfát N-tris[hidroximetil]metil-2-amino-etán-szulfonsav transzformáló puffer vanadil-acetil-acetonát vanadil-szulfát α-β-imino-dezoxiuridin-trifoszfát 4

5 5 Bevezetés, célkitűzés A dezoxiuridin trifoszfát nukleotidohidroláz (dutpáz) enzim a dutp pirofoszforolízisét katalizálja az alábbi reakció alapján: dutp dump + PPi A folyamat a nagyenergiájú foszfát hidrolízise miatt gyakorlatilag irreverzibilis, ezért egyirányú nyíllal írható le. Ezzel a reakcióval az enzim csökkenti a sejtbeli dutp szintet, és közben termeli a dump metabolitot, ami a dttp bioszintézisének egyik prekurzora (a timidilát szintáz szubsztrátja). A DNS polimeráz dttp felhasználásával építi be a DNS-be a timidilát alkotóelemet (a timin bázist az adenin bázissal szembe). A dutp eltávolítása és a dttp termelésének elősegítése a dutp/dttp arány jelentős csökkenéséhez vezet, ami megakadályozza az uracil DNS-be épülését. Az enzim aktivitásának hiányában az osztódó sejtben magas uraciltartalmú DNS szintetizálódik, ami egy hatékony uracilkivágáson alapuló javító mechanizmus hiábavaló hiperaktivitásán keresztül a kromoszóma fragmentálódásához vezet, így pedig a sejt halálához. Ezt a jelenséget nevezik timinmentes sejthalálnak. A DNS integritásának biztosításában betöltött szerepe miatt a dutpáz enzim esszenciális jelentőségű minden élő szervezet számára. Ezt támasztja alá az a tény is, hogy nem csak eukariótákban és prokariótákban van általánosan jelen, hanem számos vírus is kódolja genomjában a saját dutpázát (herpeszvírusok, továbbá limitált méretű genommal rendelkező retrovírusok: egyes lentivírusok, B és D típusú onkovírusok). A dutpáz gátlása vírusfertőzött vagy aktívan osztódó sejtekben a vírus ill. a sejt halálához vezet, ezért az enzim új célpont lehet antivirális és antitumor hatású gyógyszerek tervezésében. A különböző organizmusokból származó dutpázok szerkezetének és katalitikus ciklusának részletes vizsgálata, a különbségek karakterizálása elengedhetetlen a fajspecifikus dutpáz antagonisták tervezéséhez. Az enzim fontos kofaktora valamilyen kétértékű fémion. Fiziológiás körülmények között ez a Mg2+, viszont az enzim nagyfokú szubsztrátspecificitása mellett a fémionra nézve 5

6 6 kevésbé specifikus. Ez lehetővé teszi, hogy a Mg2+-ot más kétértékű fémionnal helyettesítsük. Amennyiben egy megfelelő spincímkeként működő fémion kompetens módon helyettesíti a Mg2+-ot, lehetőség nyílik az un. EPR-ENDOR spektroszkópiai módszer alkalmazására nagyfeloldású, oldatfázisú szerkezetvizsgálat céljából. A dolgozat fő célkitűzése az volt, hogy megfelelő spincímkeként működő fémionok hatását vizsgálja a dutpáz enzim működésére. Összehasonlító enzimkinetikai méréseket végeztem Mg2+, VO2+ és Mn2+ jelenlétében és fémionok távollétében. Másik célkitűzésem az enzim és a közeli szubsztrátanalóg nukleotid, a dudp kötődésének termodinamikai karakterizálása volt fémion jelenlétében és távollétében. Ebből a célból két független módon, cirkuláris dikroizmus spektroszkópiával és izotermális titráló mikrokalorimetriával követtem a komplexálódás folyamatát. 6

7 7 1. A dutpáz 1.1. A dutpáz szerepe az élő szervezetben A DNS integritásának megőrzése minden élő szervezet számára létfontosságú. Számos környezeti hatás eredményezhet a DNS-ben az élőlényre nézve súlyos következményekkel járó változásokat, amelyek akár örökletesek is lehetnek. Ezért a DNS-ben keletkező hibák kijavítására több mechanizmus alakult ki (pl. timidin dimerek kivágása, nem komplementer bázispár javítása, stb.). Néha még a fiziológiás körülmények is mutagén hatással lehetnek. Egy ilyen spontán, fiziológiás körülmények között bekövetkező folyamat a citozin oxidatív dezaminálása, ami uracilt eredményez [1]. Ez a módosulás a következő replikáció alkalmával pontmutációt eredményezne, ezen hatás kivédésére van azonban egy báziskivágáson alapuló javító mechanizmus, amely eltávolítja az uracilt a DNS-ből (1. ábra). A javító mechanizmus első lépésében az uracil-dns glikozidáz elhasítja a dezoxiribóz és az uracil közti glikozidos kötést. Az így bázis nélkül maradt helyen az AP-endonukleáz elhasítja a DNS dezoxiribóz-foszfát gerincszálát úgy, hogy a 3 OH marad szabadon. Ezután a DNS polimeráz - endogén foszfodiészteráz hatása révén - eltávolítja a bázis nélküli dezoxiribózt, és a 3 OH valamint a megfelelő nukleotid-trifoszfát felhasználásával komplementer bázist épít be [2]. Végül pedig a DNS ligáz enzim elvégzi a gerincszál összevarrását. 1. Ábra Báziskivágáson alapuló javító mechanizmus az uracil DNS-ből történő eltávolítására. U: uracil, N: megfelelő komplementer bázis. 7

8 8 Ez a mechanizmus védelmet nyújt a citozin kémiai instabilitásával szemben, de nyilvánvalóan nem tud különbséget tenni a citozin oxidatív dezaminálásával keletkezett, mutagén és a DNS szintézisekor esetleg timin helyére beépült, nem mutagén uracil között. Ezért a timin helyére való uracilbeépülést a dntp szintek pontos szabályozásával kell a sejtnek kivédenie (a DNS polimeráz ugyanis nem tud különbséget tenni a dutp és a dttp között). Az alacsony dutp/dttp arányt a dutpáz enzim a dutp elbontásával és a termék dump dttp-prekurzor volta miatt két oldalról is biztosítja. A dutpáz tehát olyan preventív DNS javító faktor, amely egyedülálló módon, megelőzéssel küszöböl ki egy súlyos következménnyel járó DNS hibát. dutpáz hiányában a magas dutp/dttp arány a DNS uraciltartalmának jelentős növekedését okozza. Ez által aktivizálódik az uracil kivágásán alapuló javító mechanizmus (1. ábra). A javítás azonban továbbra is fennálló magas dutp/dttp arány mellett nem lehet sikeres, mert a DNS polimeráz a kivágott uracil helyére újra uracilt épít be. Az így felerősödő hiábavaló ciklus kettősszáltörésekhez, az pedig kromoszómafragmentálódáshoz és a sejt halálához vezet (2. ábra)[3, 4]. 2. Ábra A dutpáz szerepe a DNS integritásának megőrzésében 8

9 9 A dutpáz gátlása programozott sejthalál elősegítője is lehet a természetben: a Drosophila melanogaster a dutpáz mellett genomjában kódol egy endogén inhibitor fehérjét is, ami a lárvaállapotok során aktiválódik, elősegítve ezzel a későbbi bábállapotban egyes sejtek elhalását [5]. A dutpáz gén kifejeződése függ a sejt differenciáltságától: csak a sejtosztódáskor számottevő az enzim bioszintézise, hiszen csak ekkor van rá szükség a korrekt DNS szintézis végett [6]. Ezért az enzim gátlása is csak az aktívan osztódó szövetekben okozhat jelentősebb kárt, ami reményt nyújt a dutpáz-inhibitorok daganatos megbetegedések esetén történő terápiás alkalmazására is [7]. Számos vírus is kódolja genomjában a saját dutpáz fehérjéjét. A virális dutpáz elsősorban azon vírusok számára fontos, melyek differenciált sejteket támadnak meg, hisz az ilyen gazdasejtben nincs elegendő dutpáz jelen. A virális dutpáz gének nullmutációja csökkenti a vírus fertőző- és szaporodóképességét a differenciált sejtekben, szövetekben. Ez a tény arra utal, hogy egyes vírusos megbetegedések gyógyításában a virális dutpáz antagonistái terápiás jelentősséggel bírhatnak [8-11] A dutpáz enzimcsalád képviselői 9

10 10 A különböző organizmusokból származó dutpázok szerkezetüket tekintve különböző mértékben eltérnek egymástól. Az aminosav szekvencia szintjén nagyfokú eltérés mutatkozik, de minden dutpázban fellelhető 5 konzervatív szekvenciamotívum, melyeknek lényeges szerepük van az enzim harmadlagos és negyedleges szerkezete, ill az aktív centrum kialakításában [12]. A dutpázok két nagy csoportra oszthatók: a herpesztípusú és az un. EuBaR (az elnevezés a származásukra utal: eukarióta, bakteriális, retrovirális) típusú dutpázok csoportjára [13]. A herpesztípusú enzimek monomerek, szemben a többi dutpázzal, amelyek homotrimer szerkezetűek [9, 10]. A monomer dutpázok kb aminosavat tartalmaznak, szemben a trimer enzimekkel, amelyek peptidlánconként mintegy feleannyi, aminosavat tartalmaznak csupán. Továbbá lényeges különbség az is, hogy a monomer enzimben a konzervatív motívumok más sorrendben és különböző távolságban vannak egymástól, mint a többi dutpázban (3.ábra). Feltételezhető, hogy a monomer változat egy ősi dutpáz gén duplikációja kapcsán jelent meg az élővilágban. Az alábbiakban az EuBaR típusú dutpázokkal foglalkozunk részletesebben. Ezek az enzimek új gyógyszerkutatási célpontot jelenthetnek, továbbá fehérjeszerkezeti szempontból is nagyon jelentős a homotrimer enzimmolekula felépítése. 3. Ábra Konzerválódott szekvenciamotívumok a dutpázok két fő csoportjában A EuBaR dutpázok esetén érdemes megkülönböztetni a pro- ill. eukarióta szervezetekből származó enzimeket. Érdekes és valószínűleg funkcionálisan is fontos szerkezeti különbség mutatkozik a két csoport között [14, 15]. Nagyfeloldású kristályszerkezetek alapján ismeretes, 10

11 11 hogy az eukarióták dutpázaiban a polipeptid láncok közti kommunikáció poláros csoportok közti hidrogén-kötésekkel történik, ezzel szemben a prokarióta ill virális dutpázokban apoláros központi mag van, az alegységek közti kapcsolat hidrofób kölcsönhatással valósul meg [16] [17-21]. Ezzel párhuzamosan a két csoport katalitikus ciklusában is egy fontos különbség figyelhető meg [15]. A trimer dutpázoknak katalitikus szempontból két fő konformációjuk van: nyitott és zárt. Az eukarióta enzimek esetén a katalitikus reakció lejátszódása után is megmarad a zárt konformáció (ld. humán dutpáz-dump komplex kristályszerkezete [21-23]). Ezért nem magyarázható egyszerűen a termék távozása, és szükséges egy bonyolultabb, esetleg allosztérikus működést feltételezni az eukarióta dutpázok esetén. Ezzel szemben a bakteriális és retrovirális enzimek aktív centrumai a katalitikus hasítás után azonnal kinyílnak, ami lehetővé teszi a termék gyors távozását. A dutpáz család evolúciója még további kutatások témáját képezi. 11

12 A trimer dutpáz térszerkezete Mint az előző fejezetben írtam, a dutpázok túlnyomó része homotrimer enzim, azaz három teljesen azonos polipeptid láncból áll. Ez a trimer szerveződés viszonylag ritka az enzimek körében. További érdekessége a szerkezetnek, hogy három teljesen azonos aktív hely van benne, és mindegyik kialakításában mindhárom fehérjealegység részt vesz. Szó esett arról is, hogy függetlenül a dutpáz eredetétől 5 konzervatív motívum fedezhető fel a szekvenciában ( 3. ábra). Ezek mindegyike fontos szerepet játszik az aktív centrum kialakításában [13, 21, 24, 25]. A fehérjealegységek harmadlagos szerkezete egy nyolcszálas "jelly-roll" β-hordó. Ebben a szerveződésben az egyik β-szál a szomszédos alegységből származik, így a negyedleges és harmadlagos szerkezet nehezen választható el. A fehérje tehát túlnyomó részben β-redős, továbbá egy rövid α-hélixet is tartalmaz (4. ábra) [18, 21]. 4. Ábra A trimer dutpáz szerkezete. Jól látható, hogy mindhárom aktív centrum felépítésében mindhárom fehérjealegység részt vesz. Az aktív helyekhez koordinálódó ligandumok ez esetben a szubsztrátanalóg dudp molekulák. 12

13 13 Az aktív centrumokat a három alegység a következő módon alakítja ki: Az egyik fehérjealegységtől származik az a torzult antiparalell β-hajtű, ami az uracil koordinálásáért felelős: az uracil beékelődik a β-hajtűbe és a DNS-ben megszokott bázispárosodási hajlamnak megfelelő hidrogén-hidakkal kapcsolódik a főlánc-atomokhoz. Ez a bázisfelismerési mechanizmus rendkívül specifikus, ugyanis a DNS-ben szokásos bázispárosodási módot utánozó kapcsolódás eleve csak az uracil és a timin beépülését teszi lehetővé, de a timin beékelődése a β-hajtűbe sztérikusan gátolt. Található továbbá egy Tyr sarokmotívum ( az E. coli dutpázban Tyr93), mely a dezoxiribóz gyűrűvel átlapol, erősítve ezzel a szubsztrát, és sztérikus módon kizárva a ribonukleotidok kötődését (5. ábra) [21]. 5. Ábra A fehérjealegységek konzervált motívumainak szerepe az aktív centrum kialakításában, és a szubsztrát megkötésében. Az első alegység β-hajtűje kék színű, a második alegység α-hélixéből származó rész piros, a harmadik alegység C-terminális régiója sárga, a dudp pedig világoskék. Csak néhány, a szubsztrát megkötésében fontos szerepet játszó aminosav oldalláncot tüntettünk fel. 13

14 14 A másik fehérjealegység α-hélix régiójának arginil és szeril aminosav oldalláncai hidrogénkötéseket létesítenek a szubsztrát α-foszfát csoportjának oxigénjeivel. A harmadik alegység a C-terminális végével az aktív hely fölé hajlik, létrehozva ezzel az enzim zárt konformációját de ez csak a teljes trifoszfát részt tartalmazó szubsztrát ill. szubsztrátanalóg kötődésekor valósul meg. Ez a glicin-gazdag C-terminális régió, mely minden alegységből mintegy kilógva a másik alegységhez nyúlik át, a legtöbb kristályszerkezetben nem is látszik, mivel az enzim ezen része rendkívül flexibilis, nem lokalizálható [13, 15]. Itt helyezkedik el az 5. konzervált szekvencia- motívum, ami a β- és γfoszfát-csoportok pontos koordinálásában és az α-β foszfátkötés hasításában játszik valamiképp szerepet. Eme motívum része egy szigorúan konzervált fenilalanin, amely az aktív centrum fölé hajolva hidrofób kölcsönhatásba lép a már koordinált uracillal. Ennek ellenére a szubsztrát kötődése ezen motívum hiányában is megtörténik, hasonló termodinamikai paraméterekkel, de a katalitikus aktivitás ilyenkor az eredetinek mintegy 2,4%-ára csökken [13]. A C-terminális régió szerepe további kérdéseket vet föl, különösen a prokarióta és eukarióta dutpázok katalitikus ciklusa közti különbségek tekintetében [14]. Tudjuk, hogy dutpáz fontos kofaktora a Mg2+ [26], de kristályszerkezetekben még nem sikerült a Mg2+ helyét kimutatni. Megjelent azonban egy közlemény az EIAV (Equine Infectious Anemia Virus) dutpáz szerkezetről, ami tartalmazza a Mg2+ helyett katalitikus fémionként alkalmazott Sr2+-ot [20]. Ez alapján valószínűsíthető, hogy a kétértékű fémion szerepe az lehet, hogy az α- és a γ- foszfát csoportokat centrálisan orientálja. A fémion szerepének jellemzése még pontosításokra vár, amihez a legmegfelelőbb eszköznek látszik az EPR-ENDOR spektroszkópia módszere. 14

15 A dutpáz, mint új target molekula gyógyszerszintézisek számára Már bemutattuk, hogy a dutpáz gén nullmutációja magas uraciltartalmú DNS-t eredményez az osztódó sejtben, ami pedig a báziskivágáson alapuló javító mechanizmus következtében timinmentes sejthalálhoz vezet [27, 28]. Utaltunk arra is, hogy az ilyetén esszenciális jelentőségű dutpáz specifikus gátlásával esetleg terápiás hatást érhetünk el a rákos vagy egyes vírusos megbetegedések gyógyításában. A dutpáz gátlása elsősorban az aktívan osztódó sejtekre nézve káros, így remélhető, hogy megfelelő inhibítorral megakadályozható a tumorsejtek szaporodása, és ezt valóban sikerült elérni több tumor sejtvonal esetében is nem hidrolizálható szubsztrátanalógokkal [7]. A széleskörben használt kemoterápiás szer, a fluorodezoxiuridin hatékonysága rezisztencia kialakulása miatt idővel lecsökken. Kimutatták, hogy a rákos sejtek dutpáz koncentrációjának megnövelésével ez a rezisztencia indukálható. Szintén a timinmentes sejthalált idézi elő egy másik, a klinikai gyakorlatban használt rákellenes gyógyszer, a methotrexát. Valószínűsíthető tehát, hogy a kemoterápia hatékonysága növelhető lenne dutpáz-antagonisták alkalmazásával (6. Ábra) [29]. 6. Ábra Kapcsolat a timidilát-szintáz (TS), dihidrofolát-reduktáz (DHFR) és a dutpáz enzimek által katalizált reakciók között. 15

16 16 Kísérleti adatok támasztják alá azt is, hogy a virális dutpáz gének olyan mutációja, mely az enzim aktivitását csökkenti, erősen gátolja a vírus fertőző és szaporodó képességét. Ez megfigyelhető a fertőző lóanémia vírus (EIAV), a macskafélék HIV vírusa esetén, valamint a humán herpes simplex I. esetén [8-11]. Főleg azon vírusok ellen lehetne a virális dutpáz gátlásával hatékonyan küzdeni, melyek elsősorban differenciálódott sejteket támadnak meg. Ezen esetekben a gazdasejt alacsony dutpáz szintje miatt a vírus szaporodásához szükség van a virális enzimre. Így például csökkenthető lenne a herpes simplex 1. neuroinvazív karaktere [9, 10]. mocsárláz a lovaknál LENTIVÍRUSOK -fertőző lóanémia virus -macskafélék immunodeficiencia virusa genitális herpes herpeszkiütés AIDS a macskaféléknél daganatos megbetegedések Herpes simplex vírus Tumour sejtvonalak sertésláz Afrikai sertésláz vírus EMBERI GOMBÁS KÓROKOZÓK Candida albicans PARAZITÁK Leishmania major Trypanosoma cruzi leishmaniasis (trópusi kiütés, dumdum láz) FERTŐZŐ BAKTERIUMOK Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium leprae Haemophilus influenzae candidiasis Chagas betegség tuberkulózis lepra bakteriális influenza 7. ábra: A dutpáz gátlásában rejlő lehetőségek A betegségek listája (a nagy körön kívül) és az azokat okozó szervezetek (a nagy körön belül), melyek saját dutpázukat kódolják genomjukban. A színes hátterű körökben lévő kórokozók esetében a dutpáz gátlásának pozitív hatásáról már létezik dokumentáció. 16

17 EPR-ENDOR vizsgálatok szerepe a dutpáz-katalízis mechanizmusának leírásában Számos nagyfelbontású szerkezet létezik már az eukarióta, prokarióta és retrovirális dutpázokról, de ezeknek - mindamellett, hogy kiválóan leírják a fehérje háromdimenziós szerkezetét - alapvető hiányossága, hogy nem informálnak a katalízis mechanizmusáról: a katalitikusan fontos fémiont nem tudták azonosítani, így a funkciójáról sem tudtak információval szolgálni, továbbá a flexibilis C-terminális régió katalízisben betöltött szerepéről sem tudnak biztos adatokkal szolgálni, mivel eme régió kevéssé lokalizálható [17, 21]. Az EPR-ENDOR módszer eme hiányosságokat lenne képes pótolni, amennyiben megfelelő spincímkét találunk, ami egyben a dutpáz kofaktora is lehet. Jelen munka épp az ENDOR spektroszkópia számára kitűnő spincímke, a vanadil kation hatását vizsgálja a dutpáz katalízisre. Kezdetben végeztem méréseket a kevésbé kedvező spincímke tulajdonságú Mn2+-nal is, amit a későbbiekben - a VO2+ kompetenciájának igazolódásával párhuzamosan - elhagytam. Az EPR-ENDOR módszer elmélete A módszerben egyaránt alkalmazzák az EPR (elektron paramágneses rezonancia) és az ENDOR (electron nuclear double resonance - elektron-mag kettős rezonancia) spektroszkópia eszközeit. Az ENDOR spektroszkópia alkalmazásának alapfeltétele valamely paramágneses csoport (legalább egy párosítatlan elektron) és egy páratlan spinű mag (pl H +) megfelelő térbeli közelsége. A rezonanciaátmenetek az elektron- és a magspin mikrohullámmal valamint rádióhullámmal történő kölcsönhatása folytán detektálhatók, melyekkel egyszerre gerjesztjük a mintát. Az un. "szögszelektív ENDOR" módszere kiválóan alkalmazható VO2+ és OHspincímkék esetén fagyott oldatfázisban molekulák háromdimenziós szerkezetének analízisére. Az alkalmazott mágneses tér (H0) a molekulákat bizonyos leszűkített orientációkban szelektálja. Az EPR spektrum un. fordulópontjai lehetővé teszik a molekulák 17

18 18 relatíve szűk szögintervallumban történő kiválasztását [30, 31]. A molekulában megfigyelhető a párosítatlan elektron abszorpciójának egy hiperfinom csatolódása (hfc) a mágneses maggal a mágneses tér vektorához. Ezt a csatolódást írja le a következő egyenlet: Aobs = ge * βe * gn * βn * (3 cos2α - 1) / hr3 + Aiso ahol Aobs a párosítatlan elektron megfigyelhető abszorpciója, ge és gn az elektron és mag g faktorai, βe és βn az elektron- ill a nukleáris magneton, r az elektron és a mag közötti sugárirányú szeparáció, α a H0 mágneses tér vektora és a mag-elektron dipol kölcsönhatás vektora által bezárt szög, Aiso pedig az izotróp Fermi konstans. A radiális szeparáció értékeléséhez szükséges kimérni az alapvető hfc komponensek ENDOR spektrumát, ezek a VO2+ esetén A (α=90o) és A (α=0o). Ezen módszer matematikai és fizikai hátteréről bőséges irodalom létezik [30, 32-35]. A módszer azért nyújthat részletes szerkezeti információkat, mert nem csak dipoláris alapon történő elkülönítésen alapul, ami skalár mennyiségeket ad, hanem függ a hiperfinom mintázatoktól vagy relatív koordinátáktól is, tekintettel a molekula mágneses vektoraira, melyek fontos információkkal szolgálnak a molekula orientációját illetően. (un szögszelektív ENDOR) [30, 35]. A paramágneses VO2+ kation esetén a szögszelektív ENDOR koncepció alkalmazása azon a tényen nyugszik, hogy ebben a rendszerben a "g" tenzor alacsony anizotrópiát mutat és axiálisan szimmetrikus, valamint a gz komponens merőleges a molekula x-y síkjára [36-39]. A mérési rendszer az EPR spektrumból adódó gz komponensre párhuzamosan és arra merőlegesen telíthető az alkalmazott H0 mágneses térerővel. Íly módon az ENDOR mérés számára különböző orientációk választhatók ki, és az ezeknek megfelelő hiperfinom csatolások (hfc) elkülöníthetők. A kifejlesztett módszer fontos előnye, hogy (fagyott) oldatfázisú makromolekulák és makromolekula-ligand komplexek három dimenziós szerkezetét olyan adatokkal képes leírni, melyek csak az egykristályok röntgendiffrakciós analíziséből nyerhető nagyfelbontású szerkezetekhez hasonlíthatók [31, 36-46]. 18

19 19 A vanadil kation, mint spincímke az ENDOR spektroszkópiás mérésekben Az NMR effektusokon alapuló módszer lehetőséget ad számunkra, hogy a VO2+ paramágneses kation koordinációs környezetének vizsgálata által bizonyos, a fémionszubsztrát-enzim terner komplexre vonatkozó szerkezeti információk birtokába jussunk. A VO2+ ion kedvező spin-címkeként működik ENDOR spektroszkópiás szerkezetanalízisekben, hiszen rendelkezik mind párosítatlan elektronnal (3d1), mind páratlan spínű maggal. Egyike a legstabilabb kétatomos kationoknak, párosítatlan elektronja a 3dxy pályán foglal helyet. További előnye a VO2+ spincímkének a szintén gyakran használt Mn2+-nal szemben, hogy amennyiben a közeg ph-ja négy fölé emelkedik, a szabad állapotú vanadil kation polimerizálódva kicsapódik az oldatból, és a mágneses mérésekben nem szolgáltat jelet. Csupán az a vanadil populáció fog mérhető mágneses jelet adni, ami szerves molekulákkal való komplexálódás révén elkerüli a polimerizációt. Mustafi Devkumar és munkatársai több fehérje szerkezetvizsgálata esetén is alkalmazták már eredményesen a vanadil kation spincímkét. (Például az α-kimotripszin acilenzimének aktívcentrumának szerkezetmeghatározásához [43], a karboxipeptidáz enzim katalitikus konformációjának meghatározásához [44].) Ezen eredményekre alapozva reális lehetőség van a dutpáz - amennyiben a vanadil ion kofaktora lehet az enzimnek - aktív centrumának jobb feltérképezésére, beleértve a C-terminális régió valamint a kofaktor fémion szerepének megértését is. A vanadil kation koordinációs szférájáról vizes oldatban, illetve víz-metanol elegyben rögzített ENDOR spektrumok alapján megállapították, hogy öt oldószermolekula koordinálódik a vanadil ion körül. Ezek közül négy ekvatoriális, egy pedig axiális pozícióban található. Az alkalmazott oldószertől függően a következő komplexek jönnek létre: [VO(H2O)5]2+, [VO(H2O)4CH3OH]2+, [VO(CH3OH)5]2+ [36]. Meghatározható a vanadil-nukleotid komplexek sztöchiometriája is, különböző nukleotid : VO2+ arányok alkalmazásával követve az EPR abszorpciós spektrum amplitudóváltozásait [37]. Az eredmények azt mutatják, hogy a vanadil kation két nukleotidot 19

20 20 képes koordinálni. Nem csak az ADP és analógjai esetében kaptak ilyen eredményeket, hanem a többi nukleotid esetén is (ld. 8. ábra vanadil-dutp). 8. Ábra A vanadil-dutp elegyben mért EPR spektrum amplitudói különböző dutp:vo2+ aránynál. Az ábrán jól láthatóan az 1:2 aránynál jelentkezik egy éles töréspont az amplitudó növekedésében, ami arra utal, hogy eme arányon felül már nem képződik több vanadil-dutp komplex. Amennyiben az oldószer molekulák protonjainak zavaró hatását kiküszöbölik, pl D2O-t alkalmazva oldószerként, láthatóvá válik az EPR spektrum hiperfinom szerkezete, ami kvintett jellegű, közelítőleg 1:4:6:4:1 arányú csúcsintenzitásokkal. Ez azt jelenti, hogy négy ekvivalens csoport koordinálódik a vanadilhoz. Ezt az eredményt megerősítették 31 P ENDOR alkalmazásával is. 1 H ENDOR eredményekből megállapítható volt, hogy a foszfátcsoportok ekvatoriálisan helyezkednek el a vanadil ion körül, míg az oxigénnel ellentétes oldalon axiális helyzetben egy víz molekula koordinálódik. Tehát a vanadil-nukleotid komplexekben csak a foszfátcsoportok kapcsolódnak a fémionhoz, ezek ekvatoriális helyzetben, így a négy foszfátcsoport teljesen ekvivalens helyzetű [37]. A fenti megállapítások nukleotid trifoszfátok, és ezek analógjai esetén is ( GTP, GMP-Pβ-CH2-Pγ, GMP-Pβ-nh-Pγ [39], dutp) érvényesnek bizonyultak. Munkahipotézisünk szerint annak során, amikor a szubsztrátanalóg dudp vanadil 20

21 21 kationnal koordinálva épül be a dutpáz aktív centrumába, a vanadil ion kölcsönhatásba lép a fehérje bizonyos aminosav oldalláncaival közvetlenül, vagy szerkezeti vízmolekulák által. Ez felderíthető lesz a VO2+-dUDP-dUTPáz terner komplex EPR-ENDOR vizsgálatával A vanádium oxidációs állapotai és a vanadil kation jellemzői A vanádium lúgos közegben főleg a színtelen HVO42- formában van jelen. Semleges vagy savas közegben ez a forma oligomerizálódik, és sárga színű di- és trivanadátok keletkeznek. Még alacsonyabb ph-n dekavanadát ionok (V10O286-), majd erősen savas oldatban (ph<1!) vanadil ionok (VO2+) képződnek. A vanádium színei az oxidációs állapottól függően: +5 oxidációs szám esetén (ld. HVO42-) színtelen, +4 esetén (ld. vanadil) kék, +3 esetén zöld, +2 esetén ibolya színű. A redukciós reakciók erősen ph-függők [47]. A nem frissen készített vanadil oldatban gyakran tapasztaltunk zöldes elszíneződést, ami valószínűleg nem a +3-as oxidációs állapotú forma jelenlétének tulajdonítható, hisz a ph nem volt olyan alacsony. Sokkal inkább a magasabb ph-jú és híg oldatban esetleg megjelenő HVO42- ionok polimerizációja miatt keletkező sárga di- és trivanadát ionok színe okozhatja az amúgy kék oldat bezöldülését. A vanadil törzsoldaton elkészítése után N2-t buborékoltattunk át kiűzendő a vízben oldott oxigént, hogy ezzel megakadályozzuk a vanadil oxidálódását, ami a 4 körüli ph-n (a törzsoldat ph-ja ilyen) a fent leírtak szerint bekövetkezne. Ezek után az oldat hűtőszekrényben jól tárolhatónak bizonyult, de a hígítást mindig frissen kellett készíteni, annál is inkább, mert a kinetikai mérésekhez szükséges volt a ph-t 7 körülire beállítani. A vanadil polimerizációját elkerülendő, az ekvimoláris vanadil-nukleotid elegyet - melyben a VO2+ a nukleotiddal komplexálódva stabilizálódik - még a ph beállítása előtt elkészítettem. 21

22 22 Végeztem méréseket vanadil-acetil-acetonáttal is, ahol a vanadil komplexben kötött állapotban van, ami nagyobb stabilitást biztosít a +4-es oxidációs állapotú forma számára. A komplex szerkezete látható az alábbi ábrán (9. ábra). 9. Ábra A vanadil-acetil-acetonát komplex szerkezete A VOacac stabil szerkezethez hasonlóan stabil a VO2+ minden olyan formája, ahol a koordinációs helyeket más szerves molekulákhoz kötődő oxigén atomok töltik ki. Így például a nukleotid-di- ill. trifoszfátok foszfátcsoportjainak oxigén atomjai is kellő stabilizáló koordinálódó ligandumként szolgálhatnak. Az előző fejezetben leírt irodalmi adatok szerint ebben az esetben a következő szerkezet alakul ki (10. ábra) [37]. 10. Ábra A vanadil-nukleotid-difoszfát komplex szerkezete 22

23 23 Ebben a szerkezetben a VO2+ - nukleotid sztöchiometria 1:2. Valószínű azonban, hogy a vanadil iont és a nukleotidot ekvimolárisan alkalmazva, a második nukleotid helyett vízmolekulák koordinálódnak a fémionhoz. Az is valószínű, hogy az enzim aktív centrumában csak egy nukleotid molekula szerepel a vanadil koordinációs partnereként, míg a szabad koordinációs helyekre esetleg egy aminosav oldallánc, vagy egy szerkezeti vízmolekula épül be. (A szerkezeti vízmolekulák a fehérjeszerkezetekben egyes oldalláncokkal kialakított hidrogén-kötések révén koordinálódnak) 23

24 24 2. Anyagok és módszerek 2.1. A felhasznált módszerek A dutpáz preparálása Az E-coli dutpáz enzimet a BL21DE3pLysS-pET3a-dut baktériumtörzzsel termeltetjük. Transzformálás A BL21DE3pLysS E. coli baktériumtörzset a pet3a-dut plazmiddal transzformáljuk [48]. Először a sejteket kloramfenikolos, steril LB lemezeken szaporítjuk egy hétig naponként átoltva, hogy biztosan a logaritmikus növekedési fázisban legyenek. A transzformálás előtti utolsó átoltás tápanyagban gazdagabb SOB táptalajú lemezekre történik. (Az LB, Luria-Bertani tápoldat élesztőkivonatot, triptont és ásványi sót tartalmaz, ugyanígy a SOB tápoldat, csak nagyobb koncentrációban.) Az antibiotikumot átoltás előtt szélesztjük a lemezeken, amiknek ezután két órát kell száradni a sterilfülkében. A BL21pDE3LysS baktériumtörzs már eleve tartalmazza a plyss plazmidot, amin található egy kloramfenikol rezisztenciát kódoló gén, így a fent leírt tenyésztés során biztosan csak ez a törzs nő ki. A transzformálással célunk a baktériumsejtbe juttatni a pet3a-dut plazmidot, mely tartalmazza az E. coli dutpáz génjét, közvetlenül ez előtt egy nagyon erős T7specifikus promoter régiót, továbbá egy ampicillin rezisztenciát kódoló gént. A sejtfal átmeneti megnyílását a plazmid számára az alkalmazott transzformáló puffer (TFB) magas sókoncentrációjával és hősokkal érjük el. 200μl TFB-ben egy kaccsnyi sejtet vortex-szel szétoszlatunk, majd 30 percig inkubáljuk jégen. Ezután hozzáadjuk a plazmidot, és újabb 40 percig jégbe tesszük. Ezt követően másodpercre 42oC-os vízfürdő alkalmazásával hősokkoljuk a sejteket, aztán újabb 2 percre jégbe tesszük. Majd 800 μl SOC tápoldatban percig 37oC-on rázatjuk, így nem szelektíven ugyan, de viszonylag gyorsan felszaporodnak a baktériumsejtek. Ezután már szelektív táptalajos kloramfenikolt és ampicillint egyaránt tartalmazó LB lemezeken szélesztjük a sejttenyészetet (100μl/lemez), melyeken másnapra egyedi kolóniák nőnek ki. A 24

25 25 baktériumtenyészet 20%-os glicerin pufferben, folyékony nitrogénben gyorsan lefagyasztva, -80 oc-on tárolható, és a sejtek életképesek maradnak. Expresszió A baktériumsejteket steril, szelektív (kloramfenikolt és ampicillint is tartalmazó) LB tápoldatban szaporítjuk. Így csak azok a sejtek maradnak életben és szaporodnak, amelyek még tartalmazzák a plyss és az általunk bevitt pet3a-dut plazmidot. A sejtkoncentráció változását bizonyos időközönként vett minták optikai denzitásának spektrofotométeres mérésével követjük. A sejteket logaritmikus növekedési fázisuk elején indukáljuk IPTG-vel (izopropil-tiogalaktozid). Az IPTG a lac promoter ellenőrzése alatt álló T7 DNS-függő RNS polimeráz enzimet kódoló génről, amely a baktériumtörzs kromoszómáján található, megindítja a polimeráz expresszióját. Az így termelődött T7 polimeráz tevékenységét a pet3a-dut plazmidra irányítja a nagyon erős T7-specifikus promoter régió, ami a dutpáz gén előtt helyezkedik el a plazmidon. Így az IPTG hozzáadásával a dutpáz génről történő expressziót tudjuk beindítani [48]. Mintegy négy óra hosszat termeltetjük az enzimet, majd centrifugálás után feltárjuk a sejteket [49, 50]. Feltárás A feltárás lényege, hogy megbontsuk a sejtfalat, és a plazmában található, oldható fehérjéket főleg a dutpázt sértetlenül oldatba vigyük. A sejtfal megbontásával azonban bizonyos proteázok működésbe lépnek, és kontollálatlanul rongálják a fehérjéket, ezért szükséges, hogy ezeket hatástalanítsuk, amit a lízis pufferbe adagolt EDTA-val és EGTA-val (amik a metalloproteázokat gátolják), valamint PMSF-fel érünk el (fenil-metil-szulfonil-fluorid, ami a szerin oldallánccal működő enzimeket pl. tripszin, kimotripszin - specifikusan gátolja úgy, hogy velük kovalens komplexet képez). Továbbá DTT-t (ditio-treitol) is adagolunk a lízis pufferhez, ami megvédi a szabad SH csoportokat az oxidálódástól úgy, hogy a DTT maga oxidálódik. Az utóbbi két anyagot (PMSF, DTT) lévén bomlékonyak mindig frissen adjuk a pufferhez. A feltáráshoz a sejteket homogenizáljuk a lízis pufferben, lizozim hozzáadásával a sejtfalat megbontjuk, amit egymás után következő gyors lefagyasztásokkal és felolvasztásokkal teszünk teljessé. Ezután lecentrifugáljuk az elegyet. A felülúszóban található a dutpáz számos 25

26 26 más fehérjével együtt. Elválasztás A felülúszót dializáljuk a kromatográfiás elválasztáskor használt "A" pufferben (25mM Na, K-foszfát ph=6,00, 1mM DTT, 0,5mM PMSF). A dutpáz ioncserélő kromatográfiás elválasztása Gradifrac készüléken QSepharose anioncserélő gyantán történik (Pharmacia Biotech Fast Flow). A készülék programozható. Általunk megadható paraméterek: az áramlási sebesség, a gradiens B időtartama és jellege, a frakciók szedése ill. nem szedése, valamint az egyes frakciók szedésének ideje. A műszerbe épített, 280nm-re beállított spektrofotométer detektálja a rajta átfolyó oldat elnyelését, ami arányos a fehérjekoncentrációval. Ezt a jelet rajzolja ki a rekorder. Miután az oszlopot az "A" pufferrel egyensúlyba hoztuk, és felvittük rá a fehérjeoldatot, először "A" pufferrel mossuk, míg az oldatban lévő fehérjék egy része (amelyek nem tudnak megkötődni a gyantán, mert nincs megfelelő negatív töltésük) kimosódik (11. ábra). Ezután "B" gradienst alkalmazunk. (a "B" puffer az "A"-hoz képest még 1M NaCl-ot is tartalmaz) A gradiens ideje alatt összesen 2-2 oszloptérfogatnyi "A" ill. "B" megy át az oszlopon. A növekvő sókoncentráció következtében fokozatosan távoznak a gyantán megkötődött egyéb fehérjék is. A gradiens alatt frakciókat szedünk. A dutpáz 50-60% "B"-nél egy éles és magas csúcsot ad (ld. 11.ábra). 11. Ábra A dializált fehérjeoldat kromatográfiás elválasztása anioncserélő oszlopon. A kromatogramon 50-60% "B"-nél éles csúcs jelzi a dutpáz-tartalmú frakciók eluálódását. 26

27 27 A fehérjekoncentráció és aktivitás mérése a megfelelő frakciókból UV/VIS spektrofotométerrel történt. A dutpáz koncentráció meghatározását 280 nm-en végeztem. Az E. coli-ból származó dutpázra az ε0,1%1cm,280=0,52 [2]. Az aktivitásmérés 559 nm-en 40 µm fenolvörös indikátort tartalmazó pufferben történik (részletesebb leírást lásd a következő fejezetben). A fehérjepreparátum tisztaságát a szokott módon gélelektroforézissel ellenőriztük. 27

28 Kinetikai analízis A kinetikai vizsgálatokban a dutpáz által katalizált dutp dump + PPi reakció lefolyását spekrofotometriásan követhetjük. A reakció során protonok is szabadulnak fel, és ezek mennyisége egyenesen arányos a képződő termék (dump) mennyiségével. Az aktivitás méréshez használt elegy összetétele: 1mM TES/HCl, ph=7.5, 150mM KCl, 40µM fenolvörös sav-bázis indikátor. Az elegy tehát csak gyengén pufferolt (alacsony a pufferként használt TES és fenolvörös koncentrációja). Így a dutp hidrolíziséből felszabaduló protonok a közeget mérhető mértékben savanyítják. A ph változást az indikátor színváltozásán keresztül követjük, 559nm-en mérve az oldat abszorbanciáját. A méréseket JASCO-V550 spektrofotométeren, 10mm-es küvettákban, 25oC-on végeztem [13, 15]. A reakció kinetikai paraméterei meghatározhatók az így kapott görbékből. A mérések kiértékelésekor az enzimkinetikában általánosan használt Michaelis-Menten leírást alkalmazzuk, az ún. rapid equlibrium meglétét feltételezve. Az enzimkoncentrációt a monomerre számoljuk. A dutpáz esetén az enzimkatalízis leírható a k1 E + S k2 ES P + E k-1 egyenlet segítségével. A Michaelis-Menten kinetikai modell alapján a kezdeti sebességnek a kindulási szubsztrátkoncentrációtól ([S]0) való fűggését hiperbola írja le (12. ábra). 12. Ábra Egy tipikus szubsztráttelítési görbe. 28

29 29 A hiperbola egyenlete: v0 = vmax * [S]0 / (KM + [S]0), ahol vmax (=[E]össz*kkat) és KM állandók és adott enzimkoncentráció esetén az adott reakcióra jellemzők, vmax az enzimreakció maximális kezdeti sebessége, kkat a katalízis reakciósebességi állandója, KM a MichaelisMenten állandó, v0 a kezdeti sebesség, [S]0 a kezdeti szubsztrátkoncentráció, [E]össz pedig az enzim összes koncentrációja. Ha feltételezzük, hogy az ES komplex képződése és disszociációja egyaránt sokkal gyorsabb, mint a termék képződése (rapid eqilibrium), akkor érvényes lesz a reakcióra a Michaelis egyenlet. Amennyiben eme feltétel teljesül, a reakció minden pillanatában az [S], [E], [ES] koncentrációk az ES komplex disszociációs állandója által megszabott értékűek lesznek, azaz mindvégig fennáll a Ks = [E]*[S]/[ES] összefüggés. A termék keletkezésének kezdeti sebessége a következő képp írható fel: V0 = [P] / t = k2 * [ES] A végtelen nagy szubsztrátkoncentrációhoz tartozó reakciósebesség (vmax) hasonlóképp felírható, de [ES] helyett írhatunk [E]össz-t, hiszen igen nagy [S] esetén a kettő egyenlőnek vehető. Tehát felírható, hogy v0 / vmax = k2 * [ES] / k2 * [E]össz = [ES] / ([E] + [ES]) Figyelembe véve a rapid eqilibrium kikötést, az [E] kifejezhető: [E] = K s * [ES] / [S], és behelyettesíthető a fenti egyenletbe, amiből átrendezés után megkapható a hiperbola egyenlete: v0 / vmax = [ES] / (Ks * [ES] / [S] + [ES]) = 1 / (Ks / [S] + 1) = [S] / (Ks + [S]) v0 = vmax * [S]0 / (Ks + [S]0) Látható, hogy a rapid eqilibrium közelítést alkalmazva a Michaelis állandó megegyezik az ES komplex disszociációs állandójával. Amennyiben ezt a közelítést nem lehet használni, a KM kifejezése bonyolultabb lesz, de az egyenlet továbbra is érvényes marad. Használatos továbbá a fenti egyenlet integrált alakja is (integrált Michaelis- Menten egyenlet). 29

30 30 Első közelítésben meghatározhatók a kezdeti sebességek a görbék kezdeti meredekségéből. A különböző szubsztrátkoncentrációknál (de azonos enzimkoncentrációnál!) mért kezdeti sebességeket ill. az ezekkel arányos abs/sec meredekségeket ábrázolva a szubsztrátkoncentráció függvényében megkapjuk a szubsztráttelítési görbét adott enzimkoncentráció esetén. Ezekből a telítési görbékből már megközelítőleg leolvasható a vmax és a KM értéke. Ennél pontosabb eredményekhez jutunk, ha az integrált Michaelis-Menten egyenletet használjuk. [P]t / t = vmax KM * ln([s]0 / ([S]0 [P]t)) / t Ahol a [P]t a termék koncentrációja az adott t időpontban, vmax a reakció maximális sebessége, KM a reakcióra adott enzimkoncentrációnál jellemző Michaelis állandó, [S]0 pedig a kezdeti szubsztrátkoncentráció. [P]t kiszámolható a mért abszorbanciaértékek és az [S]0 ismeretében: [P]t = (A0 At) / Atot * [S]0 ahol A0 a kezdeti, At a t időpillanatban mért abszorbanciaértékek, Atot pedig a reakció alatt bekövetkezett totális abszorbancia csökkenés. A mért adatokból generálhatók a [P]t / t és a ln([s]0 / ([S]0 [P]t)) / t értékek, mely adatokra egyenest illesztve egyszerűen megkaphatók a reakció kinetikai paraméterei. A katalízis reakciósebességi állandója (kkat) pedig számolható vmax-ból és az összes enzimkoncentrációból: kkat = vmax / [E]össz 30

31 Cirkuláris dikroizmus spektroszkópia elmélete A CD spektroszkópia nagyon hatékony módot kínál királis molekulák térszerkezetének vizsgálatához. Alapja, hogy az optikailag aktív anyagok a jobb ill. bal irányban cirkulárisan polarizált fénnyel különböző módon lépnek kölcsönhatásba. A lineárisan polarizált fény két, ellentétes irányú cirkulárisan polarizált komponensre bontható. Így az optikailag aktív anyagon átbocsátott lineárisan polarizált fény, annak komponenseire vett moláris abszorpciós koefficiensek különbözősége miatt, elliptikusan polarizálttá válik, és a törésmutatók különbözősége miatt a polarizáció iránya az eredetihez képest meghatározott szöggel elfordul. Tehát kétféle jelenségről is szó van: az optikai rotációs diszperzió (ORD) és a cirkuláris dikroizmus (CD) együtt jelentkezik. Az ORD abból adódik, hogy a királis közegnek különbözõ a törésmutatója a balra ill. jobra cirkulárisan polarizált fénykomponensekre nézve. nb-nj 0 Ezért a közegen való áthaladás után a lineárisan polarizált fény síkja meghatározott szöggel elfordul, hiszen a kijövõ fénykomponensek nem lesznek azonos fázisban. Az elforgatás szöge: α=πl(nb-nj)/λ ahol λ a hullámhossz, l a közegben megtett út. Az elforgatás mértéke a hullámhossz függvényében változik, ez az ORD jelensége. Természetesen ehhez nem szükséges, hogy az adott hullámhossztartományban legyen az anyagnak fényelnyelése. A CD alapja, hogy az optikailag aktív anyagok különböző mértékben nyelik el a lineárisan polarizált fény cirkulárisan polarizált komponenseit, azaz különbözőek a moláris abszorpciós koefficiensek: ε = εb-εj 0 31

32 32 Ennek megfelelően az eredetileg lineárisan polarizált fény a közegen áthaladva elliptikusan polarizálttá válik. Ez a jelenség nyilván csak azon hullámhossztartományokban lép fel, ahol a molekula fényt nyel el. A CD spektrométerrel a A-t, azaz a balra és jobbra cirkulárisan polarizált fénykomponensek abszorpciójának különbségét, vagy az ezzel arányos ellipticitást (Θ) mérjük. A kettő közti összefüggés: Θ = 2,303 (Ab-Aj)/4 A CD mérőszáma lehet a ε vagy az ezzel arányos moláris ellipticitás[θ] [θ] = 3300 * ε Mint köztudott a fehérjéket felépítő aminosavak a glicin kivételével királisak, továbbá a fehérjék kromofor csoportjai - a peptidkötések és az aromás oldalláncok - egyaránt akirálisak. Adódik azonban kiralitás az önmagukban akirális kromoforok molekulán belüli aszimmetrikus környezetéből, és ilyenkor is fellép a cirkuláris dikromizmus jelensége. Ezért a fehérjemolekuláknak van CD spektrumuk. A fehérjék ismétlődő kromoforja az amid csoport, aminek távoli UV tartományban van jellemző elnyelése ( nm és nm), ezért 250nm alatt a CD spektrumot az amidcsoportok határozzák meg. Közeli UV-ban az aromás oldalláncú aminosavaknak van jellemző elnyelése 280nm körül, ill a diszulfid hidaknak nm-nél [51]. A távoli UV-ben felvett CD spektrumok alkalmasak a másodlagos szerkezeti elemek arányának becslésére a fehérje molekulában. Ezekre a számításokra többféle módszer is kínálkozik, célszerű adott esetben többet is alkalmazni a pontosabb becslés végett. Az E. coli dutpáz esetében a távoli UV-ben felvett CD spektrumból számított szerkezeti adatok jól egyeztek a kristályszerkezet adataival [13]. Közeli UV tartományban egy fehérjének az aromás oldalláncok miatt lehet jellegzetes CD-spektruma. Továbbá az E. coli dutpáz esetében az ilyen mérések alkalmasak 32

33 33 a szubsztrát aktív centrumhoz való kötődésének leírására. A szubsztrát vagy szubsztrátanalóg molekulák fehérje távollétében mért CD spektrumában az uracil gyűrű miatt egy jellegzetes csúcs mutatkozik, melynek maximuma 270 nm-nél van [13, 25]. Amennyiben a szubsztrátanalóg kötődik az aktív centrumhoz, szignifikáns különbség mutatkozik a dutpáz szubsztrátanalóg elegy közeli UV tartományban felvett CD spektruma és az enzim ill. szubsztrát külön felvett spektrumából számolt összeg között. Ezen különbség az enzim-szubsztrát komplex kialakulását jelzi, mivel a ligandum kötődése okozta konformációváltozás perturbálhatja a fehérje és/vagy a ligandum CD spektrumát. Az E. coli dutpázban a 3. motivum tirozinja funkcionálisan rendkívül fontos (ezt támasztja alá az a tény is, hogy szigorúan konzervált: majdnem minden dutpázban megtalálható), részt vesz a szubsztrát megkötésében [24, 25, 52]. Többek között ez a tény is oka lehet a fent leírt spektrális változásoknak, melyekből tehát a szubsztrát vagy szubsztrátanalóg aktív centrumhoz való kötődésére következtethetünk. Természetesen a spektrális jelekben tapasztalt változás, melyet a komplexálódás idéz elő, nem tulajdonítható egyértelműen sem csupán a nukleotid ligandumnak, sem csupán az enzim oldalláncainak. Ezek kapcsolódása indukálja a differencia spektrumot. 33

34 Izotermális titráló mikrokalorimetria (ITC) A módszer alkalmazásával lehetőség nyílik a szubsztrátkötődés termodinamikai paramétereinek meghatározására. A műszer állandó nyomáson és hőmérsékleten méri az oldatban a makromolekulához történő szubsztrátkötődés okozta hőmennyiségváltozásokat. Innen számolhatók a kötődésre jellemző termodinamikai paraméterek: S, G, H, valamint a kötőhelyekre vonatkozó adatok [53-55]. Az izotermális titráló mikrokalorimetriában a mérő cellában lévő oldatot titráljuk a reaktáns oldatával egy, a műszerbe épített mikrofecskendő segítségével. Az injektáló berendezés automatikus, és nem csak a reaktáns megfelelő pontos adagolását végzi, hanem lapátszerűen kiképzett végével, gyors forgással keveri is a reakcióelegyet az egyenletes anyag- és hőeloszlás biztosítása végett. Az elegyedéssel és az esetleges reakcióval hő fejlődik vagy nyelődik el, amelyet a műszer automatikusan kompenzál, közben mérve a kompenzáláshoz szükséges elektromos munkát. Ez a munka egyenlő a változásokkal járó hőfejlődéssel, ill hőelnyelődéssel: Q = W és U = 0 izoterm változások esetén. A hőváltozásokat mindig egy, a műszerbe épített referencia cellához képest mérjük. Így nagy pontosságú adatsorokhoz jutunk. Egy tipikus mérési görbe látható az ábrán: a műszer a reaktáns arányának függvényében jelzi ki az időegység alatt bekövetkező hőmennyiség-változást. Esetünkben a reaktáns a megfelelő fémion-dudp elegy, amivel a cellában lévő E. coli dutpáz oldatát titráljuk. 13. Ábra A felső ábra közvetlenül a mért hőváltozásokat ábrázolja, melyek nagysága függ az injektálás mennyiségétől is. (Kezdetben kisebb részletekben injektáltunk) Az alsó ábra már az injektált térfogatokkal, a kezdeti koncentrációkkal és az injektálások miatti hígulással korrigált adatsorból számított hőmennyiségváltozásokat mutatja. 34

35 35 A mikrokalorimeter számítógépvezérelt, és a mért adatok kiértékeléséhez is rendelkezésre áll egy külön szoftver (MicroCal Origin itc), ami a mért pontokra illesztett görbéből számítja a megfelelő termodinamikai paramétereket. Szükséges megadnunk a cellában lévő anyag és a titráló fecskendőben lévő anyag koncentrációját, ezek ismeretében a hígulással is számolva a program megszerkeszti a korrekt titrálási görbét (ld. 13. ábrán alul). Ezután a molekulán belüli kötőhelyek számától és viszonyától függően több féle modell alapján illeszthető görbe a mért adatokra, ennek paraméterei alapján a katalízis termodinamikailag jellemezhető. Az egyes injektálások után felszabaduló hő kifejezhető a következő képpen: Q = n * XES*[E]0* ΔH*V0 ahol n a kötőhelyek száma a molekulán belül, XES az enzim-szubsztrát komplex anyagmennyiség aránya az összes enzim mennyiségéhez képest, [E]0 az enzim összkoncentrációja, ΔH a szubsztrátkötődés okozta moláris szabadentalpia-változás, V0 pedig a cella térfogata. Mivel XES minden egyes injektálás után más értékű, célszerű kifejezni az enzim-szubsztrát komplex stabilitási állandója segítségével. K = XES / ((1-XES)* [S]) Ha figyelembe vesszük, hogy [S] = [S]0 - n*xes*[e]0, a következő másodfokú egyenlet adódik XES-re: XES2 - XES*(1+ [S]0/(n*[E]0)+ 1/(n*K*[E]0)) + [S]0/(n*[E]0) = 0 Ennek a másodfokú egyenletnek a megoldóképletét behelyettesítve a Q kifejezésébe látható, hogy - amennyiben megadtuk a kiindulási enzim és szubsztrát koncentrációt, és a hígulásokkal is számoltunk minden lépésben - három paraméter (n, K, ΔH) variálásával illeszthető a kapott egyenlet szerint görbe a mért adatokra. 35

36 36 Tekintve a műszer érzékenységét célszerű a különböző effektusokból származó hatásokkal korrekciót végezni: ezeket külön-külön megmérni, és a mért görbéből levonni. Ilyen egyéb hőhatások: a reaktáns hígulásával járó hőeffektus (ez a legjelentősebb), az enzim hígulásával járó hőeffektus (ami általában elhanyagolható), az alkalmazott puffer ionizációs ill. protonálódási hője. Ez utóbbi kiküszöbölése végett szoktak párhuzamos vizsgálatokat végezni különböző pufferekben is. A mérésekhez általam használt puffer: 250mM MOPS, 50mM KCl, 11,25mM NaOH (ez utóbbi a ph beállításához volt szükséges) ph=7,1. A dutpázt egy éjszakán át dializáltam a pufferben (657µM), a dudp-nek vizes oldatát használtam (85mM), ugyanígy a Mg2+ és a VO2+ ionoknak is. A mérési eredmények kellő pontosságú kiértékelhetőségéhez fontos, hogy megfelelő enzimkoncentrációt alkalmazzunk. A méréseket általában meglehetősen tömény oldatban végezzük. A megfelelő koncentrációt előre megbecsülhetjük következő egyenlet alapján, amennyiben legalább közelítőleg ismerjük az enzim-szubsztrát komplex stabilitási állandójának az értékét. 10 < Ka * C < 50 ahol Ka az enzim-szubsztrát komplex stabilitási állandója, C pedig a mintatartó cellában lévő anyag koncentrációja. Megbecsülhető továbbá a fecskendőben lévő ligandum kívánatos koncentrációja, ha van információnk a makromolekulán lévő ligandkötőhelyek számát illetően a következő egyenletek alapján az alkalmazott fecskendő térfogatától függően: 100μl-es fecskendő esetén: Cligandum = 20 * n * C 250μl-es fecskendő esetén: Cligandum = 7 * n * C ahol n a makromolekulán lévő kötőhelyek száma, C pedig a cellában lévő enzim koncentrációja. Az a jó, ha olyan titrálási görbét tudunk kimérni, amelynek mind az eleje, mind a vége jól látható, és a görbe S alakja erőteljes. Az ITC módszert dutpáz ligandumkötésére eddig még nem használták, a jelen dolgozat tartalmazza az első ilyen leírást. 36