Enzimatikus foszfátészter hidrolízis mechanizmusának tanulmányozása fehérjekrisztallográfiával

Átírás

1 Enzimatikus foszfátészter hidrolízis mechanizmusának tanulmányozása fehérjekrisztallográfiával Barabás Orsolya Témavezetők: Dr. Vértessy Beáta a biológia tudományok doktora Prof. Náray-Szabó Gábor akadémikus A doktori iskola vezetője: Prof. Inzelt György Programvezető: Prof. Surján Péter Eötvös Loránd Tudományegyetem, Kémia Doktori Iskola Elméleti és Fizikai Kémia, Anyagszerkezetkutatás Program Készült: a Magyar Tudományos Akadémia, Szegedi Biológiai Központ, Enzimológiai Intézetében és az Eötvös Loránd Tudományegyetem, Elméleti Kémiai Tanszék, Fehérjekrisztallográfiai Laboratóriumában

2 Köszönetnyilvánítás Elsőként szeretnék köszönetet mondani témavezetőimnek Dr. Vértessy Beátának, hogy megteremtette számomra a hatékony kutatómunka feltételeit, kimagasló szakértelmével és barátságával páratlan támogatást nyújtott, és Náray- Szabó Gábornak Professzor Úrnak, hogy hasznos tanácsaival mindvégig segítette a munkámat. Kollégáim, Németh Veronika, Kovári Júlia és Zagyva Imre az itt leírt kutatásokban partnereim voltak, a mintaelőkészítésben és a biokémiai vizsgálatokban felbecsülhetetlen segítséget nyújtottak. Köszönetet szeretnék mondani dr. Böcskei Zsoltnak, hogy megismertetett a fehérjekrisztallográfiával. Hálával tartozom dr. Harmat Veronikának kivételes segítőkészségéért és barátságáért, amivel a krisztallográfiai vizsgálatok során felmerülő problémákon mindig segített túljutni. Doktori munkám során két hosszabb tanulmányutat töltöttem az European Molecular Biology Laboratory hamburgi részlegénél (EMBL Hamburg Outstation) az European Community Marie Curie Training Sites és az European Molecular Biology Organisation (EMBO) támogatásával, ahol Prof. Matthias Wilmanns laborjában volt szerencsém dolgozni. Ezért a páratlan lehetőségért köszönet illeti a támogató szervezeteket és Prof. Matthias Wilmanns-t. Krisztallográfiai munkákban ez idő alatt nyújtott segítségét köszönöm Alexander Popov-nak, valamint Sallai Lászlónak. Meleg köszönet továbbá Katja Schirwitz-nek és Ela Nowak-nak, akik a Hamburgban töltött idő alatt és után szaktudásukkal és kivételes barátságukkal felbecsülhetetlen támogatást nyújtottak. Az eddig felsoroltak mellett Hollósi Miklós Professzor Úr, Deák Andrea és kollégáim, Beke Angéla, Takács Enikő, Varga Balázs és Dubrovay Zsófia építő hozzászólásaikkal számos esetben hozzájárultak hipotéziseim kialakulásához és a gondolatmenetek végig viteléhez. Köszönet illeti továbbá valamennyi kollégámat és családtagomat türelmükért, támogatásukért és hasznos tanácsaikért. 2

3 Tartalomjegyzék Köszönetnyilvánítás 2 Tartalomjegyzék 3 Táblázatok jegyzéke 4 Ábrák jegyzéke 5 1. BEVEZETÉS 6 2. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE 8 3. IRODALMI ÁTTEKINTÉS Enzimatikus katalízis Foszfátészterek enzimatikus hidrolízise Enzimmechanizmus vizsgálata kinetikus krisztallográfiával A dutpáz enzim Élettani szerep A dutpáz szerkezete A dutpáz enzim katalitikus mechanizmusa Célkitűzések és a kísérletek racionális tervezése MÓDSZEREK ÉS MÓDSZERTANI EREDMÉNYEK Anyagok Fehérjetermelés Klónozás és mutagenezis Expresszió és fehérjetisztítás A fehérjeminta jellemzése SDS-gélelektroforézis, fehérje-koncentráció meghatározás Aktivitásmérés Dinamikus fényszórás Röntgendiffrakciós szerkezetvizsgálat Kristályosítás Adatgyűjtés Adatfeldolgozás, finomítás 37 3

4 5. EREDMÉNYEK ÉS MEGBESZÉLÉSÜK A nukleofil támadó azonosítása Enzim-szubsztát komplex szerkezet Inaktív dutpáz mutáns Fiziológiás és módosított szubsztrát A dutpáz katalizált reakció mechanizmusa - hipotézis A nagyenergiájú köztitermék A termékek távozása ÖSSZEFOGLALÁS IRODALOMJEGYZÉK KÖZLEMÉNYEK LISTÁJA Táblázatok jegyzéke: 4.1. Táblázat - Gyűjtött adatkészletek Táblázat - Adatfeldolgozó programok Táblázat - A krisztallográfiai szerkezetmegoldás jellemző adatai Táblázat - dutpáz katalizált dutp és α,β-imino-dutp hidrolízis reakciók kinetikai és ligandumkötési állandói Táblázat - AspIIIAsn mutáns dutpáz dutp hidrolízisére vonatkozó kinetikai és ligandkötési állandói 53 4

5 Ábrák jegyzéke 3.1. ábra - Az associatív és a disszociatív mechanizmus sematikus ábrázolása ábra - Egy foszfát-monoészter nukleofil szubsztitúciós reakciójának feltételezett átmeneti állapota ábra - Citozin dezaminálása és a bázisok bázispárosodási tulajdonsága ábra - A dutpáz által katalizált reakció ábra - A timin-mentes sejthalál. A dutpáz élettani szerepe ábra - Timin metabolizmus. Timin-mentes sejthalál a kemoterápiában ábra - A dutpáz trimer szerkezete (1F7R 1 ) ábra - Konzervált szekvencia motívumok ábra - A függőcsepp módszer ábra - Az alacsony hőmérsékletű mérés kísérleti elrendezése ábra - Az α,β-imino-dutp szerkezeti képlete ábra - α,β-imino-dutp kísérletileg észlelt hidrolízise dutpáz által ábra - A dutpáz szerkezete ábra - Aktív hely szerkezete az enzim-szubsztrát (vad típusú E. coli dutpáz: α,β-imino-dutp:mg 2+ ) komplexben és a nukleofil támadó azonosítása ábra - A vad típusú (sötét tónusú színek) és az AspIIIAsn mutáns (világos tónusok) E. coli dutpáz:α,β-imino-dutp:mg 2+ komplexek szerkezete egymásra illesztve ábra - A természetes (dutp) és imino-analóg szubsztrát kötődésének összehasonlítása ábra - Mindkét szubsztrát azonos módon kötődik vad típusú és az AspIIIAsn mutáns enzimben ábra - A katalitikus vízmolekula az apo-enzimből származik ábra - A nukleofil támadás geometriája ábra - Hipotetikus reakcióséma ábra - A nagyenergiájú köztitermék ábra - A nagyenergiájú köztitermék általam meghatározott (a) és elméletileg jósolt (b) szerkezetének összehasonlítása ábra - Foszfát-transzfer és foszfátészter hidrolízis reakciókat kísérő konformációs átrendeződések ábra - Az szubsztrát és a termék elektronsűrűségének összege nem eredményez a köztiterméknek megfelelő elektronsűrűséget ábra - A dolgozatban használt kétféle dutpáz fehérje szerkezetének összehasonlítása ábra - Az enzim-szubsztrát és az enzim-intermedier komplex szerkezet összehasonlítása ábra - Az α-aminofoszforán β- és γ-foszfát csoportjának betöltöttsége nem 100%-os ábra - Rövidebb motívumközi régió a MPMV dutpázban ábra - Apo-enzimhez hasonlatos oldallánc konformációk az enzim-termék komplex szerkezetben ábra - A dutp hidrolízis mechanizmusa ábra - Kölcsönhatás hálózat az enzim-szubsztrát (a), enzim-intermedier (b) és enzim-termék (c) komplex szerkezetben ábra - A foszfátészter hidrolízis köztitermékének stabilizálása a dutpáz enzimben. 80 5

6 1. Bevezetés Az élő szervezetekben számos olyan vegyülettel találkozunk, amelyek foszfát csoportot tartalmaznak. Közülük számosban a foszfátcsoport észterkötéssel kapcsolódik valamely szerves csoporthoz, és igen gyakoriak a több foszfát csoportot tartalmazó, foszforsav anhidrid jellegű vegyületek (például nukleotid-trifoszfátok) is. E vegyületek számos életfontosságú folyamatban vesznek részt, mint amilyen a jelátvitel, a DNS-szintézis és számos metabolikus folyamat. A nukleotid-trifoszfátok nagy energiatartalmú foszforsav-anhidrid kötése kiemelkedő fontossággal bír a szervezet energiaháztartásában, hidrolízise számos metabolikus folyamat számára biztosítja a szükséges energiát. E vegyületek vizsgálata hosszú múltra tekint vissza, kulcsfontosságú kérdések, azonban még ma is tisztázatlanok. Egy úttörő jellegű, habár vitatott, krisztallográfiai eredménynek 2 köszönhetően, a foszfátészterek reakciói a közelmúltban újra a figyelem középpontjába kerültek 3-5. Fontosságuk és reakcióik kémiájának tisztázatlan volta miatt ilyen természetes foszforvegyületek vizsgálatát, reakcióik tanulmányozását választottam doktori munkám tárgyául. Kémiai érdeklődéssel, de egészségügyi perspektívák miatt, az élő szervezetekben végbemenő folyamatokra összpontosítva, enzimkatalizált reakciókat vizsgáltam. Az enzimek, melyek fenti vegyületek foszfátcsoportján végbemenő reakciókat katalizálnak, igen hasonló aktív centrummal rendelkeznek és a katalízis mechanizmusa is kisebb egyedi sajátságoktól eltekintve azonos, függetlenül attól, hogy az érintett vegyületben a foszfátcsoport észter- vagy anhidridkötésben vesz részt. Emiatt ezen enzimeket egy nagy osztályba sorolják és szubsztrátjaikat, a foszfátcsoportot tartalmazó vegyületeket - némi pongyolasággal - általánosan foszfátésztereknek nevezik az irodalomban 6,7. A foszfátészterek e tágabb értelemben vett csoportja, a valóban észter kötésű vegyületek mellett savanhidrideket, sőt savamidokat is tartalmaz. Mivel ez az elnevezés az angol nyelvű szakirodalomban teljesen általánosan elterjedt, dolgozatomban én is ehhez fogok ragaszkodni, így a vizsgált dezoxi-uridin-trifoszfátot "foszfátészter"-nek, a benne található P(O 2 ) O P(O 2 ) kötést pedig konzekvensen észterkötésnek fogom nevezni. A dolgozatban szerkezeti pillanatfelvételek sorozatát mutatom be, amely enzimkinetikai vizsgálatokkal kiegészítve feltárja a dutpáz enzim által katalizált foszfátészter hidrolízis reakció mechanizmusának részleteit. Enzim-szubsztrát, enzim-intermedier és enzim-termék komplexek kristályszerkezetei bemutatják, hogy 6

7 ez a DNS-ben kódolt információ hűségéért, a DNS integritásáért felelős enzim hogyan működik. A szubsztrát hidrolízise egy vízmolekula "in-line" nukleofil támadásával indul, ami egy új kovalens kötés kialakulását eredményezi az α- foszforatomon. A nagyenergiájú köztitermék stabilizálása a következő tényezőknek köszönhető: i) megváltozik a foszfátlánc kölcsönhatása a katalízist segítő Mg 2+ - ionnal, ii) az enzim három konzervált szekvencia motívumában található aminosav oldalláncok összehangolt elmozdulása és iii) a vízmolekulák alkotta hidrogénkötéses hálózat megváltozása. Eredményeink bizonyítékot szolgáltatnak az enzimológia egyik alaptételére, miszerint az enzimek katalitikus hatásukat a reakció átmeneti állapotának stabilizálásával érik el. 7

8 2. Rövidítések jegyzéke CCD: töltéskapcsolt eszközök (charge coupled device) DTT: ditio-treitol dttp: dezoxi-timidin-trifoszfát dutpáz: dezoxi-uridin-trifoszfát-nukleotido-hidroláz dudp: dezoxi-uridin-difoszfát dump: dezoxi-uridin-monofoszfát dutp: dezoxi-uridin-trifoszfát E. coli: Escherichia coli baktérium EDTA: etilén-diamin-n,n,n,n -tetraecetsav EMBL/DESY: European Molecular Biology Laboratory / Deutsche Electronen- Synchrotron (Hamburg, Németország) ESRF: European Synchrotron Radiation Facility (Grenoble, Franciaország) k cat : katalitikus sebességi állandó K M : Michaelis állandó, a szubsztrát kötéserősségét jellemzi LB: Luria-Bertani (tápoldat) MPMV: Mason-Pfizer majom vírus (Mason-Pfizer Monkey Virus) PMSF: fenil-metil-szulfonil-fluorid PP i : anorganikus pirofoszfát SDS-PAGE: Na-dodecil-szulfát poliakrilamid gélelektroforézis SIRAS: single isomorphous replacement and anomalous scattering TCEP: Tris(2-karboxietil)foszfin hidroklorid TES: N-tris[hidroximetil]metil-2-amino-etán-szulfonsav Tris/HCl: Tris(hidroximetil)aminometán sósav puffer elegy W cat : katalitikus vízmolekula 8

9 3. Irodalmi áttekintés 3.1. Enzimatikus katalízis Foszfátészterek enzimatikus hidrolízise Az enzimek az élő szervezetekben végbemenő reakciókat segítő biológiai katalizátorok. Ezek a fehérjék, a természet lenyűgöző alkotásai közé tartoznak, a kémiai reakciókat akár 16 nagyságrenddel is meg tudják gyorsítani. E csodálatos rendszerek vizsgálata, működésük megértése hosszú évtizedek óta méltán foglalkoztatja a természettudósokat. A kutatók számos modellrendszer vizsgálata nyomán próbálnak általános érvényű szabályokat felállítani a kimagasló katalitikus hatás eszköztáráról, a puszta analitikus kíváncsiság mellett mesterséges lemásolásuk céljával, hiszen ilyen hatékony katalizátorok ipari tervezése és alkalmazása felmérhetetlen perspektívákat nyújt. E cél érdekében azonban még számos modell enzimen gyűjtött adattömegre van szükség. A szerves kémiában ismeretes nukleofil szubsztitúciós reakciókat két csoportba soroljuk, S N 1 és S N 2 típusú. Mivel az enzimológiában szinte soha nem fordul elő e két típus közül egyik sem tisztán, más elnevezéseket használnak. Megkülönböztetnek két szélső esetet, nevezetesen asszociatív és disszociatív mechanizmust. Asszociatív mechanizmusnak nevezik azt, ha a reakció során először következik be a nukleofil támadás, kialakul egy a köztitermék, amelyben a reakciócentrumon eggyel több kovalens (vagy némi kovalens karakterrel rendelkező) kötés van, mint a kiindulási állapotban, majd ezután elhasad a hasadó kötés és kialakulnak a termékek. A disszociatív mechanizmusú reakció időrendben eltérő, a hasadó kötés elbomlásával indul, egy alacsonyabb koordinációs számú reakciócentrummal rendelkező köztitermék alakul ki, majd ezután köt be a nukleofil támadó. Ezek a szélső esetek azonban legritkábban fordulnak elő, ezért a valós enzimkatalizált reakciók esetében a mechanizmust százalékosan kifejezett asszociatív-disszociatív karakterrel jellemzik. 9

10 Asszociatív Disszociatív 3.1. ábra - Az associatív és a disszociatív mechanizmus sematikus ábrázolása a) Asszociatív mechanizmusú reakció során először következik be a nukleofil támadás, a kialakuló köztitermékben a reakciócentrum koordinációs száma növekszik a kiindulási állapothoz képest, majd elhasad a hasadó kötés és kialakulnak a termékek. b) A disszociatív mechanizmusú reakció a hasadó kötés elbomlásával indul, egy kisebb koordinációs számú reakciócentrummal rendelkező köztitermék alakul ki, majd ezután köt be a nukleofil támadó. A foszfát centrumon végbemenő nukleofil szubsztituciós reakciók oldatban és vákuumban nagy valószínűséggel, az enzimológus nomenklatúrával élve, disszociatívak, míg enzimkörnyezetben feltehetőleg jelentős asszociatív karakterrel rendelkeznek. Foszforsav di- és triészterek szubsztitúciós reakciói (nukleotidtrifoszfátok esetében az α- illetve a β-foszfátcsoporton végbemenő reakciók) esetében a vonatkozó irodalom többé-kevésbé egybehangzóan állítja, hogy a reakciók döntően asszociatív mechanizmussal zajlanak 7, mivel a disszociatív mechanizmus által megkövetelt metafoszfát jellegű intermedierek rendkívül instabilak, amennyiben a foszforatom egyik kovalens liganduma nagy térigényű. Komoly vita tárgyát képezik azonban még napjainkban is mono-észtereken (γfoszfátcsoporton) lejátszódó enzimatikus hidrolízisek és transzfer reakciók, itt ugyanis egy viszonylag stabilis metafoszfát köztiterméken keresztül játszódna a disszociatív mechanizmusú reakció, ami korántsem valószínűtlen. Fenti megállapítások inkább csak támpontok, spekulációk reakcióút jóslására. A napjainkban e területen rendelkezésre álló információ azonban közel sem elegendő általános érvényű szabályok felállításához, egyik vegyületcsoport reakciónak vonatkozásában sem. Általános következtetések érdekében még számos különböző enzim reakciómechanizmusát kell felderíteni, amely cél érdekében a fehérjekrisztallográfusokra még rengeteg tennivaló vár. 10

11 Amennyiben sikerült felderítenünk a reakcióút jellegét (asszociatív, disszociatív, illetve egyikhez-másikhoz közelebbi átmeneti típus), akkor komoly lépést tettünk az enzimatikus reakció megértése felé, de még nem tudunk semmit az enzim által kiváltott sebességnövekedés okairól. Az enzimek katalitikus hatékonysága több tényező együttes hatásának eredménye. Évtizedek óta tartó heves vita zajlik arról, hogy e hatások közül melyik a legfontosabb. A vélemények megegyeznek abban, hogy az enzimek csökkentik a megkötött reaktánsok és növelik az átmeneti állapot stabilitását. A kérdés persze, hogy ezt hogyan érik el? A szubsztrát destabilizálását feltehetőleg az entrópiájának (mozgékonyságának) csökkentésével, sztérikus torzulás kikényszerítésével, valamint az ideális szolvatációs környezetéből való kiragadásával 8 biztosíthatják az "okos" fehérjék. Fontos továbbá, hogy a szubsztrát a katalízishez ideális konformációban kötődik meg 9. Az átmeneti állapot stabilizálásában természetesen nagyon fontos szerepet játszanak konkrét ionos, hidrogénhidas, poláris és hidrofób kölcsönhatások, amelyeket ideális helyen lévő aminosavak nyújtanak. E tényezők mellett a teljes fehérje elektrosztatikus tere úgy fejlődött ki az evolúció során, hogy az átmeneti állapot számára nyújtson ideális polaritású stabilizáló szolvatáló környezetet 10,11. Bővebb említést érdemel még az entrópia faktor. Az enzim ugyanis a reaktánsokat egy kis térrészben hozza össze, amivel szintén elér némi sebességnövekedést, ez azonban, mint kísérleti eredmények és elméleti számítások kimutatták, a teljes katalitikus hatás ( szeres sebességnövekedés) viszonylag kis részét adja csupán (10 2 ). Mindezek mellett dinamikus és kvantum effektusok 12, valamint alacsony energiagáttal rendelkező, kovalens jellegű hidrogénkötések szélesítik a biológiai katalizátorok fegyvertárát. Az átmeneti állapot stabilizálásához egy foszfátészter hidrolízis esetén a következő konkrét szereplőkre van szükség: egy általános savra, egy általános bázisra és elektrofilekre, melyek a terminális foszfátcsoport oxigénatomjainak negatív töltéseit stabilizálják (3.2. ábra) 7. Az általános bázis a nukleofilt stabilizálja, az általános sav pedig a távozó csoportot. Az elektrofilek szerepét betöltheti fémion, arginin, lizin oldallánc vagy más hidrogénkötés donor csoport. Ezeket a szerepeket az enzim különböző részletei látják el. Az enzimkörnyezet ezen említett tényezőkön kívül számos más módon is hozzájárul az enzimkörnyezet a sebesség növeléséhez, mint azt fent részletesebben tárgyaltuk. Mégis kimondható, hogy a 3.2. ábrán feltüntetett szereplők azonosításával, megértettük a katalízis alapját. 11

12 + O R O P O R H O + + A B 3.2. ábra - Egy foszfát-monoészter nukleofil szubsztitúciós reakciójának feltételezett átmeneti állapota. HA: általános sav, B: általános bázis, + : pozitív töltés, vagy hidrogénkötés donor. O H Enzimmechanizmus vizsgálata kinetikus krisztallográfiával Az enzimkatalizált reakciók lefolyását kísérő szerkezeti változásokról nagyon kevés ismeretünk van annak ellenére, hogy egyedi szerkezeti pillanatfelvételek tömkelege áll a kutatók rendelkezésére. Enzimekben kötött termékek, illetve a szubsztrátot vagy az átmeneti állapotot modellező nem reaktív vegyületek szerkezete igen gyakori a fehérje szerkezeti adatbázisban és a vonatkozó irodalomban Számos esetben terveztek specifikus mutációkat enzimekben, vagy megváltoztatták a katalitikus fehérje oldallánc protonáltsági fokát, hogy a természetes szubsztráttal vagy egy célzott intermedierrel stabil komplexet tudjanak előállítani, ami krisztallográfiai vizsgálatnak már alávethető Hosszabb élettartammal rendelkező köztitermékek (mint például enzim oldallánchoz kötött csoportok transzfer reakciókban) viszonylag könnyen vizsgálhatók, megfelelő időpillanatban lefagyasztott fehérjekristályokon időfelbontásos krisztallográfia módszerével Az időfelbontásos krisztallográfia kifejlesztésekor igen ígéretesnek tűnt, azt lehetett hinni, hogy ez a módszer megoldja az enzimológia összes problémáját, kísérletileg meghatározott térszerkezetek alapján készített háromdimenziós molekuláris animáció segítségével mutatva be az enzimek működését. A módszer fejlődése mára lelassult és előre nem látható problémák következtében úgy tűnik, a hozzá fűzött reményeket távolról sem váltotta be. A probléma gyökere kettős. Egyik gond, hogy az időfelbontott kísérlethez biztosítani kell a reakció gyors és egyidejű inicializálását a fehérjekristályt alkotó összes molekulában. Ezt a feladatot mindezidáig csak redoxreakciók esetén sikerült megoldani A módszer felhasználási köre tehát 12

13 napjainkig csak igen kevés enzimrendszer vizsgálatára korlátozódik. A másik probléma, a gyors krisztallográfiai adatgyűjtéshez használt úgynevezett Lauetechnika (a kristályt fehér röntgen fénnyel sugározzák be, így az összes lehetséges reflexiót egy képen gyűjtjük össze ) esetében az adatkészlet felbontása technikai jellegű problémák következében nem növelhető a mechanisztikus vizsgálatok által megkövetelt mértékben. Nagy-energiájú átmeneti állapotok és köztitermékek (a reakciócentrumot képező atomon az arra megszokottól eltérő koordinációs számmal), zérus élettartamuk miatt részletes szerkezetanalízisnek nem vethetők alá. Dolgozatomban bemutatom, hogy a körülmények célszerű megválasztásával lehetséges egy ilyen köztitermék fél életidejét olyan mértékben megnövelni, hogy lehetővé válik a nagy felbontású szerkezetvizsgálata. E tanulmány előrevetíti, hogy más enzimrendszerek esetében is tervezhetőek lehetnek hasonló módosítások, amelyek az enzimreakció részleteit klasszikus krisztallográfiai technikák felhasználásával tanulmányozhatóvá teszik, új perspektívákat nyitva az időfelbontásos jellegű klasszikus krisztallográfia előtt. 13

14 3.2. A dutpáz enzim Élettani szerep A dezoxi-uridin-trifoszfát-nukleotido-hidroláz (dutpáz) enzim szerepének megértéséhez elsőként egy nagyon alapvető, de korántsem triviális biológiai kérdést kell megvizsgálnunk, nevezetesen, hogy miért nincs uracil a DNS-ben. Ennek oka a DNS alkotó citozin bázis kémiai instabilitásában rejlik. Citozin spontán oxidatív dezaminálása ugyanis uracilt eredményez (3.3. ábra) 31. Ez a mutagén módosulás igen gyakran következik be, egy emlős méretű genomban naponta több száz uracil keletkezik citozin dezaminálásával. A módosulás mutagén, mert a timin analóg uracil eltérő bázispárosodási tulajdonsággal rendelkezik, mint a citozin, adeninnel képez stabil bázispárt guanin helyett (3.3. ábra), emiatt a citozin uracil csere a DNS másolásakor, sejtosztódáskor konzerválódik és megváltozik a genetikai kód. H C N N C C O C N N C H N H H H N C N H C C H C N C 1 ' O citozin oxidatív dezaminálás O H H C C C N C N O uracil H C 1 ' C 1 ' H guanin CH 3 H N C N C 1 ' H C C N H C N N C adenin H O H C C C H N C N C 1 ' O timin (5-metil-uracil) 3.3. ábra - Citozin dezaminálása és a bázisok bázispárosodási tulajdonsága. Ezzel a gyakran bekövetkező DNS-károsodással az evolúció úgy szállt szembe, hogy kifejlődött egy DNS javító mechanizmus, amely a hibás bázist, az uracilt kivágja a DNS-ből, majd a DNS-t a másik szál alapján újra szintetizálja. A DNS polimeráz 14

15 enzimek, amelyek a DNS szintézisét végzik nukleotid-trifoszfát építőkövekből, kismértékű szelektivitásuk révén nem tudják az uracilt a timintől megkülönböztetni. Emiatt nemcsak citozin dezaminálásával kerülhet uracil a DNS-be, hanem eleve a szintéziskor is beépülhet a timin helyére. A timint helyettesítő uracil nem mutagén, mivel e két bázis azonos bázispárosodási tulajdonsággal rendelkezik. A báziskivágáson alapuló javító mechanizmus azonban ezt az uracilt is kivágja a DNSből, ami akkor okoz problémát, ha a DNS szintézisénél felhasználható deoxiuridintrifoszfát (dutp) sejtbeli koncentrációja viszonylag nagy a deoxitimidin-trifoszfát (dttp) sejtbeli koncentrációjához képest. Ilyenkor ugyanis a DNS polimeráz gyakran épít be a DNS-be timin helyett uracilt, amit azután a javító mechanizmus eltávolít ugyan, de ezután a DNS újra szintetizálódik, és nagy sejtbeli dutp koncentráció esetén újra uracil épül be. E probléma elkerülhető a dezoxi-uridintrifoszfát-nukleotido-hidroláz (dutpáz) enzim segítségével, mely katalizálja a dutp hidrolízisét dump-vé és pirofoszfáttá (3.2.ábra). + H 2 O + + 2H ábra - A dutpáz által katalizált reakció A dutpáz dutp hidrolízisét katalizálja, termékei dump és pirofoszfát. Ez a foszfátészter hidrolízis reakció kettős élettani szereppel bír: szabályozza a sejtbeli dutp szintet és termeli a dttp szintézis előanyagát (dump). Ezáltal az enzim megakadályozza, hogy uracil épüljön be a DNS-be, valamint hozzájárul timin nukleotidok szintéziséhez, így fontos szerepet tölt be a nukleotid metabolizmusban is

16 TS, DHF red. kontrollálja dutpáz 3.5. ábra - A timin-mentes sejthalál. A dutpáz élettani szerepe. dutpáz hiányában megnövekvő a dutp/dttp arány a sejt DNS-javító mechanizmusát hiperaktív ciklussá változtatja, ami a kromoszóma fragmentálódásához, sejthalálhoz vezet. Az enzim hiányában megnövekszik a dutp/dttp arány a sejtekben és uracil épül a DNS-be. Ez az elváltozás a sejt DNS-javító mechanizmusát hiperaktív ciklussá változtatja, ami végeredményben a felszaporodó báziskivágások miatt a kromoszóma fragmentálódásához, sejthalálhoz vezet (3.5. ábra) 33,34. Az úgynevezett timin-mentes sejthalál, a timin metabolizmus más enzimeinek gátlásával való indukálása gyakran használt rák- és vírusellenes kemoterápiás útvonal (metotrexát, fluorouracil) 35 (3.6. ábra), mivel elsősorban aktívan osztódó sejtekre káros 36. A dutpáz gátlása nyilvánvalóan hasonló hatású lenne, sőt számos új publikáció számol be annak jelentős előnyeiről Az enzim esszenciális voltát igazolja még, hogy nullmutációja (a fehérjét kódoló gén kivágása a genomból) több fajban letális 41,42, továbbá az, hogy számos vírus korlátozott méretű genomjában kódolja saját dutpázát

17 dutpáz antagonisták dutp dutpáz dump THF DNS Fluorouracil (FdUMP) TS DHF reduktáz Methotrexát dttp dtdp dtmp dihidrofolát 3.6. ábra - Timin metabolizmus. Timin-mentes sejthalál a kemoterápiában. Timin-mentes sejthalál indukálásával ható napjainkban alkalmazott kemoterápiás szerek és célpontjaik a timin metabolizmusban. A dutpáz gátlása kiegészítő vagy önálló terápiaként ígéretes A dutpáz szerkezete Az antagonisták célzott tervezéséhez a szerkezet-hatás összefüggések feltárására van szükség. Mint a kristályszerkezetekből kiderül, az enzim homotrimer szerveződésű, az alegységek β-szálai ún. "lekvárostekercs" (jelly roll) módon tekerednek fel antiparallel β-lemezzé, melynek integráns eleme a szomszédos alegység egyik β-szála, így a trimer nagyon stabilis (3.7. ábra) 44,45. Monomer A Monomer C Monomer B 3.7. ábra - A dutpáz trimer szerkezete (1F7R 1 ). A homotrimer enzim egyes alegységei eltérő színű szalagmodellel ábrázolva. Az aktív helyen kötött ligandumot (dudp) atomi színezésű (C: szürke, O: piros, N: kék, P: narancssárga) pálcika-modell szemlélteti. Az alegységek β-szálai ún. "lekvárostekercs"-et (jelly roll) képeznek. 17

18 A fehérje általános feltekeredése ("foldja") a különösen konzervált, retrovírusoktól az emberig minimális változtatásokkal megőrződött 1, A dutpázok szubsztrátspecificitása rendkívül szigorú, a bázis, a cukorrész és a foszfátlánc tekintetében egyaránt, ami kétségkívül elengedhetetlen más, a szervezet számára szükséges nukleotidok energiapazarló hidrolízisének elkerülése érdekében. Az enzimben a szubsztrát megkötéséért felelős oldalláncok a polipeptidlánc öt konzervált szekvencia motívumában csoportosulnak, melyek a szekvencia mentén elszórva találhatók (3.8. ábra). A konzervált motívumok konszenzus szekvenciái a következők, I. motívum: Ala-Gly-(Pho)-Asp-Leu; II. motívum: (Pro/Gly)-(Arg/Lys)- Ser; III. motívum: Gly-(Pho) 2 -Asp-(Nnn) 2 -Tyr-(Nnn)-Gly; IV. motívum: Arg-(Pho)- Ala-Gln; V. motívum: Arg-Gly-(Nnn)2-Gly-Phe-Gly-(Ser/His)-(Thr/Ser)-Gly (az aminosavak hárombetűs kódjaival, Pho: hidrofób oldalláncú aminosav és Nnn: bármilyen aminosav) 47,48. Az egyes aktív centrumokat a három különböző alegységhez tartozó motívumok hozzák létre oly módon, hogy minden egyes aktív hely felépítésében mindhárom alegység részt vesz 44,49. Például a 3.8. c ábrán feltüntetett aktív helyhez a kék színű A monomer a 3. motívumát adja, a zöldre színezett B monomer 1., 2., és 4. motívumával járul hozzá, míg a sárga C monomer C-terminális 5. motívumával karol át és zárja le az aktív hely bejáratát. Ez az utóbb említett C-terminális régió igen flexibilis, kristályszerkezetekben általában nem látható, de jelenléte ennek ellenére bizonyítottan nélkülözhetetlen az enzim működéséhez 49. Az alegységek között létrejövő ilyen magas fokú kooperáció eddigi ismereteink szerint egyedülálló a homooligomer fehérjék körében. 18

19 a) Eucarya Motif III Motif I Motif II DMEL (15)KIDTCVLRFAKLTENALEPVRGSAKAAGVDLRS--AYDVVVPARGKAIVKTDLQVQVPEG-SYGRVAPRSGLAVKNFIDVG--AGVVDEDYRGNLGVVLFNHS- HSAP (18)EVGGMQLRFARLSEHATAPTRGSARAAGYDLYS--AYDYTIPPMEKAVVKTDIQIALPSG-CYGRVAPRSGLAAKHFIDVG--AGVIDEDYRGNVGVVLFNFG- SCER (2) ATSDKVLNIQLRSASATVPTKGSATAAGYDIYA--SQDITIPAMGQGMVSTDISFTVPVG-TYGRIAPRSGLAVKNGIQTG--AGVVDRDYTGEVKVVLFNHS- Eubact. MTUB --MSTTLAIVRLDPGLPLPSRAHDGDAGVDLYS--AEDVELAPGRRALVRTGVAVAVPFG-MVGLVHPRSGLATRVGLSIVNSPGTIDAGYRGEIKVALINLDP ECOL (2) KKIDVKILDPRVGKEFPLPTYATSGSAGLDLRACLNDAVELAPGDTTLVPTGLAIHIADPSLAAMMLPRSGLGHKHGIVLGNLVGLIDSDYQGQLMISVWNRG- HINF (1) KKIDVKILDSRIGNEFPLPTYATEGSAGLDLRALIDESFEIQPGETKLIPTGLSIYIADPNLAAVILPRSGLGHKHGIVLGNLVGLIDSDYQGPLMVSMWNRG- Retrovir. EIAV MLAYQGTQIKEKRDEDAGFDLCVP--YDIMIPVSDTKIIPTDVKIQVPPN-SFGWVTGKSSMAKQGLLING---GIIDEGYTGEIQVICTNIG- 1FIV MIIEGDGILDKRSEDAGYDLLAA--KEIHLLPGEVKVIPTGVKLMLPKG-YWGLIIGKSSIGSKGLDVLG---GVIDEGYRGEIGVIMINVS- MPMV (12)SLWGSQLCSSQQKQPISKLTRATPGSAGLDLCS-TSHTVLTPEMGPQALSTGIYGPLPPN-TFGLILGRSSITMKGLQVYP---GVIDNDYTGEIKIMAKAVN- Motif IV Motif V Eucarya DMEL DVDFEVKHGERIAQFICERIF-YPQLVMVDKLEDT----ERGEAGFGSTGVKDLPAAKAQNGNGEKAAEPEGAA 182 HSAP KEKFEVKKGDRIAQLICERIF-YPEIEEVQALDDT----ERGSGGFGSTGKN SCER QRDFAIKKGDRVAQLILEKIVDDAQIVVVDSLEES----ARGAGGFGSTGN Eubact. MTUB AAPIVVHRGDRIAQLLVQRVELVELVEVSSFDEAGLASTSRGDGGHGSSGGHASL ECOL QDSFTIQPGERIAQMIFVPVV-QAEFNLVEDFDAT----DRGEGGFGHSGRQ HINF NEPFKIEVGDRIAQLVFVPVV-QAEFNIVEDFQQT----ERGEGGFGHSGKQ Retrovir. EIAV KGNIKLIEGQKFAQLIILQHHSNSRQPWDENKIS-----QRGDKGFGSTGVF FIV RKSITLMERQKIAQLIILPCKHEVLEQGKVVMDS-----ERGDNGYGSTGVF MPMV -NIVTVSQGNRIAQLILLPLI----ETDNKVQQP-----YRGQGSFGSSDIY b) c) N C 3.8. ábra - Konzervált szekvencia motívumok a) Szekvencia összerendezés különböző fajokból származó dutpázokra retrovírusoktól az emberig. b) A konzervált szekvencia motívumok elhelyezkedése a fehérje elsődlegesés térszerkezetében (lila színnel jelölve). A konzervált motívumok a szekvencia mentén elszórva találhatók. c) Az egyes aktív helyek felépítéséhez mindhárom alegység konzervált szekvencia-motívumokkal járul hozzá A dutpáz enzim katalitikus mechanizmusa Hatékony gátlószerek tervezése céljából kétségkívül elengedhetetlen a reakciómechanizmus részletekbe menő megismerése, és annak megértése, hogy az enzim hogyan járul hozzá a reakció gyorsításához. Túlmenően a dutpáz által katalizált egyedi reakció élettani jelenőségén, az előző fejezetben részletesen tárgyaltak szerint, a foszfátészterek hidrolízis reakcióinak vizsgálata hosszú ideje 19

20 komoly vitáktól forrongó terület, amely ráadásul a közelmúltban még inkább a figyelem középpontjába került, egy meglepő és korszakalkotó, habár vitatott kísérleti eredménynek köszönhetően 2,4. A dutpáz enzim által katalizált reakció mechanizmusáról a jelen értekezésben leírt vizsgálatok megkezdésekor ismeretes volt, hogy nukleofil szubsztitúciós reakció játszódik le. A nukleofil támadás a dezoxiuridin-trifoszfát ligandum α-foszforatomján megy végbe. Ezt 18 O-ban dúsított vízben végzett kísérletekkel bizonyította egy svéd kutatócsoport. A kísérlet során a jelölt vízzel végzett hidrolízis után a 18-as izotóp oxigénatomot a dump α-foszfát csoportján találták nem a pirofoszfáton 50. Tisztázatlan volt azonban, hogy a nukleofil támadást milyen entitás végzi, vagyis hogy egy vízmolekula (illetve hidroxid-ion) közvetlen támadása megy-e végbe, vagy esetleg a reakciót egy fehérje-oldallánc indítja, kovalens enzim-szubsztrát köztiterméket kialakítva, amely azután tovább hidrolizál egy vízmolekula (illetve hidroxid-ion) közreműködésével. (Nehéz perdöntő bizonyítékkal szolgálni azzal kapcsolatban, hogy vízmolekula vagy hidroxidion reagál, de a reakció sebességi együtthatójának kismértékű ph függése alapján a vízmolekula valószínűsíthető.) A dutpáz reakció asszociatív, illetve disszociatív karakterét tekintve semmilyen kísérleti információ nem állt rendelkezésre. Elméleti meggondolások szerint, az α- illetve a β-foszfátcsoporton végbemenő szubsztitúciós reakciók feltehetőleg döntően asszociatív mechanizmussal zajlanak, mivel a disszociatív mechanizmus által e reakciók esetében megkövetelt metafoszfát jellegű intermedierek a foszforatomon nagy térigényű kovalens ligandumot tartalmaznának és ezért rendkívül instabilisak lennének. Az irodalomban és a fehérje szerkezeti adatbázisban (Protein Data Bank) található számos dutpáz és dutpáz-ligandum komplex kristályszerkezet 1,44-47 alapján azonosították a fehérje általános foldját és jellemezték az aktív helyet (lásd fejezetben). A mechanizmussal kapcsolatos kérdések, mint a nukleofil támadó ágens azonosítása és fehérje oldalláncok szerepe a katalízisben, viszont tisztázatlanok maradtak. Ennek oka, hogy a közölt szerkezetek alapján nem lehetséges a katalízis szempontjából releváns szubsztrátkonformáció megismerése. A reakció beindulásához, a nukleofil támadás bekövetkezéséhez ugyanis a szubsztrátnak az enzim aktív helyén egy bizonyos jól definiált konformációban kell elhelyezkednie. E konformáció ismerete alapfeltétele a nukleofil ágens 20

21 azonosításának, továbbá nélkülözhetetlen a reakció lefolyásának feltérképezéséhez, és a katalízisben szerepet játszó fehérje oldalláncok karakterizálásához is. Katalitikusan releváns szubsztrátkonformáció azonban csak akkor jön létre, ha valódi szubsztrát vagy ahhoz nagyon hasonló ligandum kötődik az aktív helyen, a katalízisnek megfelelő körülmények között. Így a dutpáz esetében dezoxi-uridintrifoszfát (dutp) ligandum kötődésére lenne szükség Mg 2+ ionok jelenlétében. Az élő szervezetekben ugyanis az enzimreakció Mg-ionok jelenlétében zajlik és laboratóriumi körülmények között is kimutatható, hogy Mg-ionok a szubsztrát kötődését segítik és a katalízis sebességét maximalizálják, vagyis a Mg 2+ az enzim kofaktora 51. A szigorú értelemben vett releváns enzim-szubsztrát komplex szerkezete azonban krisztallográfiával általában nem vizsgálható rövid élettartama miatt. Ezért a vizsgálat célját képező komplexben némi változtatásokat kell alkalmazni. Az irodalomban előttünk leírt szerkezetek esetében Mg-iont egyetlen esetben sem alkalmaztak a komplexképzésnél, egy esetben Sr-ionokkal próbálták azt helyettesíteni 47. (Megjegyzendő, hogy a Sr-ion nem viselkedik kofaktorként, nem növeli az enzim katalitikus hatékonyságát, ezért ez a helyettesítés nem releváns.) Továbbá a legtöbb szerkezet dezoxi-uridin-difoszfát (dudp) vagy -monofoszfát (dump) ligandumot tartalmaz a természetes szubsztrát helyett. Ezek a szubsztrátanalógok nem tartalmazzák a természetes szubsztrát teljes foszfátláncát, így annak konformációjáról nem tudnak megbízható információval szolgálni. Néhány szerkezet tartalmaz ugyan fiziológiás szubsztrátot (dutp-t), de Mg 2+ nélkül 1,45. Mivel Mg 2+ hiányában a dutpáz-dutp komplex élettartama hosszú, e szerkezet fiziológiás reakcióra vonatkozó információtartalma erősen megkérdőjelezhető. A szerkezetek felsorolt hiányosságai tehát megakadályozták a releváns szubsztrátkonformáció, a nukleofil támadó ágens és a katalízisben szerepet játszó fehérjerészletek azonosítását. 21

22 3.3. Célkitűzések és a kísérletek racionális tervezése A fentieknek megfelelően célul tűztük ki a mechanizmussal kapcsolatos tisztázatlan kérdések vizsgálatát krisztallográfiai, enzimkinetikai és mutagenezis technikák felhasználásával. Meggyőződésünk volt, hogy a fent felsorolt hibák kiküszöbölése után készített szerkezeti képek a mechanizmus vizsgálatához kiváló alapot szolgáltatnak majd, és kétséget kizáróan tisztázzák az enzim működésének alapjait. Kísérleteinket tehát úgy terveztük, hogy azok megmutassák a Mg 2+ eddig ismeretlen kötőhelyét, a szubsztrát fiziológiásan releváns konformációját és azonosítsák a nukleofil támadást végző entitást. Mindezen ismeretek birtokában céloztuk meg a reakcióút feltérképezését, hogy ezáltal értsük meg, hogyan gyorsítja meg az enzim a reakciót ilyen jelentős mértékben. Mindezen célok érdekében elsőként terveztünk egy olyan szubsztrát analóg ligandumot, amely a korábban használt ligandumoknál lényegesen jobban hasonlít a természetes szubsztráthoz és várhatóan azzal analóg módon és erősséggel kötődik az enzim aktív helyén. Elvárás volt ezzel a ligandummal szemben még az is, hogy az enzim ne vagy csak nagyon lassan hidrolizálja, vagyis a releváns enzim-szubsztrát analóg komplex élettartama lehetővé tegye a krisztallográfiai vizsgálatot. Az α,βimino-dutp a dutp-hez hasonlóan dezoxi-uridin trifoszfát származék, de a hasadó P O kötés helyett P N kötést tartalmaz. A nukleotid-foszfátok imino-analógjait az enzimológiában elterjedten használják, mert azokkal izosztérikusak, ugyanakkor a P N kötés általában enzimek által a P O kötésnél jóval nehezebben, vagy egyáltalán nem hidrolizálható. A dutpáz enzim, mint később látni fogjuk, képes a foszfo-imid kötést elhidrolizálni, jóllehet a foszfátészter kötésnél lényegesen lassabban. Az α,βimino-dutp-vel végbemenő lassú reakció lehetőséget nyújt a dutpáz funkció részletekbe menő tanulmányozására röntegdiffrakció felhasználásával. Ráadásul több megfontolás és kísérleti eredmény (lásd alább) is támogatja azt a feltevést, hogy a természetes és módosított lassan bomló szubsztráton végbemenő reakciók egymással sok tekintetben megegyeznek. A nitrogénatom kisebb elektronegativitása feltehetőleg elsősorban a reakció utolsó elemi lépésében okoz változást és valószínűleg ez felelős a megváltozott kinetikáért. Katalitikusan releváns enzim-szubsztrát komplex szerkezet meghatározása érdekében tehát együtt kristályosítottam a dutpáz fehérjét α,β-imino-dutp-vel és Mg 2+ -mal. Új enyhén bázikus kristályosítási körülményt fejlesztettem ki, amely elősegíti a Mg-ion kötődését a fehérjében. Deprotonált fehérje oldalláncok ugyanis, 22

23 mint közismert, a fémionokat hatékonyabban tudják koordinálni. A dutpázokat korábban savas ph-n vagy nagy mennyiségű Mg-ionnal komplexet képező citrát-sók felhasználásával kristályosították. Így az új körülménynek köszönhetően első ízben lehetőség nyílt a teljes trifoszfátláncot és a fiziológiásan fontos Mg-iont is tartalmazó kristályszerkezet tanulmányozására. E szerkezet alapján terveztünk egy specifikus pontmutációt, a III. motívumban található aszpartátot (AspIII) aszparaginra cseréltük. Az AspIIIAsn mutáció az enzimet inaktívvá tette. A vad típusú és a mutáns enzim szerkezetének összevetésével, valamint enzimkinetikai vizsgálatokkal meggyőző bizonyítékokat gyűjtöttem a nukleofil támadó ágens mibenlétéről. E szerkezetek mellett meghatároztam még az enzim-termék (dutpáz-dump) komplex szerkezetét, amely hasznos információkkal szolgált a reakció befejező lépéséről, a termékek távozásának sorrendjéről. A szerencsés körülménynek köszönhetően, miszerint az α,β-imino-dutp a dutpáz enzimnek lassan hidrolizálható szubsztrátja, lehetségessé vált továbbá a reakció példátlanul részletes vizsgálata a kristályokban. Egy retrovirális fajból származó dutpáz forma ugyanis, amely szokatlanul alacsony katalitikus hatékonysággal rendelkezik 52, a lassú α,β-imino-dutp szubsztrátot annyira lassan hidrolizálja, hogy klasszikus krisztallográfiai technikával a reakció jellegzetes nagyenergiájú köztitermékét a kristályszerkezetben láthatóvá lehetett tenni. Emiatt a kristályosítás és az adatgyűjtés időzítése kritikus volt. Az első kristályok négy nap után jelentek meg a cseppekben. Az adatgyűjtés céljára egy kristályt megjelenése, vagyis az enzim-szubsztrát (α,β-imino-dutp) elegy négy napos inkubálása után azonnal lefagyasztottunk és röntgendiffrakciós adatkészletet gyűjtöttünk róla. Ez az időzítés, tekintetbe véve a reakciósebességet, biztosította, hogy a reakció teljes végbemenetele előtti időpillanatban készítsünk szerkezeti képet az enzimről. 23

24 4. Módszerek és módszertani eredmények 4.1. Anyagok Az α,β-imino-dudp-t 53 Jena Bioscience cégtől vásároltuk, majd enzimatikusan α,β-imino-dutp-vé foszforiláltuk. A termék 98%-os tisztaságúnak mutatkozott ioncsere kromatográfia során. A többi felhasznált analitikai tisztaságú vegyszer a Merck illetőleg Sigma cégektől származott Fehérjetermelés A fehérjéket rekombináns módon baktériumokkal termeltettük, így ugyanis nagy tisztaságú fehérje nyerhető jó kitermeléssel Klónozás és mutagenezis A vad típusú E. coli enzimet kódoló gént pet3a plazmidban Rebecca Perssontól kaptuk 54. Az AspIIIAsn mutáns E. coli dutpáz plazmidot a vad típusú enzimet kódoló plazmidból (pet3a-dut) QuikChange (Strategene) gyors mutagenezis kittel Kovári Júlia készítette. 5'-cctggtaggattgatcAACtctgactatcagggccag-3' és 5'-ctggccctgatagtcagaGTTgatcaatcctaccagg-3' primerekkel polimeráz láncreakciót végezett a fenti pet3a-dut plazmidon, majd a kapott terméket ugyancsak pet3a vektorba építette be, ligáz enzim segítségével 55. A Mason-Pfizer Monkey Virus (MPMV) enzimen végzett molekuláris biológiai és biokémiai kísérleteket Németh Veronikával együttműködve végeztem 52, az általunk újonnan kifejlesztett eljárások felhasználásával. Az MPMV dutpázt egy fiziológiásan hozzá kapcsolódó doménnel, a nukleokapszid doménnel együtt klónoztuk, expresszáltuk és tisztítottuk. A MPMV nukleokapszid-dutpáz expressziós plazmid előállításához az MPMV teljes génállományát tartalmazó FPpSARM4 plazmidon 5'-AAGGCCTGCATATGGCCGCCGCCT-3' és 5'-TAGGCTCGAGTTAATATATGTCTGA-3' primerekkel polimeráz láncreakciót végeztünk. A termékeket kettős restrikciós endonukleázos emésztés után tisztítottuk (QIAquick PCR purification kit) és pet22b plazmidba építettük. A dutpáz gént pet22b plazmidba klónoztuk be. A klónozás sikerét a Magyar Tudományos Akadémia Szegedi Biológiai Központjában végzett DNS-szekvenálás igazolta. 24

25 Expresszió és fehérjetisztítás A vad típusú és AspIIIAsn mutáns E. coli dutpáz fehérjék termelése esetén Persson és munkatársai 54 módszerét követtük. Az expressziós plazmiddal transzformált BL21(DE3)pLysS E. coli baktériumtörzset 37 C-on 100 µg/ml ampicillin és 35 µg/ml kloramfenikol tartalmú Luria-Bertani (LB) tápoldatban exponenciális növekedési fázis eléréséig növesztettük, majd 0,5 mm izopropil-β,dtiogalaktoziddal indítottuk be a dutpáz génről történő fehérje termelést. Indukálás után a sejteket még négy órán keresztül növesztettük. A további műveleteket jégen végeztük. A lecentrifugált sejtcsapadékot 1/10 térfogatú feltáró pufferben szuszpendáltuk, amely 50 mm Tris/HCl (ph 8,0) 150 mm NaCl, 1 mm EDTA, 2 mm MgCl 2, 2 mm ditio-treitol (DTT), és 0,5 mm fenil-metánszulfonil fluorid (PMSF) tartalmú. 0,1 mg/ml lizozim illetve 2 µg/ml RNáz és DNáz hozzáadása után a sejtszuszpenziókat 30 percig jégen kevertettük, majd 3-5 x 60 másodpercig szonikáltuk, és az elegyet további 30 perc kevertetés után lecentrifugáltuk (18,000 x g, 20 perc). A felülúszót 1mM DTT-t és 0,1mM PMSF-et tartalmazó 25 mm Nafoszfát pufferrel egyensúlyba hozott Q-Sepharose (Pharmacia Biotech Fast Flow, 200 ml) anioncserélő oszlopra vittük. Az ioncsere kromatográfiát Gradifrac berendezésen végeztük. A minta felvitele után 200 ml pufferrel mostuk le az oszlopról a nem, illetve gyengén kötődő mintakomponenseket, majd 600 ml 1M NaCl tartalomig vezető lineáris gradienssel végeztük az elválasztást. Az ioncsere kromatográfia után a minta további tisztítására méretkizárásos kromatográfiát alkalmaztunk Superdex 75 HR gélszűrő oszlopon, Pharmacia FPLC (Pharmacia Biotech) vagy Äkta Purifier (Amersham Biosciences) berendezés felhasználásával. Ez utóbbi kromatográfiás lépés, mivel a részecskék mérete alapján végzi az elválasztást, az idegen makromolekulás szennyezők mellett a konformációs heterogenitások egy részét is kiszűri. Emiatt kristályosítást minden esetben gélszűrésnek kell megelőznie. A gélszűrés 0,1 mm Tris(2-karboxietil)foszfin hidrokloridot (TCEP) is tartalmazó 10 mm Tris/HCl pufferben (ph 7,0) történt. Az MPMV nukleokapszid-dutpáz expresszióját a fentiekhez hasonlóan végeztük 52 BL21(DE3) baktériumtörzsben. A feltáró puffer összetétele a következő volt: 50 mm Tris/HCl (ph 8,5) 150 mm NaCl, 5 mm ditio-treitol (DTT), 1 mm fenil-metil-szulfonil fluorid. 2 µg/ml RNáz és DNáz hozzáadása után a sejtszuszpenziókat 30 percig jégen kevertettük, majd szonikálással bontottuk meg a 25

26 sejtfalat (5 x 60 s). Az elegyet további 30 perc kevertetés után lecentrifugáltuk (18000 x g, 20 perc). A felülúszót heparin oszlopon (HiTrap Heparin HP, 5 ml) tisztítottuk. A heparin DNS mimikáló tulajdonsága miatt ez az oszlop DNS-kötő fehérjék tisztítására kiválóan alkalmas affinitás oszlop. Ez a tisztítási módszer azért használható itt, mert szerencsés módon a nukleokapszid-dutpáz fehérjében a dutpázhoz kapcsolt, nukleokapszid domén DNS-kötő tulajdonsággal rendelkezik. A kromatográfia előtt az oszlopot a következő összetevőket tartalmazó oldattal hoztuk egyensúlyba: 50 mm Tris/HCl puffer (ph 8,0), 150 mm NaCl, 5 mm DTT, és 0,1 mm PMSF. A minta felvitele után 5 oszloptérfogatnyi (25 ml) pufferrel mostuk az oszlopot, majd 40 oszloptérfogatnyi (200 ml) 1M NaCl tartalomig vezető gradienssel végeztük az elválasztást. A nukleokapszid-dutpáz 0,35 0,5 M NaCl koncentrációnál jött le az oszlopról. Az affinitás kromatográfiánál kapott fehérjemintát töményítés után Superdex 200 HR gélszűrő oszlopon tisztítottuk tovább Äkta Purifier (Amersham Biosciences) berendezésen. A gélszűrést 50 mm Tris/HCl puffer (ph 8,0), 500 mm NaCl, 1 mm TCEP, és 0,1 mm fenil-metilszulfonil-fluorid tartalmú oldatban végeztük, majd a legtisztább frakciókat 50 mm Tris/HCl puffer (ph 8,0), 200 mm NH 4 Cl, 1 mm TCEP, és 0,1 mm fenil-metilszulfonil-fluorid tartalmú oldatba dializáltuk át. A fehérjemintákat Millipore centrifugális szűrőkön (10 kda pórusátmérővel) töményítettük 5 15 mg/ml végső koncentrációig. A kész mintákat vagy azonnal felhasználtam kristályosítás céljára, vagy folyékony nitrogénben lehűtöttem és - 70 C-on tároltam. 26

27 4.3. A fehérjeminta jellemzése SDS-gélelektroforézis, fehérje-koncentráció meghatározás SDS-poliakrilamid gélelektroforézist (SDS-PAGE) Laemmli szerint 56 12%-os poliakrilamid minigéleken Protean III berendezésben (Bio-Rad) végeztük. A fehérje csíkokat kolloidális Coomassie Brilliant Blue festéssel (Biosafe Coomassie stain; Bio-Rad) tettük láthatóvá, és GelDoc denzitométerrel (Bio-Rad) értékeltük ki. A tisztított fehérje minták egyedüli látható csíkként jelentek meg a géleken, és a gélképek denzitometriás analízise szerint legalább 95%-os tisztaságúnak mutatkoztak. A fehérjeminták koncentrációját Bradford-módszerrel, illetőleg a fehérje ultraibolya spektruma alapján határoztam meg. A Bradford-módszer 57 alapja, hogy a fehérjemintát olyan a fehérjemolekulákhoz specifikusan kötődő festékanyaggal keverjük össze, amelynek molekulái szabad állapotukban másképpen nyelik el a fényt, mint fehérjéhez kötve. Az 595 nm-en bekövetkező fényelnyelésváltozás arányos a fehérjekoncentrációval. A módszer kalibrálására szarvasmarha szérum albumint (BSA) használtam. A fehérjeminták ultraibolya spektrumát JASCO-V550 spektrofotométerrel vettem fel. A spektrumokat minden esetben a fehérjét nem de az oldat minden további komponensét tartalmazó pufferoldattal felvett alapvonallal korrigáltam. A spektrumban 280 nm-nél észlelhető abszorpciós csúcs elsősorban a fehérjében lévő triptofán és tirozin oldalláncoktól származik. Így a fehérje aminosav sorrendje alapján kiszámítható az úgynevezett elméleti fajlagos extinkciós koefficiens (ε 0,1% (1 cm, 280 nm) = 0,52 58 illetve 0,74 E. coli, illetve MPMV nukleokapszid-dutpázra), amely lényegileg 1 mg/ml-es fehérjeoldat elnyelését adja meg. Ennek alapján a fehérjeoldat ultraibolya spektrumában 280 nm-en észlelt korrigált elnyelésből a fehérjekoncentráció közvetlenül számítható Aktivitásmérés A dutpáz katalitikus aktivitásának vizsgálatára kétféle módszert használtam. Egyrészt az enzim szubsztráttal való inkubálása után meghatározott időpontokban a reakcióelegyből vett 1 µl mintát Bakerflex IB2-F szilika gél bevonatú vékonyréteg lapra cseppentettem és a reakcióelegy összetételét vékonyrétegkromatográfiával vizsgáltam 52. A lapokat 6:3:1 összetételű iso-propanol/nh 3 /H 2 O elegyben futtattam meg, majd ultraibolya fénnyel olvastam ki a lapokat. Ezzel a detektálási módszerrel 27

28 az UV-fényt elnyelő entitások, így az uracil gyűrű tehető láthatóvá. Az apoláris jellegű futtató-pufferben a kisebb töltéssel rendelkező részecskék távolabbra futnak az alapvonalról. Ammónia alkalmazásával az a célunk, hogy a foszfátcsoportok töltése jól definiált és maximális legyen, csak így érhetünk el ugyanis a különböző számú foszfát csoportot tartalmazó részecskék között optimális elválasztást. Az elegyünk a szubsztrát dutp mellett dump-t tartalmazhat, amennyiben végbement hidrolízis. Amennyiben a leírt módszerrel végezzük a kromatográfiát, a nukleotidfoszfátok a következő retenciós értékekkel futnak a startponttól a maximális megtett (oldószerfront által elért) távolság százalékában kifejezve: dump: 40% és dutp: 5%. A másik, folyamatos aktivitásmérő módszer a teljes kinetika követésére, az enzim kinetikai jellemzésére, sebességi együtthatók számítására is alkalmas 59. A mérés során a dutp 4.1. egyenlet szerinti hidrolízisekor bekövetkező proton felszabadulást követjük fenolvörös sav/bázis indikátor színváltozásának spektrofotometriás mérésével. dutp + H 2 O dump + PP i +2H A rendszert nagyon enyhén pufferoljuk (1 mm TES/HCl), hogy a ph-t a mérés idejére a fenolvörös indikátor átcsapási tartományában tartsuk, így érünk el optimális intenzitású detektálható jelet. A színváltozást 559 nm-en, JASCO-V550 spektrofotométerrel 1 cm-es küvettában követjük. 40 µm dutp-t, 1 mm TES/HCl puffert (ph 7,5), 0,1 5 mm MgCl 2 -t, 150 mm KCl-t, és 40 µm fenolvörös indikátort tartalmazó oldatban mértem. Az így elkészített oldatokkal alapvonalat vettem fel, majd folytonos detektálás mellett belekevertem 240 nm enzimet. A kezdeti sebességeket a mért görbéken az első 10 másodpercben észlelt meredekségből számítottam. Az enzim kinetikai paramétereket, k cat és K M, a teljes mért görbékből is kiszámítottam az integrált Michaelis-Menten egyenlet felhasználásával 49,50. Kristályosító oldattal mosott kristályokon a fiziológiás szubsztrát dutp-vel végzett kompetíciós kísérletek bizonyították, hogy az enzim a kristályfázisban is mutat katalitikus aktivitást. A kristályokat körülvevő oldatból, mint reakcióelegyből több időpontban vett mintákon a hidrolízist a fent részletezett vékonyréteg kromatográfiás módszerrel követtük. 28