Fehérje kölcsönhatások vizsgálata immunológiai módszerekkel

Átírás

1 Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Fehérje kölcsönhatások vizsgálata immunológiai módszerekkel DIPLOMAMUNKA Témavezető: Dr. Vértessy G. Beáta Készítette: Pukáncsik Mária Budapest

2 Tartalomjegyzék Köszönetnyílvánítás 3 Rövidítések jegyzéke 4 2

3 1. Célkitűzések 5 2. Irodalmi áttekintés A dutpáz szerepe az élő szervezetben A dutpáz, mint új célmolekula gyógyszerszintézisek számára A dutpáz fejlődési állapottól függő szabályozása ecetmuslicában. Az apoptózis fejlődésbiológiai jelentősége. A dutpáz izoformái, lehetséges kölcsönható partnerei A dutpáz enzimcsalád képviselői A dutpáz szerkezete A felhasznált módszerek A dutpáz preparálása Ioncserés folyadékkromatográfia Gélelektroforézis Fehérjék tisztítása és elválasztása gélszűréssel Fehérjekoncentráció meghatározása Bradford referencia alapján Poliklonális antitest nyúlszérumból történő kinyerése Immobilizálás Immunoaffinitás kromatográfia Blottolás Nitrocellulóz illetve PVDF membránra Western blot (immunoblot) Far Western blot Fehérjék detektálása S2 sejtvonal fenntartása és a sejtek feltárása Különböző fejlődési állapotú Drosophila minták előállítása C. elegans fonalas férgek feltárása Homológia modellezés Eredmények és értékelés Immobilizálásra alkalmas tisztaságú Drosophila dutpáz előállítása A dutpáz immobilizálása Antitest izolálása A dutpáz fiziológiás formáinak izolálása S2 extraktból a tisztított antitest felhasználásával A dutpáz kötő fehérjék kimutatása Drosophila mintákon far Western analízissel A dutpáz expressziós szintjének vizsgálata S2 sejtekben Fehérjék detektálása immunobloton blokkoló lépés nélkül 60 3

4 A PVDF membrán szárítása Western blot PBS oldattal Blokkoló közeg az antitest oldatban Far Western blot rövid protokollal A western blot módszer végleges formája PVDF membránra Fonalas férgekből származó sejtextrakt keresztreakciója Drosophila dutpáz ellen termelt antiszérummal A C. elegans dutpáz enzim homológia modellezése Eredmények összefoglalása 77 Irodalomjegyzék 78 Köszönetnyílvánítás Köszönettel tartozom Dr. Vértessy Beátának, aki lehetővé tette számomra, hogy a kutatócsoportjában dolgozhassam, és mint témavezető megismertetett a téma alapjaival. 4

5 Továbbá szeretném megköszönni Békési Angélának a gyakorlati munkámban és a felmerülő problémák megoldásában nyújtott segítségét. Köszönöm Dr. Friedrich Péter professzor úrnak, az Enzimológiai Intézet igazgatójának, hogy engedélyezte munkámat az intézetben. Köszönöm belső konzulensemnek, Dr. László Elemér tanár úrnak értékes tanácsait és támogatását. Köszönettel tartozom Erdei Anna professzor asszonynak, aki az ELTE Immunológiai Tanszékén a poliklonális antitest előállításában segítséget nyújtott. Köszönettel tartozom továbbá dr. Vellai Tibornak, az ELTE Genetika Tanszék munkatársának a C.elegans fonalas férgekkel végzett kísérleteinkhez nyújtott segítségéért. Rövidítések jegyzéke dutpáz dump Ppi dttp (dezoxi-uridin-trifoszfát)-nukleotido-hidroláz dezoxi-uridin-monofoszfát anorganikus pirofoszfát dezoxi-timidin-trifoszfát 5

6 FdUMP dtmp TS DHFR SDS NLS IPTG fluoro-dezoxi-uridin-monofoszfát dezoxi-timidin-monofoszfát timidilát szintáz dihidrofolát-reduktáz sodium-dodecil szulfát nukleáris lokalizációs szignál izopropil-tio-galaktozid EDTA etilén-diamin-n,n,n,,n,,-tetraecetsav EGTA PMSF DTT SDS-PAGE APS FPLC HPLC HEPES BSA CNBr TEA HRP DAB SFM IgG PVDF etilénglikol-bisz-(β-aminoetiléter)-n,n,n,,n, -tetraecetsav fenil-metil-szulfonil-fluorid ditio-treitol sodium-dodecil szulfátos poliakril-amid gélelektroforézis ammónium perszulfát Fast Protein Liquid Chromatography High Protein Liquid Chromatography N- (2-hidroxietil)piperazin-N,- (2-etán-szulfonsav) Bovine Serum Albumine Cianogénbromid trietanol- amin Horse Redish Peroxidáz 3,3,-diaminobenzidine szérum mentes tápoldat G immunoglobulin Polivinilidén- fluorid 1. Célkitűzések A DNS-javításban és a programozott sejthalál útvonalak irányításában a fehérje kölcsönhatások alapvető szerepet játszanak. A dolgozatomban a fenti folyamatokban fontos enzimfehérje, a dutpáz sejtbeli szintjének meghatározására és a vele kölcsönható fehérjék kimutatására összpontosítottam. A dutpáz 6

7 enzim ígéretes új célpontja egyes rákellenes terápiáknak, valamint különböző bakteriális, virális és parazita férgek okozta fertőző betegségek elleni kísérletes terápiáknak. A kölcsönhatások kimutatására kiindulásként a szakirodalomban leírt immunoprecipitációs módszert alkalmaztam. Az egyik fő célkitűzésem az volt, hogy a jelenleg leírt módszerekhez képest jelentősen gyorsabb, és szélesebb körű felhasználást lehetővé tevő technikát dolgozzak ki a dutpáz enzim kölcsönható partnereinek kimutatására. Fontos, hogy a módszer alkalmas legyen a kölcsönható partnerek összetételében bekövetkező bármiféle olyan változás nyomon követésére, melyet a sejt különböző stressz válaszai, fejlődési állapotváltozásai, beteg illetve egészséges jellege okoz. A jelen dolgozatban a következő két módszert igyekeztem kifejleszteni: -az egyik módszer a Far Western blot, amely a sejtextrakt fehérjéinek denaturáló gélen történő szétválasztása után membránon detektálja a fehérjéket. -a másik a ko-immunoprecipitálás módszere, mely során sejtextraktból csapadék formájában nyerjük ki a célfehérjét és kölcsönható partnereit, melyeket ezt követően SDS gélen elválasztva tömegspektrometriás módszerrel azonosítani lehet a megfelelő genomprojekt adatai segítségével. Bizonyított tény, hogy az antitestek számos esetben keresztreakcióra képesek. Ez lehetőséget kínál arra, hogy más szervezetek homológ fehérjéivel reagáljanak. A fentieket kihasználva a dolgozatom másik fő célkitűzése Caenorhabditis elegans és Trichinella spiralis fonalas férgekből Drosophila melanogaster dutpáz ellen termelt antiszérummal reagáló dutpázok azonosítása volt. A C. elegans az apoptózis kísérletek egyik legfontosabb modellszervezete. A C. elegans-sal rokon T. spiralis fonalféreg patológiai jelentősége miatt került a vizsgálandó szervezetek közé: ez a fonalféreg felelős a bélcsatorna fertőzések jelentős részéért. A C. elegans ismert genomi szekvenciája alapján tudjuk, hogy a dutpáz monomerre jellemző szekvencia háromszor egymás után szerepel a génben stop kodon nélkül (policisztronos gén). Ez felveti annak lehetőségét, hogy a dutpáz enzim nem a szokásos homotrimer, hanem egy kovalens trimer. A T. spiralis genomja azonban nem ismert, sem dutpáz génjének szekvenciája. A fentieken túlmenően célul tűztük ki a dutpáz enzim expresszió szintjének sejtciklus-függő vizsgálatát Schneider 2 (S2) Drosophila sejtekben. 7

8 2. Irodalmi áttekintés A dutpáz szerepe az élő szervezetben A dezoxiuridin trifoszfát nukleotidhidroláz (dutpáz) enzim a dutp pirofoszforolízisét katalizálja az alábbi reakció alapján: 8

9 dutp dump + PPi + nh+ A reakcióban a dutpáz enzim kofaktora a Mg2+ ion. A folyamat a nagyenergiájú foszfát hidrolízise miatt gyakorlatilag irreverzibilis. Ezzel a reakcióval az enzim lecsökkenti a sejtben a dutp szintet, és közben termeli a dump metabolitot, ami a dttp bioszintézisének alapvető prekurzora (a timidilát szintáz szubsztrátja). A dutp/dttp arány dönti el, hogy a DNS polimeráz timint vagy uracilt épít be ugyanarra a helyre az adeninnel szembe. A dutpáz által katalizált reakció tehát az uracil DNS-ből való kizárása miatt fontos. De miért hiba a timinanalóg uracil a DNS-ben? A DNS szekvenciában számos környezeti hatás mutációt eredményezhet, melyek kiküszöböléséhez a génállomány folyamatos ellenőrzésére és javítására van szükség, amire a DNS-ben több mechanizmus is kialakult (pl. timidin dimerek kivágása, nem komplementer bázispár javítása, stb.). Fiziológiás körülmények között is spontán bekövetkező gyakori folyamat a citozin oxidatív dezaminálása, ami uracilt eredményez (Lindahl, 1993). Ez a módosulás a következő replikáció alkalmával pontmutációt eredményezne, tehát a citozinból átalakult uracil mutagén, aminek eliminálása esszenciális a genetikai információ megőrzése és átörökítése szempontjából. Az eliminálást egy báziskivágáson alapuló javítómechanizmus végzi, amely eltávolítja az uracilt a DNS-ből (1. ábra). A mechanizmus első lépéseként az uracil-dns glikoziláz elhasítja a dezoxiribóz és az uracil közti glikozidos kötést. Az így bázis nélkül maradt helyen az AP-endonukleáz elhasítja a DNS dezoxiribóz-foszfát gerincét úgy, hogy a 3 OH marad szabadon. Ezután a DNS-polimeráz endogén foszfodiészteráz hatása révén eltávolítja a bázis nélküli dezoxiribózt, és a 3 OH valamint a megfelelő nukleotid-trifoszfát felhasználásával komplementer bázist épít be (Seeberg et al., 1995). Végül pedig a DNS ligáz enzim elvégzi a gerincszál összevarrását. 9

10 U Uracil-DNS glikozidáz AP endonukleáz 3 OH DNS polimeráz endogén foszfodiészteráz aktivitása 3 OH 5 OH DNS polimeráz T 5 OH DNS ligáz T 1. ábra: Báziskivágáson alapuló javító mechanizmus az uracil DNS-ből történő eltávolítására. A komplementer bázis az ábrán timin (T), ami a timin helyére beépült uracil esetén valós. A citozin oxidatív dezaminálása révén létrejött uracil eltávolítása után citozin lesz a beépítendő komplementer bázis. Az uracil-dns glikozidáz enzimmel induló mechanizmus védelmet nyújt a citozin kémiai instabilitásával szemben, de nem tud különbséget tenni a citozin oxidatív dezaminálásával keletkezett mutagén, és a DNS szintézisekor esetleg timin helyére beépült, nem mutagén uracil között. Ezért a timin helyére való uracilbeépülést a DNS polimeráz említett aspecifitása miatt a dutp/dttp arány visszaszorításával kell a sejtnek kivédenie, amit a dutpáz enzim kétfelől is biztosít (2. ábra). 10

11 H H N N H C N C C C N C N O N C C C C N H oxidatív C1' dezaminálás O H C N H C C C N H C1' O O H N H H uracil citozin H C1' guanin mutagén CH3 H N H C N C1' C C N C N O H H N C adenin C N C C C N H C1' O nem mutagén H timin (5-metil-uracil) 2.ábra: A citozin az ábrán látható módon lezajló spontán kémiai átalakulás (oxidatív dezaminálás) során uracillá alakul, ami a következő DNS-replikációs ciklusban nem guaninnal, hanem adeninnel fog bázispárt képezni. Ezért a citozin dezaminációs reakciója mutagén módosulást okoz. A timint helyettesítő uracil nem változtatja meg az adeninnel való bázispár-képzést (azonos H-hidak alakulnak ki), ezért a timint helyettesítő uracil nem mutagén. dutpáz hiányában a magas dutp/dttp arány a DNS uraciltartalmának jelentős növekedését okozza. Ezáltal aktiválódik az uracil kivágásán alapuló javítómechanizmus (1. ábra). A javítás azonban a továbbra is fennálló magas dutp/dttp arány mellett nem lehet sikeres, mert a DNS polimeráz a kivágott uracil helyére újra uracilt épít be. Az így felerősödő hiábavaló ciklus kettősszál-törésekhez, az pedig a kromoszóma fragmentálódásához, majd a sejt halálához vezet. Ezt a jelenséget nevezik timinmentes sejthalálnak (3. ábra) (Traut, 1994). 11

12 dump dump dttp dttp dutpáz dutpáz AAdUMP-nek, dump-nek,aa dttp dttpprekurzorának prekurzorának termelése termelése AAdUTP dutpszint szint csökkentése csökkentése dutp dutp Magas sejtbeli dutp/dttp arány DNS polimeráz U U U U C U U U Uracil (U) szubsztituált DNS dutpáz hiánya BER C C DNS kettősszál törések Kromoszóma fragmentálódás SEJTHALÁL 3. ábra: A dutpáz szerepe a DNS integritásának megőrzésében. 12

13 2. 2. A dutpáz, mint új célmolekula gyógyszerszintézisek számára Az előbbiek alapján a dutpáz specifikus gátlásával várhatóan sejthalál indukálható, amivel terápiás hatást érhetünk el a rákos vagy egyes fertőző megbetegedések esetén. A dutpáz antagonizmus hatékony rákterápiás alkalmazhatóságát több előzetes eredmény is indokolja: 1. A dutpáz gén kifejeződése a sejtciklustól függ (Ladner and Caradonna, 1997). Csak a sejtosztódáskor számottevő az enzim bioszintézise, ezért az enzim gátlása is csak az aktívan osztódó szövetekben okozhat jelentősebb kárt. 2. Két széleskörben alkalmazott kemoterápiás szer, a fluoro-dezoxi-uridin monofoszfát és a methotrexát szintén a timidilát bioszintézist gátolva indukál sejthalált és fejti ki terápiás hatását (4. ábra). 3. Megfigyelték, hogy daganatokban rezisztencia indukálódhat az említett gyógyszerekre, mely rezisztenciával összefüggésbe hozták ezen sejtvonalakban kimutatható, erősen megnövekedett dutpáz aktivitást. Ugyanakkor kimutatták, hogy a dutpáz szint genetikai manipulálással előidézett növelése egyes humán tumoros sejtvonalakban fluorouracilrezisztencia kiváltását okozza (Canman et al., 1994; Pugacheva et al., 2002). 4. Szubsztrátanalóg inhibitorok sejtburjánzás gátló hatását humán rákos sejtvonalakon in vitro is kimutatták (Zalud et al., 1994). 5. A legfrissebb irodalomban közöltek adatokat arra vonatkozóan is, hogy a timinmentes sejthalál útvonal független a p53 fehérjétől (Munoz-Pinedo et al., 2001; Pugacheva et al., 2002). 6. Trichinella spiralis-t és Caenorhabditis elegans-t tanulmányozva, megfigyelték, hogy nyugvó fonalas férgekben erős a timidilát metabolizmus. Mind a timidilát szintáz, mind a dihidrofolát reduktáz, valamint a dutpáz aktivitása különösen magas, vagyis olyan, mint az aktívan osztódó szövetekben. Ebből következően azt gondolják, hogy ezeknek a fonalas férgeknek szükségük van ezekre az enzimekre nyugalmi állapotukban is, ezért mindegyikük potenciális terápiás célpont lehet (Rode et al., 2000). 13

14 dutpáz antagonista dutp DNS dttp Fluorouracil (FdUMP) dtdp dump TS dtmp THF DHF reduktáz Methotrexát dihidrofolát 4. ábra: Kapcsolat a timdilát-szintáz (TS), dihidrofolát-reduktáz (DHFR) és a dutpáz enzimek által katalizált reakciók között. A rákellenes terápiák során széleskörben alkalmazzák a timidilát bioszintézisért felelős enzimeket gátló gyógyszereket. Ezek közül is legismertebbek a timidilát szintázt blokkoló fluorouracil, valamint a dihidrofolát reduktáz gátlásáért felelős methotrexát, melyek jelentős mértékben növelik a sejtbeli dutp/dttp szintet. A rákos sejtek már kialakulásukat is részben annak köszönhetik, hogy bennük az apoptotikus útvonalak jelentős része gátolt. Például a programozott sejthalál előidézésében általában kulcsfontosságú p53 fehérje rosszindulatú sejtekben gyakran olyan mutáció(ka)t mutat, mely(ek) funkciójának teljes, vagy részleges elvesztését okozzák, ezért a p53-függő apoptózis utakon történő terápia hatástalan marad. Ezekben az esetekben a timinmentes sejthalál indukálása mégis a gyógyulás reményével kecsegtethet, különösen, ha ez olyan hatékony módon történik, mint a dttp bioszintézisének első lépését katalizáló dutpáz specifikus gátlása. A fluoro-dezoxiuridinre rezisztenssé vált daganatok esetén a dutpáz antagonizmus szintén ígéretes kiegészítő terápia lehet. Még a retrovírusok is gyakran kódolják genomjukban a saját dutpáz fehérjéjüket. A virális dutpáz elsősorban azon vírusok számára fontos, melyek differenciált sejteket támadnak meg, hisz az ilyen gazdasejtben nincs jelen elegendő saját dutpáz. A virális dutpáz gének nullmutációja csökkenti a vírus fertőző- és szaporodóképességét a differenciált sejtekben, szövetekben (Lerner et al., 1995; Pyles et al., 1992; Threadgill et al., 1993). Ez reményt nyújt arra, hogy egyes vírusos megbetegedések gyógyításában a virális dutpáz antagonistái terápiás jelentőséggel bírhatnak. Az enzim tehát ígéretes célpont új gyógyszertervezések számára. Ahhoz, hogy igazán hatékony és specifikus antagonizmust alkalmazhassunk, meg kell ismernünk egyrészt a fehérje mindenekelőtt az aktív centrum szerkezetét, működését, de 14

15 másrészt a dutpáz funkciót szabályozó mechanizmusokat, valamint az enzim sejtbeli kölcsönható partnerhálózatát is. A dutpáz gátlása megvalósítható kismolekulás szubsztrátanalógokkal ennek hátránya a csökkent specificitás (mellékhatások), de más specifikusabb utakat is választhatunk. Az Enzimológiai Intézetben ezen célkitűzés alapján humán sejtvonalakon sejthalál indukciós kísérleteket végeznek antiszenz technikák felhasználásával. Ezzel párhuzamosan vizsgálják az enzimmel kölcsönható fehérjéket is, melyek között egy korábbi irodalmi adat alapján feltételezhetően létezik gátló hatású fehérje partner is (Nation et al., 1989). A jelen dolgozat ez utóbbi kutatási irányhoz kapcsolódik. 15

16 2. 3. A dutpáz fejlődési állapottól függő szabályozása ecetmuslicában. Az apoptózis fejlődésbiológiai jelentősége. A dutpáz izoformái, lehetséges kölcsönható partnerei A dutpáz hiányában indukálódó sejthalálnak nemcsak preventív vagy terápiás haszna van, hanem úgy tűnik, hogy a természetes fejlődési folyamatokban is előfordul. Egy korábbi irodalmi adat a Drosophila dutpáz egyedfejlődéshez kapcsolt szabályozására utal (Giroir and Deutsch, 1987), amit az Enzimológiai Intézetben végzett jelen kísérletek is alátámasztottak (Békési et al, 2004, J. Biol. Chem.). A lárva állapotok során az enzim expressziója lecsökken, gyakorlatilag nem detektálható Western bloton (5. ábra). S2 E 1L 2L 3L P 5. ábra: Western blot a különböző fejlődési állapotú Drosophila mintákon, ahol S2: S2 sejteket, E: embriót, 1L: 1. stádiumban lévő lárvát, P: bábot jelent. A felső bloton dutpáz izoformákat festettünk, míg az alsón háztartási fehérje tubulint, kontrollként. A dutpáz aktivitás hiányában a lárvális szövetekben magas uracil tartalmú DNS halmozódhat fel, ugyanis a Drosophila genomban nincs homológja a fő uracil-dnsglikoziláznak (UNG2), csak a mismatch specifikus enzimeknek (SMUGI, TDG) (Hardeland et al., 2003), így az uracilos DNS sértetlenül megőrződhet mindaddig, míg a 3. lárva stádium végén egy uracil-specifikus endonukleáz el nem kezd termelődni (Deutsch and Spiering, 1982), ami feldarabolja a lárvális szövetek DNS-ét. Ez a folyamat nagyban hozzájárulhat a bábállapotban zajló tömeges sejthalálhoz, melyek elengedhetetlenek a metamorfózishoz. Ezzel a hipotézissel összhangban az Enzimológiai Intézet kutatócsoportjában azt találták, hogy a lárvaállapotban megmaradt minimális dutpáz mennyiség 16

17 az imaginális diszkuszokban koncentrálódik (6. ábra) (Békési et al, 2004, JBC). Ezek azok a sejtcsoportok, amelyekből a felnőtt légy (imago) szervei kifejlődnek a metamorfózis során. A felnőtt legyekben a petefészekben lokalizálódik a dutpáz (7. ábra). 6. ábra: Lárva szövetek immunhisztokémiai festése dutpázra. zöld: dutpáz lokalizációja az imaginális diszkuszban, kék: DNS (DAPI) jelenléte a diszkuszban és az azon kívül eső szövetekben, 3. panel: egymásra vetített ábrázolás. 7. ábra: Felnőtt ováriumok immunhisztokémiai festése dutpázra. zöld: dutpáz lokalizációja az ovariumban, kék: DNS (DAPI) jelenléte az ovariumban és az azon kívül eső szövetekben, 3. panel: egymásra vetített ábrázolás. A fejlődési állapottól függő szabályozás mellett a csoport eredményei az enzim több szintű szabályozására derítettek fényt a közelmúltban, ami alapján feltételezhető, hogy a dutpáznak számos kölcsönható fehérjepartnere lehet Drosophilában (Békési et al., 2004). A dutpáz enzimnek feltehetőleg több organizmusban is két izoformája létezik. A humán enzim esetén a két izoforma közül az egyik nukleáris, míg a másik mitokondriális lokalizációjú (Ladner and Caradonna, 1997). A Drosophila dutpáz esetében ezzel hasonló módon két izoformát azonosítottak a Vértessy csoportban, az egyik 23 a másik 21 kda látszólagos 17

18 molekulatömegű SDS gélen (Békési et al.,2004). Azonosítottak egy aminosav szekvenciarészletet a 23 kda nagyságú dutpáz izoforma N-terminálisán, amely közeli homológiát mutat más kísérletesen is igazolt nukleáris lokalizációs szignálokkal (NLS). Emellett azonban meghatározott fiziológiás helyzetekben az enzim képes a szignáltól függetlenül is magi lokalizációt mutatni, amint ezt az immunohisztokémiás festések igazolják. Ez a dutpáz lokalizációját perturbálni képes kölcsönható fehérjék létére utalhat. A 21 kda-os izoforma esetében hiányzik ez a feltételezett NLS, ugyanakkor nem tartalmaz egyéb ismert transzport szignált sem. Ez a 21 kda izoforma egyszerűen a nukleáris izoformának egy csonkított formája, szemben a humán mitokondriális izoformával, amely tartalmaz egy extra N-terminális régiót, ami a mitokondriális target szignált bizosítja. Felmerül az a kérdés is, hogy miként biztosítódik a mitokondriumokon belül zajló folyamatos DNS szintézishez a megfelelő dutp/dttp arány, amire szintén választ kaphatunk fehérje-fehérje kölcsönhatásokat feltételezve. A nukleáris izoforma esetén a dutpáz expresszió sejtciklus függő. Ez felveti a kérdést, miként biztosítódik az enzim funkciójának jelenléte a sejtciklus többi szakaszában, amikor ugyan nem az egész genom replikálódik, de a folyamatos DNS javításban is gyakran hosszú DNS láncok szintetizálódnak újra. A csoportban kialakított munkahipotézis szerint ez az ellentmondás megoldódhat, amennyiben a fennmaradó kis mennyiségű dutpáz megfelelően lokalizálódik a javítás helyén, azaz jelen van a DNS javító komplexben a sejtciklus során. A Drosophila dutpáz fejlődési állapottól függő expressziója nem a génexpresszió szintjén szabályozódik, hanem poszttranszkripciós úton. Az előrejelzett inhibitor fehérje mellett a csoportban végzett mérések alátámasztják S2 sejtekben egy dutpáz aktivitást moduláló hatás meglétét, ami csak a teljes hosszúságú (extra Cterminális régiót is tartalmazó) dutpáz esetében érvényesül. Feltételezésünk szerint a fehérjének ez a Drosophilára specifikus régiója, ami nem befolyásolja a rekombináns enzim aktivitását (Kovari et al., 2004), de más fehérje faktorok dutpáz aktivitását szabályozó hatását közvetítheti. Jelen dolgozatban célom volt a dutpázzal kölcsönható fehérjék létének kísérletes vizsgálata. 18

19 2. 4. A dutpáz enzimcsalád képviselői A különböző organizmusokból származó dutpázok szerkezetüket tekintve különböző mértékben térnek el egymástól. Az aminosav szekvenciában minden dutpázban fellelhető 5 konzervatív szekvencia motívum (McGeoch, 1990). A dutpázok két nagy csoportra oszthatók: a herpesztípusú és az ún. EuBaR (az elnevezés a származásukra utal: eukarióta, bakteriális, retrovirális) típusú dutpázok csoportjára (Vertessy, 1997). A herpesz típusú enzimek monomerek, szemben a többi dutpázzal, amelyek homotrimer szerkezetűek. A homotrimerben a három alegység három aktív centrumot alakít ki úgy, hogy minden alegység minden centrumban részt vesz (Mol et al., 1996). A monomer dutpázok kb aminosavat tartalmaznak, szemben a trimer enzimekkel, amelyek peptidlánconként aminosavat tartalmaznak csupán (8. ábra). 8. ábra: A homotrimer Drosophila dutpáz szerkezete. A három alegység polipeptidláncát zöld, kék és sárga szalagmodell mutatja. A három aktív centrumba kötődő szubsztrátanalóg dudp molekulákat térkitöltő modell mutatja, az atomok standard színkódjának felhasználásával (piros: oxigén, kék: nitrogén, fehér: szén, narancs: foszfor). Megfigyelhető, hogy az aktív centrumokba kötődő dudp ligandot mindhárom alegység egyes szegmensei koordinálják. 19

20 Továbbá lényeges különbség az is, hogy a monomer enzimben a konzervatív motívumok más sorrendben és különböző távolságban vannak egymástól, mint a többi dutpázban (9. ábra). Feltételezhető, hogy a monomer változat egy ősi dutpáz gén duplikációja kapcsán jelent meg az élővilágban. N C E u Ba R en zim ek N C Her p es s im p lex 1 9. ábra: Konzerválódott szekvencia motívumok a dutpázok két fő csoportjában. Mi a gyógyszerkutatási szempontból jelentősebb EuBaR típusú dutpázokkal foglalkozunk részletesen. A gyakorlati gyógyszerkutatási célponton túlmenően ezek a homotrimer fehérjék szerkezeti szempontból is különösen érdekesek. Az EuBaR dutpázok esetén különbség mutatkozik a pro- ill. eukarióta szervezetekből származó enzimek között a három alegység közti kapcsolatban, mely különbség alapja lehet az eukarióta dutpázokban feltételezett allosztérikus működésnek (Fiser and Vertessy, 2000). Amennyiben a rákterápia számára akarunk érdemleges alapkutatási eredményekkel szolgálni, érdemes az EuBaR dutpázok csoportján belül is az eukarióta enzimekre koncentrálni. A kutató csoportban Drosophilát használunk modellszervezetként a humán sejtvonalak mellett. A két enzim nagyfokú szerkezeti hasonlósága mellett a szabályozásuk is hasonlóságot mutat. 20

21 2. 5. A dutpáz szerkezete Negyedleges szerkezetük alapján a dutpáz enzimek három különböző csoportba sorolhatóak: - monomer, - homodimer, - homotrimer. A homotrimer forma a legáltalánosabb, megtalálható a prokariótákban, az eukariótákban és a legtöbb vírusban (Larsson et al.,1996; Prasad et al., 1996; Dauter et al., 1999;). Mindegyik enzimben öt konzervált szekvenciamotívumot azonosítottak, melyek az aktív centrumban vagy annak közelében helyezkednek el. Annak ellenére, hogy ezek a szerkezetek igen különböző fajokból származnak, hasonlóságot mutatnak az aktív centrum felépítésében és magas szubsztrát specifitásában (McGeoch, 1990). Monomer dutpázt emlős szervezeteket fertőző herpeszvírusok kódolnak az örökítőanyagukban. Tartalmazzák ugyanazokat a konzervált szekvenciamotívumokat, mint a homotrimer forma, de más sorrendben (McGeoch, 1990). A dimer dutpáz megtalálható protozoákban és Campylobacter jejuni baktériumban (Parkhill et al., 2000). A dimer szerkezetű enzim ellentétben a homotrimer és monomer formákkal nem kódolja az öt konzervált szekvenciamotívumot. Szubsztrátspecifitása alacsonyabb és képes a dudp hidrolízisére is, amely egyébként kétfajta enzim aktivitását gátolja (Bernier-Villamor et al., 1999). Az E.coli dutpáz háromdimenziós szerkezetét röntgenkrisztallográfia segítségével határozták meg. Az enzim egy szimmetrikus trimer, amelynek alegységei 152 aminosavból állnak (Cedergren-Zeppezauer et al., 1992). A különböző enzimek alegységeit alkotó peptidláncok hosszúsága különböző lehet, de szerkezetük mégis jól fedésbe hozható egymással, néhány huroktól eltekintve. Annak ellenére, hogy a különböző organizmusokból származó dutpázok között a korlátozott szekvenciaazonosság a jellemző, mégis minden igazoltan dutpáz aktivitással rendelkező és dudp hidrolízist nem katalizáló fehérjében megtalálható ugyanaz az öt konzervált szekvenciamotívum (McGeoch, 1990). A homotrimer dutpázok alegységeinek a magját β-szálak alkotják (v.ö. 8. ábra). Az egyetlen rövid α-hélix a trimer felületén helyezkedik el. A β-szálak hurokkal kapcsolódnak össze 21

22 és ún. lekvárostekercsbe szerveződnek (Parkhill et al., 2000). A fehérjeszerkezetben a piskótarétegek az egyes β-szálaknak felelnek meg, az összetartó lekvár, ragasztó szerepét a két βszál közötti hidrogénhidak jelentik (Vértessy, 2000). Az ideális lekvárostekercset alkotó β-szálak antiparalell módon rendeződnek össze (10.ábra A), de a dutpáz esetében némely β-szálak paralell módon kapcsolódnak (Cedergren-Zeppezauer et al., 1992) (10.ábra B). 10. ábra A : A β-szálak összerendeződése ideális esetben. B : A β-szálak kapcsolódása dutpázoknál. A homotrimer harmadlagos és negyedleges szerveződése nem választható el, mert az egyik alegység lekvárostekercsének egyik β-szála a szomszédos alegységből származik (11. ábra B). Ez a szerveződés rendkívül nagy stabilitást biztosít a dutpáz trimernek (Vértessy, 2000). A dutpáz centrumának kialakítása tudomásunk (és a kurrens szakirodalom) szerint egyedülálló. A trimer enzimben három szimmetrikusan létrejövő aktív centrum van és mindegyik A B aktív centrum felépítéséhez mind a három alegység és ezen belül is az öt konzervált szekvencia motívumlekvárostekercs hozzájárul (Vértessy, 2000) (11. ábra). szerveződés ideális esetben (A) és dutpázoknál (B) 22

23 N C 11. ábra: A humán dutpáz három alegységes szerkezete (baloldali ábra) és az öt konzervált szekvencia motívum (lila színnel jelölt). A három alegység polipeptidláncát zöld, kék és sárga szalagmodell mutatja. A három aktív centrumba kötődő dutp szubsztrát molekulákat pálcika modell mutatja, az atomok standard szinkódjának felhasználásával (lásd:8.ábra). 23

24 3. A felhasznált módszerek A dutpáz preparálása A dutpázt E-coli dutpáz génjét tartalmazó baktériumokkal termeltetjük (a BL21 plyss E coli baktériumtörzset a pet22b-dut plazmiddal transzformáljuk). A baktéruimtörzs 20%-os glicerin pufferben, folyékony nitrogénben gyorsan lefagyasztva, -80 C-on tárolható, és a sejtek életképesek maradnak. A baktériumsejteket steril tápoldaton szaporítjuk, amely élesztőkivonatot, triptont és ásványi sót tartalmaz (Luria-Bertani tápoldat). A tápoldathoz antibiotikumot is adagolunk (kloramfenikolt és ampicillint), hogy csak azok a sejtek maradjanak életben, amelyek még tartalmazzák a plyss és az általunk bevitt pet22b-dut plazmidot, melyeken antibiotikumrezisztenciát kódoló gének is vannak. A sejtkoncentráció változását bizonyos időközönként vett minták optikai denzitásának spektrofotométeres mérésével követjük. A sejteket logaritmikus növekedési fázisuk elején indukáljuk IPTG-vel (izopropil-tiogalaktozid). Az IPTG a lac promoter ellenőrzése alatt álló T7 DNS-függő RNS polimeráz enzimet kódoló génről, amely a baktériumtörzs kromoszómáján található, megindítja a polimeráz expresszióját. Az így termelődött T7 polimeráz tevékenységét a pet22b-dut plazmidra irányítja egy nagyon erős T7specifikus promóter régió, ami a dutpáz gén előtt helyezkedik el a plazmidon. Így az IPTG hozzáadásával a dutpáz génről történő expressziót tudjuk beindítani. Mintegy négy óra hosszat termeltetjük az enzimet, majd centrifugálás után feltárjuk a sejteket. A feltárás lényege, hogy megbontsuk a sejtfalat, és a plazmában található, oldható fehérjéket főleg a dutpázt sértetlenül oldatba vigyük. A sejtfal megbontásával azonban bizonyos proteázok működésbe lépnek, és kontrollálatlanul rongálják a fehérjéket, ezért szükséges, hogy ezeket hatástalanítsuk, amit a lízis pufferbe adagolt EDTA-val és EGTA-val (amik a metalloproteázokat gátolják), valamint PMSF-fel érünk el (fenil-metil-szulfonil-fluorid, ami a szerin oldallánccal működő enzimeket pl. tripszin, kimotripszin specifikusan gátolja úgy, hogy velük kovalens komplexet képez). Továbbá DTT-t (ditio-treitol) adagolunk még a lízis pufferhez, ami megvédi a szabad SH csoportokat az oxidálódástól úgy, hogy önmaga oxidálódik helyettük. Az utóbbi két anyagot (PMSF, DTT) - lévén bomlékonyak - mindig frissen adjuk a pufferhez. A lízis puffer összetétele: 150 mm NaCl, 50 mm TRIS (ph=8), 1mM EDTA, 2mM DTT, 0,5 mm PMSF. A feltáráshoz a sejteket homogenizáljuk a lízis pufferben, lizozim hozzáadásával a sejtfalat megbontjuk, amit egymás után következő gyors lefagyasztásokkal és 24

25 felolvasztásokkal teszünk teljessé. Ezután centrifugáljuk az elegyet. A felülúszóban található a dutpáz számos más fehérjével együtt. A felülúszót dializáljuk a kromatográfiás elválasztáskor használt A pufferrel (25 mm Na-foszfát (ph=7,5), 1 mm DTT, 0,1 mm PMSF) szemben. 25

26 3. 2. Ioncserés folyadékkromatográfia Ioncserés folyadékkromatográfia során az állófázis felületén állandó értékű töltés van. Attól függően, hogy pozitív vagy negatív töltésű az állófázis anion- vagy kationcserélőről beszélünk. Az ioncserélők váza szerves polimer vagy módosított szilikagél. A ph változtatásával a visszatartást megszabó, döntően molekuláris kölcsönhatásokat megváltoztathatjuk. Nagy ph értéken az ioncserés jelleg és a töltet apoláris része használható fel elválasztásra. Kis ph értéken a szulfonsav csoport H-híd képzésre való hajlama az alkil és fenil rész apoláris jellege használható elemzési feladatokban. Az ioncserés kromatográfiában az eluens puffertartalmú vízsó-szerves oldószerelegy. A puffer ph-val a vegyület disszociációfokát, a sókoncentrációval az ellenion mennyiségét, a szerves oldószerrel a vegyület oldhatóságát tudjuk a mozgófázisban befolyásolni. Ha a szétválasztandó vegyületek tulajdonságainak különbsége túl nagy, akkor egy adott izokratikus rendszerben vagy a nagyobb megoszlási hányadossal jellemzett komponensek nagy retencióval elválnak, vagy ha az eluenserősséget növeljük, akkor a kevésbé visszatartott komponensek interferálnak- romlik a felbontásuk. Ezekre a problémákra megoldás lehet a gradiens elúció alkalmazása. Lényege az, hogy időben eltérő módon változtathatjuk azt a paramétert, amely csökkenti a visszatartást. Szerves vegyület ioncserés elválasztásánál oldószer, só vagy hőmérséklet gradiensről beszélünk. A dutpáz ioncserélő kromatográfiás elválasztását Gradifrac készülékben Q-Sepharose anioncserélő gyantán (Pharmacia Biotech Fast Flow) végeztem. A készülék programozható. Az általam megadható paraméterek: az áramlási sebesség, a gradiens B időtartama és jellege, a frakciók szedése ill. nem szedése, valamint az egyes frakciók szedésének ideje. A műszerbe épített, 280 nm-re beállított spektrofotométer detektálja a rajta átfolyó oldat elnyelését, ami arányos a fehérjekoncentrációval. Ezt a jelet rajzolja ki a rekorder. A fehérjeoldat felvitele előtt az oszlopot a kromatográfiás elválasztáskor is használt A pufferrel mostam át. A puffer összetétele: 25 mm Na - foszfát (ph=7,5), 1 mm DTT, 0,1 mm PMSF. Miután az oszlopot az A pufferrel egyensúlyba hoztam, és felvittem rá a dializált sejtextraktot, először A pufferrel kell mosni, míg az oldatban lévő fehérjék egy része, (amelyek nem tudnak megkötődni a gyantán, mert nincs megfelelő negatív töltésük) kimosódik. Az áteső frakció után 1 ml/min áramlási sebesség mellett 300 ml A és 300 ml B -ből kevert gradiens során eluáltam az oszlopon megkötődő fehérjéket. A gradiens alatt 7 ml-enként frakciókat 26

27 szedtem. B puffer összetétele: 25 mm Na - foszfát (ph=7,5), 1 M NaCl, 1 mm DTT, 0,1 mm PMSF. A növekvő sókoncentráció következtében fokozatosan távoztak a gyantán megkötődött fehérjék. A dutpáz 33, 5% B -nél egy éles és magas csúcsot adott. 27

28 3. 3. Gélelektroforézis A poliakrilamid gél elektroforézis (PAGE; SDS-PAGE) A különböző fehérjék egy adott ph-n meghatározott számú pozitív vagy negatív töltést viselnek. Vizes oldatban egyenáram alá helyezve a molekulákat a töltésüknek megfelelő irányba kezdenek el vándorolni. Az egyes fehérjék eltérő relatív töltésük (egységnyi molekulatömegre eső töltések száma) miatt különböző sebességgel mozognak, amely különbség alapján egymástól elválaszthatók. Fehérjék elektroforetikus elválasztására a leginkább elterjedt, rendkívül hatékony módszer a poliakrilamid gélben végzett elektroforézis, illetve ennek számos változata. Az akrilamid vizes oldatban, megfelelő katalizátorok és iniciátorok jelenlétében gyökös polimerizációra képes, és a reakció során nagymólsúlyú lineáris polimer, ún. poliakrilamid keletkezik. Ha megfelelő keresztkötő ágenst is alkalmazunk, a hosszú poliakrilamid láncok között "hidak" képződnek, és térhálós szerkezetű gél jön létre. Az elektroforézis során a fehérjéket ebben a gélben vándoroltatjuk. A gélben a molekulák méret és alak szerint is elválnak egymástól, a gél mintegy molekulaszűrőként viselkedik. Ezt a molekulaszűrő hatást a gél átlagos pórusmérete szabja meg. Ha az elektroforézist nem denaturáló közegben, alacsony hőmérsékleten végezzük, számos enzim megőrzi natív szerkezetét és így enzimaktivitását, ami alapján ezek a gélben specifikusan kimutathatók. A poliakrilamid gélelektroforézis fehérjék alegységszerkezetének, molekulatömeg-eloszlásuknak vizsgálatára használt változata az SDS-PAGE (sodium-dodecil-szulfátos poliakril-amidgélelektroforézis). Az SDS (sodium-dodecyl-sulphate) egy erősen anionos detergens. Ha a fehérje mintát SDS-el és diszulfid hidakat bontani képes redukálószerrel kezeljük magas hőmérsékleten, radikális konformációváltozások következnek be. A fehérjék közötti kölcsönhatások megszűnnek, az alegység szerkezet felbomlik, és a fehérjék denaturálódnak. Az SDS mintegy "kitekeri" a fehérjéket apoláros részével azok belső, hidrofób magját fellazítva. Az SDS, mivel anionos detergens, a fehérjéket negatív töltésekkel látja el, a fehérje saját töltését maszkírozza. Az SDS fehérjekomplexek töltés/tömeg aránya így állandó érték lesz, függetlenül a fehérje eredeti fajlagos töltéssűrűségétől. A kötődött SDS mennyisége egyenesen arányos a lánc hosszával, vagyis a fehérjék molekulatömegével. 28

29 A poliakrilamid gél úgy készül, hogy az igény szerinti koncentrációjú akrilamid/metilén-biszakrilamid oldathoz megfelelő ph-jú pufferoldatot keverünk, majd a gyökös polimerizációt egy alkalmas katalizátor és iniciátor hozzáadásával indítjuk el. A katalizátor általában peroxidiszulfát, és a leggyakrabban használt iniciátor a tetrametil-etilén-diamin (TEMED). A katalizátor és az iniciátor koncentrációját úgy választjuk meg, hogy a polimerizáció, így a gélesedés perc alatt teljes mértékben végbemenjen. SDS-PAGE esetén két különböző koncentrációjú gélt alkalmaznak. A futtató (más néven szeparáló) gél fölé egy ún. koncentráló gélt polimerizálunk. Ennek akrilamid koncentrációja a futtató gélénél jóval alacsonyabb, olyannyira, hogy itt a molekulaszűrő hatás még nem érvényesül. A kis térfogatú fehérje mintát a koncentráló gél felszínére rétegezzük. Feszültség hatására a fehérje ionok és a tank puffer anionjai belépnek a koncentráló gélbe. A koncentráló gélben a ph között van. Ilyen ph-n a fehérje elektroforetikus mobilitása lecsökken így lokálisan csökken a töltéssel rendelkező molekulák koncentrációja. A fehérjék vékony sávban vándorolnak a futtató gél felszínéig. A futtató, vagy másnéven szeparáló gélben a helyzet megváltozik. Mivel a szeparáló gél phja között van, a mobilitás megnövekedik. Így a töltéshiányból eredő koncentráló hatás megszűnik, a fehérjék a továbbiakban különböző fajlagos töltésük miatt eltérő sebességgel vándorolnak. Ráadásul a futtató gél akrilamid koncentrációját már úgy választjuk meg, hogy a molekulaszűrő hatás is érvényesüljön, és a gél az elválasztani kívánt fehérjék mérettartományában a lehető legnagyobb mértékben szeparáljon. Festési eljárás: A futtatás után a fehérjéket a gélben láthatóvá kell tennünk. Számos olyan vegyület ismert, melyek nagy hatékonysággal kötődnek fehérjékhez. Ezek használatakor célunk az, hogy lehetőleg az összes fehérjét kimutassuk a gélben. Ilyen festékek közül leggyakrabban a Coomassie Brilliant Blue-t használják. Segítségével a gél keresztmetszetétől és az adott fehérje speciális festődési tulajdonságától függően akár már 0.1µg fehérje is jól detektálható. 12%-os poliakril - amid gél készítése: Az elválasztó oldatot (0,05 ml 10%-os SDS, 1,25 ml elválasztó puffer, 1,5 ml 40%-os poliakril - amid, APS, Temed (frissen betöltés előtt adtam hozzá)) két üveglap közé öntöttem álló helyzetben. Miután az elválasztó gél megkötött rárétegeztem a tömörítő gél oldatát ( 0,025 ml 10%-os SDS, 0,625 ml tömörítő puffer, 0,25 ml 40%-os poliakril-amid, APS, Temed). Ebbe fésűt helyeztem, hogy kiképezze a mintafelvitel számára a helyeket a tömörítő gélben. 29

30 Gélelektroforézis: A gél megszilárdulása után a fésűt óvatosan kihúztam, és a gélt a futtatókádba tettem. A futtatókádat feltöltöttem futtatópufferrel. A mintákhoz velük azonos mennyiségű mintakoktélt adtam, forralás után óvatosan bepipettáztam őket a gélen lévő zsebekbe, a puffer alá rétegezve. Bekapcsoltam a tápegységet ügyelve a polaritásra. 200 V-tal 30 percig elektrolizáltam. Ezután a gélt desztillált vízben áztattam, majd Bio-Safe Coomassie-val megfestettem. 30

31 3. 4. Fehérjék tisztítása és elválasztása gélszűréssel Makromolekulák tisztításakor, kihasználva azok eltérő méretét és alakját gyakran alkalmazzuk a gélszűréses kromatográfiát. A molekulaszűrő gél alapanyaga erősen hidrofil, (10-300μm) átmérőjű, oldhatatlan, keresztkötésekkel háromdimenziós hálózattá alakított dextrán poliszacharid. A háló belsejének mérete keresztkötésekkel szabályozható. Így a kromatográfiás oszlopban két folyadéktér alakul ki. Az egyik a gélszemcséken kívüli szabadon mozgó mobil fázis, a másik a gélszemcsék belsejében levő korlátozott mozgású folyadéktér. Ha egy oldat halad keresztül egy ilyen kromatográfiás oszlopon, az oldott molekulák mozgása alapvetően két tényezőtől függ, egyrészt a mozgó folyadékfázis áramlási sebességétől, másrészt a diffúziótól, ami lehetővé teszi, hogy az oldott molekulák, ha méretük engedi átjárják a gélszemcsék belsejét. Így elérhető, hogy a kis molekulájú anyagok számára mind a poliszacharid gél belseje, mind a külső tér elfoglalható. A nagy molekulájú anyagok viszont nem férnek be a gél belső járataiba, a gélszerkezet szűrőként működik, számukra csakis a gélszemcséken kívüli tér járható. A poliszacharid dextránból gyárilag gélszemcséket készítenek (Sephadex, Molselect), melyekből vízben történő duzzasztás után kromatografáló oszlopot készíthetünk. Így alkalmassá válik a rendszer különböző molekulatömegű molekulák elkülönítésére, molekulatömeg szerinti elválasztására. Az elválasztás az oszlopon teljes, az eluátumban külön kapjuk meg a fehérjét és a tőle elkülönített kis molekulájú anyagot. A gélfiltrálás eredményét rendszerint elúciós diagram formájában ábrázoljuk. Ezen az eluálódott anyag koncentrációját ábrázoljuk az eluens térfogatának függvényében. A módszer előnye, hogy gyors, viszont számolni kell a fehérje hígulásával. További előny, hogy a módszer több feladat megoldására is felhasználható: - molekulatömeg becslés, - makromolekulák sómentesítése, - molekulatömeg szerinti elválasztás (polimerek, poliszacharidok, nukleinsavak, fehérjék), - egyensúlyi konstans meghatározás (lassú kémiai reakcióknál). A gélszűrést FPLC-készülékben (Pharmacia) végeztem. Az FPLC technika a hagyományos folyadékkromatográfia és a HPLC között foglal helyet mind műszerezettség tekintetében, mind hatékonyságában. A készülék programozható. Az általam megadott paraméterek az áramlási sebesség (0,6 ml/min), a papírsebesség (0,5 mm/min), valamint a nyomás (1,7 mpa). 31

32 Az elválasztáshoz használt gélszűrő puffer összetétele: 5 mm HEPES (ph=7,5), 150 mm NaCl, 1 mm DTT, 2 mm benzamidin. A DTT-t, PMSF-et, benzamidint frissen kell az oldathoz adni, mivel bomlékonyak. A puffereket használat előtt 0,2 micronos sterilszűrő membránon szűrtem, hogy az esetleges lebegő szennyeződések ne tömjék el a készüléket. Az oszlopot először gélszűrő pufferrel mostam át kb. 1 órán keresztül, majd a koncentrált dutpázból 500μl-t injektáltam az oszlopra. A frakciókat kémcsövekbe szedtem manuálisan. 32

33 3. 5. Fehérjekoncentráció meghatározása Bradford referencia alapján A fehérjék mennyiségi meghatározására leginkább kétféle módszert alkalmaznak: 1. Tiszta fehérje oldatok spektrumából (az elnyelés 280 nm-en történik) az abszorbciós koefficiens ismeretében számolható a fehérjekoncentráció. 2. Fehérje elegyek összfehérje koncentrációját illetve az abszorbciós koefficiens hiányában tiszta fehérje oldat koncentrációját meg lehet határozni többek között a Bradford módszerrel. Az általam alkalmazott módszer színváltozáson alapul. A Bradford reagens Coomassie Brillant festéket tartalmaz, amely a fehérjék peptid kötésével reagálva kék színű terméket hoz létre. Az így kapott vegyület szín intenzitása, abszorbanciája 595 nm-en mérhető. A mérést egyutas spektrofotométerrel végeztem (JASCO V-550 UV/VIS Spektrofotometer). Első lépésként higítási sort készítettem ismert koncentrációjú BSA (marha szérum albumin) oldatból, valamint az ismeretlen koncentrációjú oldatból is, a vak méréshez pedig desztillált vizet használtam. Minden higításhoz és a vakhoz is ¼ térfogatnyi Bradford reagenst adtam, majd Vortex-en összeráztam. A mérés során a műszert minden üres küvettára külön lenulláztam. Minden higításra kiszámoltam a A-t úgy, hogy a mért A-ból levontam a vak oldat abszorbanciáját. Az ismert koncentrációjú BSA oldattal végzett mérések alapján kalibrációs görbét készítettem és meghatároztam a görbe egyenletét (12. ábra). Így az ismeretlen koncentrációjú oldat esetében kapott A-kból számolható a kalibráció során meghatározott egyenlet szerint a higítások koncentrációja. A higításokból visszaszámoltam az eredeti oldat koncentrációját, majd a kapott eredményeket átlagoltam. A / 0,036 = chíg (μg/ml) 33

34 B= / R=0.986 A c / (µ g/ml) 12. ábra: A kalibrációs görbe és egyenlete. 34

35 3. 6. Poliklonális antitest nyúlszérumból történő kinyerése A biospecifikus elválasztási módszerek a biokémia és a molekuláris biológia rendkívül specifikus reakcióin alapszanak. Ismeretes az általában erős antitest-antigén kölcsönhatás illetve más makromolekulák közti kölcsönhatás szigorúan specifikus jellege. Ha ezeket a reakciókat elválasztásra tudjuk alkalmazni, akkor az adott anyagra specifikus módszer van a kezünkben, aminek óriási előnye van egyéb kromatográfiás módszerekkel szemben akkor, ha nagy komplexitású híg oldatokból kell kis mennyiségű anyagot izolálni. Mivel az említett reakcióban résztvevő partnerek affinitásuk alapján kapcsolódnak egymáshoz, elterjedt elnevezés az affinitás kromatográfia. Azonban minden kémiai reakció affinitáson alapszik, tehát helyesebb a biospecifikus elválasztás, illetve a kromatográfia szó használata. Az affinkromatográfia előnyei: - az elválasztás viszonylag gyors, mivel csak kis oszloptérfogat szükséges, - igen nagyfokú specifitás. A biospecifikus reakciók felhasználása elválasztásra, vagy frakcionálásra olyan módon oldható meg legegyszerűbben, ha valamelyik reakciópartnert szilárd hordozóhoz rögzítjük. Így oszlopba töltve a kívánt elválasztás kromatográfiás módszerrel valósítható meg, vagy belekeverve az elválasztandó anyagot tartalmazó oldatba, a kívánt kapcsolódás létrejötte után a szilárd fázis fugálással vagy szűréssel könnyen elválasztható, majd arról az anyag visszanyerhető. A vázanyagnak (hordozónak), amely a ligandot köti fizikailag és kémiailag stabilnak kell lennie a kísérlet körülményei között, megfelelő átfolyási tulajdonságokkal kell rendelkeznie, nem szabad nem-specifikus adszorpciós tulajdonságokkal rendelkeznie, amely zavarja a ligandhoz kötődést. Ilyen célokra kiválóan alkalmas anyagok az agaróz, a cellulóz, ill. a nagy duzzadású dextrán gél. Azon esetekben, amikor enzimfehérje-ligand kötődésénél el akarjuk kerülni a sztérikus gátlásokat, szükséges különböző hoszúságú spacer molekulákat közbeiktatni a poliszacharid váz és a ligand közé. A szervezetbe bejutó antigén anyagokat az ott képződő antitestek specifikus reakciójuk alapján megkötik, semlegesítik. Ez az általában erős antigén-antitest kölcsönhatás alkalmas lehet biospecifikus kinyerésükre is. Ennek megfelelően immunizált állatok vérsavójából az adott antigénre specifikus antitest szintén kinyerhető affinitás kromatográfiás elválasztással. 35

36 Amennyiben pedig a rendelkezésünkre áll specifikus antitest, azt immobilizálhatjuk szilárd hordozón és az így készített immunoaffinitás oszlopon az antigén nagy komplexitású biológiai mintákból is kinyerhető. Az eddig ismertetett izolálási módszerek a fehérje valamely fizikai vagy kémiai tulajdonságán (molekulaméret, töltés, oldékonyság stb.) alapszanak. Az affinitás kromatográfia az a módszer, mely a fehérjék valamilyen biológiai specifitását használja ki. A módszer alapja az, hogy kovalens kötéssel szilárd hordozóhoz kötnek olyan molekulákat, melyekkel az izolálni kívánt fehérje specifikus kölcsönhatásba lép - enzim esetén ez a szubsztrát vagy egy kompetitív inhibitor, receptor esetében pedig az effektor. A szilárd hordozó lehet a gélszűréshez felhasznált bármely oszloptöltet, leggyakrabban a Sepharose gél. Egy immobilizált szubsztrátot tartalmazó oszlopon megfelelő ph-n és ionerőn csak a szubsztrátot felismerő enzim kötődik meg, a többi fehérje az oszlopról lemosható. A ph és az ionerő alkalmas változtatásával, vagy esetleg oldott szubsztrátnak a hozzáadásával az enzim tiszta állapotban eluálható az oszlopról. 36

37 Immobilizálás A jelen munkában először a rekombináns Drosophila dutpázzal immunizált nyúl vérsavójából tisztítottam ki az enzimre specifikus antitestet. Ezután ezt immobilizálva ecetmuslica sejtvonalból izoláltam a dutpáz fiziológiás izoformáit. Rekombináns Drosophila dutpázt immobilizáltam CNBr aktivált Sepharose-on, amely a fehérjét aminocsoportjánál köti meg. A kapcsolás lúgos közegben megy végbe. A kapcsoló puffer összetétele: 5 mm TEA (ph=8,5), 500 mm KCl, 2,5 mm MgCl. Minden műveletet hidegszobában illetve jégen végeztem. 1 mm-os HCl-ban (ph=3) duzzasztottam a gyantát jégben 10 percig, majd HCl-val, utána pedig kapcsoló pufferrel mostam üvegszűrőn. Lecsöpögésnél ellenőriztem a ph-t. Az üvegszűrőről leszedett gyantát 2-2,5 mg/ml koncentrációjú enzimoldatba helyeztem (5 ml oldat/ 1 g gyanta), és éjszakán át rázattam 4 fokon hideg szobában. Ebben a kísérletben a 30 mg/ml-es dutpázt tartalmazó oldatot 12x-esen hígítottam kapcsoló pufferben (tömény oldat hiányában dialízist kell alkalmazni). Miután a dutpáz a gyantára kötődött, a felülúszót leszívtam, 50 ml kapcsoló pufferrel mostam. Ezt követően szükséges az üresen maradt aktív helyeket blokkolni, ezért 1M-os etanolaminban (ph=9) 4 C-on 2 órán át rázattam a gyantát. A rázatás befejeztével leszívtam az etanolamint a gyantáról, majd a kromatográfiás elválasztáshoz használt pufferben mostam. 37

38 Immunoaffinitás kromatográfia A gyanta elkészítése után antitestet pucoltam antiszérumból. 3 ml antiszérumhoz 9 ml TBS/TWEEN puffert, valamint 1mM EDTA-t és 1000x híg proteázgátló mixet (Sigma) adtam, majd az elegybe helyeztem a fent említett módon elkészített gyantát. Az elegyet 25 C-on 2 órán át rázattam. Ezután a gyantás szuszpenziót oszlopba önttem, majd átmostam 5 oszloptérfogatnyi mosó pufferrel, ugyanennyi ph=8 TBS/ TRITON pufferrel valamint ph=9 TBS/TRITON pufferrel. Az egyre lúgosabb közeg azt a célt szolgálta, hogy az esetleg aspecifikusan kitapadó fehérjék folyamatosan eluálódjanak és ne szennyezzék az antitest frakciót. Az eluálás során az oszlopra kitapadt antitestet lemostam erősen lúgos oldattal, és folyamatos keverés mellett kissé savas, erős pufferbe csepegtettem. Az oszlopot 5 oszloptérfogatnyi TEA pufferrel (ph=11,5) mostam. Az áteső elegyet 1M-os TRIS HCl-be (ph=6,7) csepegtettem, ezzel biztosítottam azt a fiziológiás körülményt, amelyben az antitest újra aktív lesz. 1 oszloptérfogatot 0,2 oszloptérfogatnyi TRIS HCl-be csepegtettem, majd kevergetéssel homogenizáltam. Az oszlopot végül 5 oszloptérfogatnyi TSA oldattal mostam. Az oszlopra végül TSA puffert öntöttem, amely nátrium-azidot tartalmaz, melynek baktériumölő hatása révén az oszlopot hosszú ideig tárolni lehet anélkül, hogy a rákötött fehérje degradálódna. A kromatográfia során használt pufferek összetétele: - MOSÓ puffer (0,01 M TRIS HCl(pH=8), 0,14 M NaCl, 0,025% Nátrium-azid, 0,5% TRITON, 0,5% Nátrium-dezoxycholát) - TBS/TRITON (50 mm TRIS HCl (ph=8 és ph=9), 0,1 % TRITON, 0,5 M NaCl) -TRIS HCl (6M, ph=6,7) -TEA (50 mm TEA (ph= 11,5), 0,1 % TRITON, 150 mm NaCl) -TSA puffer (10 mm TRIS HCl (ph=8), 140 mm NaCl, 0,025% Nátrium-azid). 38