A Drosophila melanogaster dutpáz nukleáris lokalizációját irányító, illetve befolyásoló faktorok vizsgálata Diplomamunka

Átírás

1 A Drosophila melanogaster dutpáz nukleáris lokalizációját irányító, illetve befolyásoló faktorok vizsgálata Diplomamunka Írta: Muha Villő biológus Témavezető: Dr. Vértessy Beáta MTA SZBK, Enzimológiai Intézet Belső konzulens: Dr. Nyitray László ELTE TTK Biokémiai Tanszék dutpáz Készült: a Magyar Tudományos Akadémia, Szegedi Biológiai Központ, Enzimológiai Intézetében Budapest, 2005

2 Tartalomjegyzék Köszönetnyilvánítás Rövidítések jegyzéke Összefoglalás Irodalmi áttekintés A dutpáz A dutpáz élettani szerepe A dutpáz potenciális szerepe a gyógyászatban A dutpáz szerkezete dutpáz izoformák Drosophila melanogaster-ben A Drosophila dutpáz szerepe az ecetmuslica fejlődése során Sejtmagi lokalizáció Nukleáris transzportfolyamat áttekintése Nukleáris lokalizációs szignál (NLS) szekvenciák Célkitűzés A kísérlet folyamata Anyagok és módszerek A prm -YFP vektor Drosophila melanogaster S2 (Schneider) sejtvonal A prm-21kda-yfp és prm-23kda-yfp expressziós vektorok klónozása PCR (Polimeráz láncreakció) Kompetens E.coli sejt előállítása és transzformálása Plazmid preparálás QIAGEN Midi Kittel DNS koncentráció mérése Agaróz gélelektroforézis Drosophila S2 (Schneider) sejtvonal fenntartása S2 sejtek transzformálása és szelekciója S2 sejtek vizsgálata konfokális lézer szkenning mikroszkóppal

3 4.12. UV fénnyel előidézett DNS károsodás hatásának vizsgálata S2 sejtek feltárása és sejtextrakt nyerése Drosophila embrió mikroinjektálása Eredmények és értékelésük Drosophila dutpáz gén klónozása prm-yfp vektorba Drosophila dutpáz izoformák lokalizációja S2 sejtekben UV sugárzással előidézett DNS károsodás hatásának vizsgálata Drosophila dutpáz izoformák lokalizációja ecetmuslica embrióban dutpáz NLS szekvenciák különböző organizmusokban Eredmények összefoglalása Irodalomjegyzék

4 Köszönetnyílvánítás Köszönettel tartozom témavezetőmnek, Dr. Vértessy Beátának, aki lehetővé tette számomra, hogy a kutatócsoportjában dolgozhassam, irányított a munkám során, és kedvességével és őszinte lelkesedésével páratlan támogatást nyújtott. Külön köszönet illeti Zagyva Imrét, amiért megosztotta velem asztalát, és megismertetett számos módszer alkalmazásával. Köszönettel tartozom továbbá Dr. Szabad János professzor úrnak, hogy vendégül látott kutatócsoportjában és Venkei Zsoltnak, aki kitartóan segítséget nyújtott az ecetmuslica mikroinjektáláshoz. A konfokális mikroszkópia alapjaival és rejtelmeivel Dr. Homolya László ismertetett meg, türelméért külön köszönettel tartozom. Köszönet illeti továbbá valamennyi kollégámat támogatásukért, hasznos tanácsaikért, és a jó hangulat megteremtéséért, ami gyakran megkönnyítette a felmerülő nehézségek leküzdését. Köszönöm Dr. Friedrich Péter professzor úrnak, az Enzimológiai Intézet igazgatójának, hogy engedélyezte munkámat az intézetben. 4

5 Rövidítések jegyzéke A AP BER C dcmp DHFR DNS dtmp dttp dudp dump dutp dutpáz ER FdUMP G GDP GTP LEF-1 NES NLS NPC NUP PPARα Adenin Abázisos pozíció Bázis kivágó javítás (Base excision repair) Citozin Dezoxi-citozin monofoszfát Dihidro-folát reduktáz Dezoxiribonukleinsav Dezoxi-timidin-monofoszfát Dezoxi-timidin-trifoszfát Dezoxi-uridin-difoszfát Dezoxi-uridin-monofoszfát Dezoxi-uridin-trifoszfát Dezoxi-uridin-trifoszfát nukleotidhidroláz Endoplazmatikus retikulum Fluoro-dezoxiuridin-monofoszfát Guanin Guanozin-difoszfát Guanozin-trifoszfát Limfoid stimuláló faktor 1 (Lymphoid enhancer factor 1) Nukleáris export szignál Nukleáris lokalizácós szignál Nukleáris pórus komplex Nukleoporin Peroxiszóma osztódás aktiválta receptor alfa PPi RanBP3 RanGAP RanGEF (Peroxisome proliferator-activated receptor alpha) Anorganikus pirofoszfát Ran kötő fehérje 3 (Ran binding protein 3) Ran GTPáz aktiváló protein Ran guanozin cserélő faktor RNS snrnp (Ran guanozin exchange faktor) Ribonukleinsav Kis nukleáris ribonukleoprotein TS U (small nuclear ribonucleoprotein) Timidilát szintetáz Uracil DAPI 4 6 Diamidin-2 fenilindol dihidroklorid DEAD Dietil-aminoetil 5

6 DTT Ditio-treitol EDTA Etilén-diamin-N,N,N,,N,,-tetraecetsav LB Luria-Bertani médium OD Optikai denzitás PBS Foszfát és só puffer (Phosphate buffered saline) PCR Polimeráz láncreakció (Polymerase chain reaction) PFA Paraformaldehid SDS Nátrium-dodecil szulfát SFM Szérum mentes tápoldat (Serum free medium) YFP Sárga fluoreszcens protein (Yellow fluorescent protein) 6

7 Összefoglalás A dutpáz enzim egyedülálló módon egyszerre preventív DNS hibajavító funkcióval bír és a nukleotidok bioszintézisében is szerepet játszik. Ecetmuslicában két (23kDa és 21kDa) izoformáját azonosították, melyek eltérő szubcelluláris lokalizációt mutatnak. A 23kDa-os izoforma N terminálisa hordoz egy nem klasszikus nukleáris lokalizációs szignált (NLS), ami a sejtmagi lokalizációért felelős. A 21kDa-os formában egyelőre nem találtak semmilyen lokalizációt befolyásoló szignált, eloszlása elsődlegesen a citoplazmára korlátozódik. A 21kDa-os dutpáz funkciója ismeretlen, eredményeim szerint lehet valami feladata a mitózis során. Dolgozatomban megállapítom, hogy a dutpáz lokalizációját több folyamat befolyásolja. Elsődlegesen a nukleáris lokalizációs szignál megléte vagy hiánya a meghatározó. Mitózis során NLS független mechanizmusok specifikusan irányítják vagy aspecifikusan engedélyezik a dutpáz másik sejttérbe való átjutását. A Drosophila melanogaster dutpáz izoformák lokalizációjának változása szorosan a sejtciklushoz kötött és a sejtmaghártya valamint a nukleáris pórus komplexek (NPC) állapotától függ. 7

8 1.Irodalmi áttekintés 1.1. A dutpáz enzim A dutpáz enzim élettani szerepe A dezoxi-uridin-trifoszfát nukleotidhidroláz (dutpáz) enzim a pirimidin nukleotidok de novo bioszintézisének egyik kulcsfontosságú enzime: a dezoxitimidin-trifoszfát (dttp) kizárólagos (obligát) prekurzorának (dump) szintézisét végzi, azáltal, hogy a dezoxi-uridin-trifoszfát (dutp) foszfátészter-hidrolízisét katalizálja. A reakció során dezoxi-uridin-monofoszfát (dump) és pirofoszfát keletkezik.(1.ábra) dutp dump + PPi + nh+ 1.ábra: dutp hidrolízise dutpáz által katalizált folyamatban A timin de novo bioszintézis másik útvonalán dezoxicitozin-monofoszfát (dcmp) dezaminálása révén keletkezik dump. (2.ábra) A dump-t a timidilát szintetáz (TS) enzim alakítja át a dezoxitimidin-monofoszfáttá (dtmp), amiből két foszfátcsoport hozzáadásával keletkezik a timin (dttp). [1.] A dutpáz működésével szabályozza a dutp/dttp szintet, alacsonyan tartva a dutp koncentrációját. Mivel a nukleotidok megfelelő arányának és koncentrációjának szabályozása elengedhetetlen a DNS replikáció hűségének megőrzéséhez, a dutpáz élettani szerepe nélkülözhetetlen. 8 kiemelkedően fontos és

9 dutpáz 2.ábra: A timin de novo bioszintézis két útja és a szintézisben a dutpáz szerepe. A szintézist szabályozó folyamatokat a (serkentés) és (gátlás) karakterek jelölik. DNS replikáció során a DNS polimeráz nem tud különbséget tenni uracil és timin között, nem érzékeli a két bázis közötti különbséget - a metilcsoport meglétét illetve hiányát - és így adeninnel szemben uracilt is beépíthet az újonnan szintetizálódó DNS láncba. Ez önmagában még nem lenne probléma, de uracil a DNS-ben citozin spontán oxidatív dezaminálódásával is keletkezhet, aminek eredményeképpen guaninnal szemben uracil fog állni. (3.ábra) [2.] Ez a módosulás igen gyakran következik be, egy emlős méretű genomban akár naponta több százszor. 9

10 N H N H C N C C C N O C N C N H H H C C H C N oxidatív dezam inálás C1' H N H C N C C C N H C 1' O O H O uracil c itozin H C1' guanin C H3 H N H C N C1' C C N C N O H H N C C C N C C N H C1' O H adenin tim in (5-m etil-urac il) 3.ábra: Citozin dezaminálása és a bázisok bázispárosodási tulajdonsága Egy ilyen DNS lánc replikációja nyomán keletkező új DNS szál uracillal szemben adenint fog tartalmazni, tehát más információt fog hordozni, mint a templát DNS szál. (4.ábra) Citozinból keletkező uracil a DNS-ben pontmutációk megjelenéséhez vezethet. Uracil épül be timin helyett: UA bázispár Citozinból keletkezik uracil: CG UG bázispár UA Pontmutáció! CG DNS replikáció 4.ábra: Uracilt tartalmazó DNS keletkezésének lehetséges útvonalai A környezetünkben található mutagén ágensek, valamint a sejtben lejátszódó biokémiai reakciók során is keletkező reaktív vegyületek kémiailag módosíthatják a DNS-t. A DNS integritásának megőrzése és a genetikai információ pontos továbbadása a legtöbb szervezet számára kulcsfontosságú, ezért a DNS-ben fellépő károsodások felismerésére és kijavítására számos út létezik a hiba természetétől függően. 10

11 A DNS-ben megjelenő bármilyen eredetű uracilt hibaként észleli egy báziskivágáson alapuló javítómechanizmus (BER). A BER rendkívül hatékonyan eliminálja az uracilt a DNS-ből, megelőzve a genetikai információ pontatlan másolását. A javítás az uracil-dns-glikozidáz aktivitásán alapszik, mely lehasítja az uracilt a DNS cukorfoszfát gerincről. A keletkező abázisos pozícióban (AP hely) az AP endonukleáz elhasítja az 5 foszfodiészter kötést, majd a hiányzó bázisokat a másik szál alapján egy javításért felelős DNS polimeráz építi be. (5.ábra) Hibás bázis DNS glikoziláz AP hely AP endonukleáz DNS polimeráz DNS ligáz 5.ábra: A bázis kivágáson alapuló DNS javító mechanizmus általános sémája dutpáz hiányában a DNS polimeráz újra beépíthet uracilt, és a hibajavító mechanizmus egy hiábavaló ciklusba kerül, a DNS uraciltartalma pedig nem csökken. 11

12 Ha túlságosan sok uracilt tartalmaz a DNS, az a javítómechanizmus túlzott működéséshez és végső soron DNS kettős száltöréshez, és a kromoszómák fragmentálódásához vezet. (6.ábra) [3.] Ezt a jelenséget timinmentes sejthalálnak nevezik, mert kiindulásáért a dttp alkotóelem alacsony szintje a felelős. [4.] [5.] A timinmentes sejthalált egy p53 fehérjétől független apoptotikus útvonalként írták le. [6.] [7.] [8.] A dutpáz enzim hiánya végső soron timinmentes sejthalálhoz, vagyis a sejt pusztulásához vezet. dttp dump A dump-nek, a dttp prekurzorának termelése dutpáz A dutp szint csökkentése dutp Magas sejtbeli dutp/dttp arány DNS polimeráz U U U U U U Uracil (U) szubsztituált DNS BER DNS kettősszál törések Kromoszóma fragmentálódás SEJTHALÁL 12 dutpáz hiánya

13 6.ábra: A dutpáz szerepe a dttp bioszintézisben és a DNS uracilmentességének biztosításában Azáltal, hogy a dutpáz alacsonyan tartja a dutp szintet, megelőzi a hibás DNS szintézisét, tehát preventív hibajavító funkcióval bír. Összegzésként megállapítható, hogy a dutpáz enzim azon kevés fehérjék egyike, mely mind a DNS replikáció hűségének biztosításában, mind a nukleotid bioszintézisében fontos szerepet játszik. 13

14 A dutpáz potenciális szerepe a gyógyászatban A dutpáz enzim esszenciális jelentőségű mind prokarióta, mind eukarióta szervezetek számára, továbbá sok vírus genomja is hordozza a dutpáz gént. Elsősorban aktívan osztódó sejteknek van szüksége dutpázra, pontos, uracilmentes DNS replikációhoz. Nyugvó sejtek dutpáz szükséglete a hibajavítás során végbenő DNS szintézisre korlátozódik. Humán sejtekben a nukleáris dutpáz expressziója sejtciklushoz kötötten szabályozott, a dutpáz csak a sejtciklus S (DNS szintézis) fázisában mutatható ki. A fent említettek miatt a dutpáz gátlása aktívan osztódó sejtekben káros, például tumorsejtekben, mert timinmentes sejthalált indukál. A tumor sejtekben fellépő mutációk közül a p53-at érintők nagyon gyakoriak: a p53 funkció kiesés a tumorok több, mint 50%-ában fordul elő. Ezekben a sejtekben a klasszikus értelemben vett apoptózis nehezen váltható ki. A timinmentes sejthalál egy p53 független apoptotikus út, így a p53 funkciót már elvesztett rákos sejteknél is indukálható. [7.] Ezek alapján egy dutpáz inhibitor ígéretes rákterápiában alkalmazható gyógyszer lenne. [9.] Tumoros sejttenyészetek vizsgálata során kimutatták, hogy a dutpáz expressziója sejtvonalanként nagyon eltérő lehet, így önmagában egy inhibitor csak korlátozott esetben lenne hatékony terápia. [9.] Jelenleg a klinikai alkalmazásban lévő kemoterápiák nagy része a DNS szintézis gátlásán alapszik vagy DNS károsodást okoz, így akadályozza meg a rákos sejtek további osztódását, és idézi elő azok pusztulását. (A daganatos sejtekre jellemző elsősorban a gyors egymást követő osztódási ciklusok.) E drogok egyik családja a timidilát bioszintézis útját gátolja, például antifolátok és fluoropirimidin származékok. A fluoro-dezoxiuridin-monofoszfát (FdUMP) a timidilát szintetázt (TS), míg a methotrexát a dihidro-folát reduktáz (DHFR) enzimet gátolja. (7.ábra) E szerek alkalmazásánál gyakran rezisztencia alakul ki, és a rákos sejt nem reagál többet a kemoterápiára. [10.] [11.] A rezisztencia kialakulásáért gyakran a dutpáz megnövekedett expressziója a felelős, ekkor több dump szintetizálódik a sejtben és a dtmp szintézishez több szubsztrát keletkezik. Ezen tapasztalatok 14

15 alapján dutpáz antagonista alkalmazásával a TS rezisztencia kialakulása elkerülhető lenne. [12.] [13.] 7.ábra: Timidilát metabolizmus gátlásának lehetőségei dutpáz expresszió vizsgálata hasznos információkkal szolgálhat TS inhibitor alapú terápia hatékonyságának jóslásához, mivel azok a tumorok, melyek nem expresszálják a dutpázt, jobban reagálnak ilyen kemoterápiára. [6.] A rákellenes kemoterápiás lehetőségeken túlmenően egy dutpáz inhibitor tervezése és alkalmazása hatékony stratégia lehet sok patogén vírus ellen, melyek kódolják és expresszálják a dutpázt replikációs ciklusuk alatt. Jelenlegi tudásunk szerint elsősorban olyan vírusoknak van szüksége dutpázra, melyek nem aktívan osztódó sejteket fertőznek, például a herpesz vírusok. [14.] Egy új irányzata a dutpáz kutatásnak a paraziták dutpáz enzim fehérjéjét célozza, mely szerkezetileg eltérő a humán dutpáz szerkezetétől, így elméletileg tervezhető hozzá specifikus gátlószer. [15.] Talán egy dutpáz inhibitor lesz a jövő gyógyszere Leishmania major, Trypanosoma cruzi vagy Plasmodium falciparum egysejtű paraziták okozta megbetegedések esetében. [16.] [17.] [18.] 15

16 A dutpáz gátlása többféle módon is megvalósulhat egy terápia során. Direkt módon tervezhető a dutpáz enzimet inaktiváló inhibitor vagy indirekt módon, más, a dutpáz szabályozásában szerepet játszó folyamatokat perturbáló ágens is alkalmazható szer lehetne. Egyik ilyen, a dutpáz szabályozásában szerepet játszó folyamat a dutpáz transzportja a sejtmagba. A dutpáz nukleáris transzportjának gátlása a dutpáz funkció kiesését okozná hasonlóan, mint magának az enzimnek a gátlása. Többek között ezért is érdekes, izgalmas és időszerű kutatási téma a dutpáz lokalizációjának vizsgálata A dutpázok szerkezete dutpáz aktivitással szerkezetileg háromféle fehérjecsoport bír. Elsőként említeném a heterodimer szerkezetűeket, ilyen az egysejtű patogének esetében leírt dutpáz enzim, mely mind szerkezetében, mind szekvenciájában teljesen eltérő a következőkben jellemzésre kerülő EuBaR, valamint a herpesz típusú dutpázok csoportjától. [19.] Az EuBaR dutpázok a legelterjedtebbek, eukarióta, bakteriális és retrovirális enzimek alkotják e csoportot. Annak ellenére, hogy az EuBaR csoporton belül a dutpázok szekvenciája nagyon eltérő lehet - szekvencia egyezés mindössze 31%-os -, feltekeredése (folding) erősen konzervált, retrovírusoktól az emberig homotrimert alkot.(8.ábra) [20.,21.,22.,23.] Az alegységeket aminosav alkotja és öt konzervált motívum jellemzi. Az enzim három egyenértékű és azonos aktív centrumot hordoz, minden egyes aktív centrum felépítésében mindhárom alegységhez tartozó oldalláncok részt vesznek. Az alegységek között létrejövő ilyen magas fokú kooperáció szokatlan a homooligomer fehérjék körében. A C. elegans dutpáza már DNS szinten is homotrimerként kódolt, és így az alegységek között kovalens kapcsolat áll fenn. 16

17 Monomer A Monomer C Monomer B 8.ábra - A dutpáz trimer szerkezete A homotrimer enzim egyes alegységei eltérő színű szalagmodellel ábrázolva. Az aktív helyen kötött ligandumot (dudp) pálcika-modell szemlélteti. Az eukarióta dutpáz esetében poláris és töltéssel rendelkező oldalláncok alakítják ki az alegységek közötti benső központi csatornát, míg a bakteriális és retrovirális dutpáznál leginkább hidrofób kölcsönhatások képezik az összetartó erőt. E megfigyelés alapján a trimer dutpázok családjának két jól elkülöníthető alcsaládja van. [24.] A herpesz típusú dutpázok monomerek. Bennük a konzervált motívumok sorrendje eltérő, mint az EuBaR típusúaknál. [24.] Az enzim fontos kofaktora a Mg++-ion, mely elősegíti a szubsztrát kötődését és a katalízis sebességét maximalizálja. Minden alegység tartalmaz egy Mg++-iont. [25.] [26.] 17

18 dutpáz izoformák Drosophila melanogaster-ben Drosophila melanogasterben két dutpáz izoformát azonosítottak egy 21 és egy 23kDa-ost. A 23kDa-os izoformát csupán egy N-terminális régió különbözteti meg a 21kDa-os izoformától.(9.ábra) A Drosophila genomban egy dutpáz gén található, mely egyetlen egy promóter régió szabályozása alatt áll, míg a humán enzim esetében a két dutpáz izoforma expresszióját két különböző promóter szabályozza. [27.] [28.] Transzkripció során a DNS szálról egy úgynevezett pre-mrns íródik át, mely tartalmazza az intronokat (nem kódoló szakasz) és exonokat (kódoló szakasz) egyaránt. A pre-mrns-bõl kivágódnak az intronok, az exonokból pedig összeszerelődik az érett mrns (RNS splicing), mely jóformán csak fehérjét kódoló szekvenciából áll. A pre-mrns-ből a Drosophila dutpáz esetében kétféle érett mrns transzkript keletkezik, oly módon, hogy a rövid izoformát kódoló RNS-ből hiányzik az első exon. [28.] Az exonok szabályozott kombinálódása révén nyert többféle mrns láncot létrehozó mechanizmust alternatív RNS splicing-nak nevezzük. [29.] 23kDa 21kDa N C dutpáz konzervált mag PAAKKMKID 28as hosszúságú C terminális szegmens Ala/Pro gazdag régió Funkciója egyelőre ismeretlen 9.ábra: Drosophila melanogaster dutpáz két izoformája 18

19 Transzláció után a 23kDa-os izoformáról levágódik az N-terminális kezdő metionin aminosav, ez a poszt-transzlációs módosítás rövidíti a fehérje féléletidejét.(10.ábra) A rövid izoformában lévő kezdő metionin sorsát egyelőre homály fedi. [28.] Mindkét izoforma tartalmaz egy flexibilis C-terminális szakaszt (10.ábra), mely nincs jelen sem a humán, sem az E. coli enzimben. [30.] Feltételezésünk szerint ez a régió valamilyen fehérje-fehérje kölcsönhatásban szerepet játszó kötő felszínt biztosíthat és részt vehet az enzim szabályozásában. A patkány dutpáz egy Nterminális szakaszt tartalmaz, melynek szintén nincs a katalitikus reakcióban szerepe. Ez a szekvencia hordoz egy LXXLL motívumot, mely a kísérletek alapján a PPARα (Peroxiszóma osztódás aktiválta receptor alfa) fehérje kötéséért felelős. [31.] (M)PSTDFADIPAAKKMKIDTCVLRFAKLTENA LEPVRGSAKAAGVDLRSAYDVVVPARGKAIVKT DLQVQVPEGSYGRVAPRSGLAVKNFIDVGAGVV DEDYRGNLGVVLFNHSDVDFEVKHGDRIAQFIC ERIFYPQLVMVDKLEDTERGEAGFGSTGVKDLP AAKAQNGNGEKAAEPEGAAPAPVAT 10.ábra: Drosophila dutpáz szekvenciája Piros: két izoforma kezdő metioninja, aláhúzott: PAAKKMKID szekvencia az NLS, sárga: C terminális lánc A 23kDa-os izoforma tartalmaz egy, a csoportunk által szekvencia homológia kereséssel azonosított nukleáris lokalizációs szignált (NLS), míg a rövid izoformában nem találtunk semmilyen lokalizációt irányító szekvenciát. Ebből a szempontból fontos különbségre derült fény a humán izoformákkal összehasonlítva. Az egyik humán dutpáz izoforma ugyanis mitokondriális lokalizációs szignált tartalmaz és valószínűleg a mitokondriumban zajló DNS replikácó hűségének megőrzéséhez fontos. [32.][33.] Ezzel ellentétben, Drosophilában a mitokondriumban egyik dutpáz izoforma sincs jelen és a 21kDa-os izoforma funkciója egyelőre ismeretlen. A Drosophila enzim 23kDa-os izoforma NLS szekvenciája homológiát mutat más humán fehérjékben kimutatott NLS funkcióval bíró szekvenciákkal. (1.táblázat) [28.] 19

20 Drosophila dutpáz Humán c-myc PAAKKMKID PAAKRVKLD Humán RanBP PPVKRERTS Humán 23kDa SPSKRARPA 1.táblázat: Drosophila dutpáz NLS szekvenciához hasonló NLS-ek A Drosophila melanogaster dutpáz szerepe az ecetmuslica fejlődése során Az ecetmuslica teljes átalakulással (holometamorphosis) fejlődik, vagyis egyedfejlődése során a pete-lárva-báb-imagó stádiumokon megy keresztül. Báb állapot alatt a lárvális szövetek lebomlanak, és az immaginális diszkuszokból fejlődnek ki a felnőtt állat szervei. A lárvális szövetek lebomlása autofágiával és apoptózis útján megy végbe. Hipotézisünk szerint ehhez a folyamathoz a timinmentes sejthalál is hozzájárul, oly módon, hogy nagymértékű DNS degradációt idéz elő. Timinmentes sejthalál beindulásához magas uracil tartalmú DNS szükséges. Ennek az a feltétele, hogy hiányozzon a dutpáz aktivitás a lárva stádiumok alatt dutp épüljön be DNS szintéziskor, és ne legyen jelen aktív uracil-dns glikoziláz ami a hibát kijavíthatná. Az utóbbi feltétel már genomi szinten megvalósul, mivel hasonlóan a többi teljes átalakulással fejlődő rovarhoz, az ecetmuslica genomból is hiányzik ez az enzim. [34.] Hasonló funkciót feltehetőleg egy uracil specifkus endonukleáz láthat el, melynek azonosítása és karakterizálása jelenleg folyik. A dutpáz expressziója fejlődési állapottól függően szabályozott. A petében még jelen van az anyai eredetű enzim, majd a lárva stádiumok során kizárólag az immaginális diszkuszokban mutatható ki a dutpáz, tehát teljesül a timinmentes sejthalál beindulásához szükséges másik előfeltétel is. Báb állapotban a dutpáz expressziója hirtelen megnő, ami összhangban van azzal a ténnyel, hogy báb 20

21 állapotban intenzív sejtosztódások követik egymást, és az imagó légy szöveteinek kialakulásakor a dutpáz fontos a DNS integritásának megőrzéséhez. [28.] Egy dutpáz inhibitort is feltételeznek, mely feltehetőleg a dutpáz fejlődési állapottól függő szabályozásáért felelős. [35.] Felnőtt légyben csak az osztódó szövetekben: ováriumban és immaginális diszkuszokban sikerült kimutatni a dutpázt. A fejlődési stádiumok során a két dutpáz izoforma körülbelül azonos arányban van jelen. [28.] 1.2. Sejtmagi lokalizáció Nukleáris transzportfolyamat áttekintése Eukarióta sejtekben a DNS állomány a sejt egy elkülönült részében (kompartmentumban), a sejtmagban (nucleus) található. A sejtmagban zajlanak le a DNS-hez kapcsolt folyamatok: a DNS replikáció és a transzkripció. Ily módon, ellentétben a prokariótákkal, egy eukarióta sejtben térben és időben jól elkülönülten zajlik le a transzkripció (génátírás/ RNS szintézis) és a transzláció (fehérje szintézis). A fehérjék a citoplazmában szintetizálódnak, de a sejtmagban is rendkívül fontos feladatokat látnak el: génexpresszió, sejt ciklus szabályozása, külső szignálok közvetítése (szignáltranszdukció), valamint osztódás, növekedés és sejthalál. Egy becslés szerint egy eukarióta sejt fehérjéinek körülbelül 17 százaléka a sejtmagban látja el feladatát. [36.] A fehérjék bejutása a sejtmagba a maghártya miatt akadályozott, de egy hatékony transzport-mechanizmus biztosítja az anyagforgalmat. E transzportfolyamat komponensei az evolúció során mind funkció, mind szerkezet szempontjából megőrződtek és a mechanizmus azonos sémát követ. Ez a transzportfolyamat biztosítja nagyon változatos természetű, szerkezetű és méretű molekulák hatékony szállítását. A nukleáris transzportfolyamat juttatja be a sejtmagba a karioplazma strukturális fehérjéit (például hisztonok), a transzkripcióhoz és replikációhoz szükséges fehérjéket (például polimerázok), az RNS splicing-hoz a snrnp-et (kis nukleáris ribonukleoprotein), valamint a DNS javításhoz szükséges fehérjéket és 21

22 mindezen folyamatokat szabályozó fakorokat. Ugyanez a mechanizmus biztosítja az mrns (hírvivő RNS), a trns (transzfer RNS) és a riboszómák exportját a sejtmagból a citoplazmába. A szignál molekulák bejutása a sejtmagba nagyon fontos azért, hogy a sejt transzkripció szinten is tudjon reagálni a belső környezetére, illetve az őt ért külső hatásokra. [37.] A sejtmag kompartmentalizációja lehetővé tette a szabályozás un. szekvesztáló (sequester) módját, aminek alapja, hogy a fehérje lokalizációja szabályozott, és ezáltal korlátozza annak aktivitását. [38.] Eukarióta sejtben a sejtmagot a sejtmaghártya (nuclear envelope) veszi körül. Mitózis alatt a sejtmaghártya lebomlik és alkotóelemei az endoplazmatikus retikulumba (ER) kerülnek. [39.] A sejtmaghártyát (nuclear envelope) egy kettős lipid membrán alkotja, ami folytonos az ER-mal. A nukleáris pórus komplexeknél (NPC) kapcsolódik egymáshoz a sejtmag felőli (inner) és a citoplazma felőli (outer) membrán. A belső membrán alatt a lamina húzódik, mely intermedier filamentumokból áll. A sejtmaghártya alatt a laminát alkotó filamentumok, a NPC-hez kötött fehérjeláncok és a kromatin fehérjéi egy protein hálózatot képeznek. [39.] A sejtmagba csak a NPC-en keresztül juthatnak be hidrofil komponensek, a sejtmaghártya számukra átjárhatatlan. [40.] A NPC csatornaként szolgál, és mindkét irányú transzportnak - sejtmagból a citoplazmába és citoplazmából a sejtmagba - teret biztosít, egy adott pillanatban egy darab NPC-en keresztül is végbemehet akár mindkét irányú transzport folyamat. A NPC-en keresztül lezajló transzport rendkívül hatékony, molekula is átjuthat egyik oldalról a másikra egyetlen egy darab NPC-en keresztül egy másodperc alatt. Az ionok, kisebb molekulák, metabolitok (pl.: nukleotidok), és kis molekulatömegű fehérjék (<40kDa) passzív transzport folyamat során, diffúzióval jutnak el a NPC-en keresztül a megfelelő sejttérbe. 40kDa-nál nagyobb makromolekulák szállításáért aktív, energia befektetést igényélő mechanizmus a felelős. A szállítható molekula méretének a NPC csatornájának átmérője szab határt, melyen 39nm-nél nagyobb átmérőjű makromolekulák nem juthatnak át. 22

23 Ellentétben a mitokondriális és az ER-ba zajló fehérjeimporttal, ahol kitekert (unfolded) preproteinek jutnak át a megfelelő csatornákon, a sejtmagba a fehérjék harmadlagos ill. negyedleges szerkezetüket megőrizve jutnak be, a transzporter fehérjékkel többtagú komplexeket alkotva. A nukleáris pórus komplexek, mint ahogyan azt a nevük is jelzi, hatalmas fehérje komplexek, az őket alkotó proteineket nukleoporinoknak (NUPs) nevezik. A NPC szerkezete konzervált és nagyon hasonló minden eukarióta sejtben, legyen az sörélesztő vagy humán sejt. Emlős rendszerekben a felépítése kissé összetettebb, humán sejtből izolált NPC-et többféle alegység alkotja és finomabb szabályozás jellemzi. Gerinceseknél körülbelül különféle nukleoporinból épül fel és a mérete elérheti a 60 MDa-t. [41.] [42.] Három fő szerkezeti alegység különíthető el: citpolazmatikus fibrilumok, központi mag, és kosár.(11.ábra) A központi csatornát 8 un. küllő építi fel, melyek a citoplazmafelőli és a sejtmagi gyűrűk között húzódnak. Mind a citoplazmába nyúló fibrillumok, mind a sejtmagban lévő kosár dokkoló felszínt biztosít a transzportereknek és a szabályozó elemeknek. [38.] Citoplazmába nyúló filamentumok Külső gyűrű Citoplazma Sejtmag Belső gyűrű Kosár Disztális gyűrű Riboszóma 11.ábra: A NPC szerkezetének sémája (Nature Reviews Cancer 2004 Febr.p106) 23

24 Az aktív transzport-folyamathoz energia és szállítómolekula szükséges. Szállítómolekula feladatát az un. karioferin (karyopherin) transzport receptorok látják el. A karioferineket a szállítás irányától függően exportinnak vagy importinnak is nevezik. [40.] A szállítandó molekula vagy kargó, hordoz egy szignál szekvenciát, ami kijelöli, hogy a kargónak mely sejttérbe kell mennie. A nukleusba való bejutáshoz egy un. nukleáris lokalizációs szignál (NLS), míg a citoplazmába kijutáshoz egy nukleáris export szignál (NES) szükséges. Ezeket a szignálokat ismerik fel a transzport receptorok. Nukleáris import esetében a NLS-t az importin-α ismeri fel és azon keresztül köti a kargót, mintegy adaptorként szolgálva. Az importin-α-hoz kötődik az importinβ, ami a transzport folyamatot közvetíti. A szubsztrátok sokféleségéhez képest a karioferinek száma erősen limitált, tehát annak a néhány féle transzporter szerkezetnek kell rengeteg féle szubsztrát kötését lehetővé tenni. Importin-β-án végzett energy landscape mérések szerint az importin-β-nak az energy landscapeje hepehupás, tehát képes sokféle különböző konformációt felvenni, így különböző ligandokat kötni. [43.] A kargo, az importin-α és az importin-β trimer komplexet alkot, majd a NPC citoplazmába nyúló fibrillumain dokkolódik. A NPC-en való átjutás mechanizmusa nem pontosan ismert, feltehetőleg egy sor asszociációs és disszociációs lépésből áll, ami a nukleoporinok és a transzport komplex között történik meg. A nukleoporinok felszínén lévő FXFG vagy GLFG motívum ismétlődései vesznek részt a transzport receptor kötésében és ezeken a karioferinek úgymond átlépkednek a membrán másik oldalára. [38.] Ez a mechanizmus feltételezi, hogy a nukleoporinok és egyúttal a NPC szerkezete dinamikusan változhat, és flexibilis kötőfelszínt biztosít. [44.] Ezt támasztja alá az a tény is, hogy több mint 20 karioferin ismert emlős sejtben, melyek mind ugyanazon a NPC-en keresztül közlekednek. [37.] 24

25 A sejtmagban a transzport komplex szétdisszocál a RanGTP - importin-β kötés hatására, majd a RanGTP-importin-β komplex reciklizálódik a citoplazmába. Az imporin-α t annak a saját export receptora, a CAS szállítja vissza.(12.ábra) [38.] A Ran egy Ras fehérjecsaládba tartozó, kis molekulatömegű G fehérje (GTPáz aktivitása van), mely két eltérő konformációban van jelen a sejtmaghártya két oldalán attól függően, hogy GTP-t vagy GDP-t köt. [45.] RanGTP elsősorban a sejtmagban van jelen, és a citoplazmából bejutott transzport komplex disszociációját okozza. A sejtmagból történő export folyamatnál szerepe épp ellenkező, a transzport komplex összeépüléséhez szükséges. Az exportált komplex disszociációját a citoplazmában egy RanGAP (Ran GTPáz aktiváló protein) okozza, mely aktiválja a Ran fehérje GTPáz aktivitását, és a Ran fehérje GDP kötött állapotba kerül, ami kisebb affinitással kötődik már az exportin (CRM1)-kargó komplexhez. A RanGDP visszakerül a sejtmagba, ahol egy RanGEF (Ran guanozin cserélő faktor) kicseréli a GDP-t GTP-re. A folyamat eredménye, hogy a RanGTP a sejtmagban, a RanGDP a citoplazmában lokalizálódik. (12.ábra) A RanGTP/RanGDP eltérő lokalizációja hajtja a nukleáris transzport folyamatokat, azáltal hogy a transzport receptor-kargó komplexek asszociációját és disszociációját okozza a megfelelő kompartmentumban. [40.] A Ran közvetítette transzport aktív folyamat, GTP hidrolízisével, tehát energia befektetéssel jár. Az előbbiekben vázolt nukleáris transzportmechanizmus a valóságban lejátszódó folyamat egy egyszerűsített modellje, melyhez más, szabályozó rendszerek kapcsolódnak. Jól ismert tény, hogy a kargo foszforiláltságától függ annak lokalizációja. Egy kevésbé széles körben elterjedt eredmény szerint a szállítandó fehérjéhez kapcsolt N-acetilglükózamin (O-GlcNAc) csoport megléte vagy hiánya is a nukleáris lokalizációt befolyásoló tényező. [46.] A transzportfolyamatban részt vevő komponensek szerepköre egyre bővül, és nem kizárólagosan a transzportra korlátozódik. A RanGTP nélkülözhetetlen a NPC összeszerelődéséhez, és imporin-β szükséges a sejtmaghártya felépüléséhez. [47.] 25

26 RanGDP NLS protein NES protein CRM1 α β Ran GAP Citoplazma NPC Sejtmag RanGTP NLS protein NES RanGTP protein β CRM1 α 12.ábra: Nukleáris transzportfolyamatok egyszerűsített sémája. Import receptorok: α = importin-α, β= importin-β; Export receptor: CRM1 Egy fehérje nukleáris transzportjának felderítése több szempontból is érdekes lehet, fontos információkkal szolgálhat a fehérje szabályozásának megértéséhez, a kölcsönható partnerek megismeréséhez. Ezen alapkutatásból származó eredmények rengeteg ötletet adhatnak vírusok elleni vagy rákterápiát célzó gyógyszerkutatásnak. A sejtmagba való célzott bejuttatása a drognak növelheti annak hatékonyságát és specificitását Nukleáris lokalizációs szignál szekvenciák (NLS) Eukarióta sejtben többféle sejtorganellum térben szeparáltan van jelen a citoplazmától, a fehérjeszintézis helyétől. Mindegyiknek azonban van megfelelő transzport mechanizmusa, amivel hozzájut a szükséges komponensekhez. A proteinek esetében, a fehérjének tartalmaznia kell egy szignál szekvenciát, ami a megfelelő organellumhoz irányítja és engedélyezi a bejutást. Ilyen például az ER fehérjéinek a retenciós KDEL szignálja is. 26

27 A sejtmagba való bejutáshoz egy NLS (nukleáris lokalizációs szignál), kijutáshoz egy NES (nukleáris export szignál) szükséges. Azok a fehérjék, melyek hordozzák mind a két típusú szignált, képesek a citoplazma és a sejtmag között ingázni. A NLS-ek egy-egy rövid, néhány aminosavból álló szekvenciák, melyek egy sor bázikus aminosavból állnak, elsősorban lizinből néhány argininnel tarkítva. A klasszikus NLS-ek egy 9 aminosav hosszúságú szignálban legalább 5 bázikus aminosavat tartalmaznak. Ilyen például a SV40 vírus nagy T antigénjének vagy a LEF-1 (limfoid stimuláló faktor 1) fehérjének a NLS-e. [48.] Gyakori, hogy ezek a szignálok tartalmaznak még egy prolint is, ami úgyszintén fontos a felismeréséhez. A szignál lehet egytagú (monopartite) vagy kéttagú (bipartite), ahol a két szignál szekvencia közé néhány aminosavnyi (kb. 10) szakasz ékelődik. A NLS a fehérje felszínére esik, biztosítva annak hozzáférhetőségét és egyszerű felismerését. Az utóbbi években azonosítottak több olyan NLS-t melyek kissé eltérnek a klasszikus NLS-ektől. Ilyen a c-myc humán onkoprotein szignálja is, mely csak három bázikus aminosavat tartalmaz és funkciójához egy savas karakterű aszparaginsav is nélülözhetetlen. A c-myc NLS-ának vizsgálata bebizonyította, hogy nem csak a megfelelő karakterű aminosavak megléte, hanem azok egymáshoz viszonyított helyzete is fontos. [49.] A c-myc NLS-éhez hasonló szignál szekvenciát hordoznak a RanBP3 (Ran Binding Protein 3), a humán és a Drosophila dutpáz nukleáris izoformái is. A RanBP3 NLS-ének felismeréséért az importin-α3 a felelős. [50.] Feltételezhető, hogy a c-myc típusú nukleáris lokalizációs szignált tartalmazó fehérjék ugyanúgy transzportálódnak, mint a klasszikus NLS-t hordozó fehérjék, csak más importin izoforma ismeri fel őket. 27

28 SV40 T-ag LEF-1 Nucleoplasmin c-erb-a c-myc c-myb p53 N-myc RanBP3 Humán dutpáz-n Drosophila dutpáz PKKKRKV KKKKRKREK KRPAATKKAGQAKKKK SKRVAKRKL PAAKRVKLD PLLKKIKQ PQPKKKP PPQKKIKS PPVKRERTS SPSKRARPA PAAKKMKID 2.táblázat: Különböző típusú nukleáris lokalizációs szignál szekvenciák: a klasszikus NLS szekvenciákat a táblázat első négy sora tartalmazza, a többi felsorolt NLS az un. nem-klasszikus típusú NLS csoportba tartozik. (A bázikus aminosavakat félkövér betűtípus, a fontos prolinokat aláhúzás jelöli.) [33, 49, 50, 51.] Az irodalomban még egy teljesen eltérő típusú NLS-t említenek, melynek jellemzője egy glicin-gazdag régió. [36.] 28

29 2. Célkitűzés Kísérleteim célja a Drosophila melanogaster dutpáz izoformák szubcelluláris lokalizációjának vizsgálata volt, melynek során az alábbi kérdésekre kerestem a választ: A két dutpáz izoforma lokalizációjában milyen különbségek mutatkoznak? Más NLS-okkal homológiát mutató PAAKKMKID szekvencia valóban NLS funkcióval bír-e? Mesterségesen előidézett DNS károsodás hatására változik-e a dutpáz lokalizációja? Változik-e a dutpáz lokalizációja a sejtciklus során? Milyen más faktorok és mechanizmusok szabályozzák a dutpáz szubcelluláris eloszlását? 21kDa-os dutpáz izoformának mely folyamatokban lehet szerepe? Hasonló NLS található-e más élőlények dutpázában? 29

30 3. A kísérlet folyamata A vizsgálatokat Drosophila Schneider Line 2 sejtvonalon és Drosophila embriókon végeztem. Az enzim lokalizációját fluoreszcens proteinnel jelölt dutpáz vizsgálatával követtem nyomon. A két izoforma összehasonlítása céljából két YFP (sárga fluoreszcens protein) fúziós dutpázt kódoló plazmidot hoztam létre, amikkel külön-külön S2 sejteket transzformáltam. Puromicines szelekcióval stabil expressziós sejtvonalakat sikerült előállítani. A sejteket fluoreszcens mikroszkóppal vizsgáltam. DNS károsodást UV besugárzással idéztem elő. Másik kísérleti objektumként Drosophila embriót (4. stádiumban lévő) választottam, ahol a két izoforma eltérő viselkedését a sejtciklus különböző fázisaiban követtem nyomon. A YFP-dUTPázt expresszáló sejtvonalból nyert sejtextraktot mikroinjektáltam Drosophila embrióba, és in vivo fluoreszcens mikroszkóppal a két izoforma mozgását vizsgáltam. A kísérlet lépéseit a 13. ábra foglalja össze. 30

31 dutpázt kódoló DNS szakasz felszaporítása LD plazmidról PCR-rel prm-yfp vektor tisztítása XL1Blue E.coli sejtből Fragmens hasítása restrikciós enzimekkel: NotI és NheI prm-yfp vektor hasítása restrikciós enzimekkel: NotI és NheI Megfelelő fragmens tisztítása agaróz gélből Két fragmens ligálása XL1Blue E.coli transzformálása prm-21kda-yfp és prm-23kda-yfp plazmidok tisztítása S2 sejtek transzformálása és szelekciója S2 sejtek feltárása és sejtextrakt nyerése UV besugárzással DNS károsodás előidézése S2 sejtek vizsgálata konfokális lézer szkenning mikroszkóppal Drosophila embrió mikroinjektálása 31 dutpáz lokalizációjának vizsglata in vivo sejtmagosztódások alatt

32 prm-yfp vektor tisztítása XL1Blue E.coli sejtből Fragmens hasítása restrikciós enzimekkel: NotI és NheI prm-yfp vektor hasítása restrikciós enzimekkel: NotI és NheI Megfelelő fragmens tisztítása agaróz gélből Két fragmens ligálása XL1Blue E.coli transzformálása prm-21kda-yfp és prm-23kda-yfp plazmidok tisztítása S2 sejtek transzformálása és szelekciója S2 sejtek feltárása és sejtextrakt nyerése UV besugárzással DNS károsodás előidézése S2 sejtek vizsgálata konfokális lézer szkenning mikroszkóppal Drosophila embrió mikroinjektálása dutpáz lokalizációjának vizsglata in vivo sejtmagosztódások alatt 13.ábra: dutpáz lokalizációjának vizsgálata során elvégzett munka folyamata 32

33 4. Anyagok és módszerek 4.1. A prm -YFP vektor A prm-yfp egy Drosophila specifikus expressziós vektor, melynek mérete 4624bp. (14.ábra) (metallotioneinek: Hordoz egy nehézfémek ecetmuslica detoxikálásában metallothionein játszanak promótert szerepet), ami nehézfémmel (például: CuSO4) indukálható. Ampicilin rezisztencia gén biztosítja a prm-yfp plazmiddal transzformált E.coli sejtek szelekcióját. A klónozó helyet egy YFP-t (sárga fluoreszcens protein) kódoló szekvencia követi, így a vektor alkalmas YFP fúziós fehérje expresszálására. Klónozó hely NotI NheI YFP Metallothionein promóter prm-yfp 4624bp Ampicilin rezisztencia 14.ábra: prm-yfp plazmid sematikus felépítése 4.2. Drosophila melanogaster S2 (Schneider) sejtvonal Az S2 sejtvonalat I. Schneider 1972-ben izolálta kései (20-24órás) Drosophila embrióból. A sejtvonalat többféle sejt keveréke alkotja, makrofág és epithél szerű sejtekből áll, melyek szemi-adherens kultúrát képeznek. Az S2 törzset elterjedten használják a Drosophila kutatásban mint sejtes modellrendszert. 33

34 4.3. A prm-21kda-yfp és prm-23kda-yfp eszpressziós vektorok klónozása A külön-külön a 21kDa, illetve a 23kDa dutpáz izoformát kódoló DNS darabot prm-yfp vektorba klónoztam. A megfelelő dutpáz génszakaszt PCR-rel szaporítottam fel az LD plazmidról, ami tartalmazta a teljes Drosophila dutpáz gén cdns-ét. A primerek NheI (5 primer) illetve NotI (3 primer) restrikciós enzimek hasítóhelyeit tartalmazták. A 3 primer nem tartalmazta a gén STOP kodonját, így a YFP-t kódoló szakasza a plazmidnak is átíródott. A PCR fragmens, illetve a prm-yfp vektor NotI és NheI enzimekkel való emésztését követően a ragadós végekkel rendelkező DNS fragmentumokat T4 DNS ligázzal (New England BioLabs) összeligáltam. A kész plazmidot XL1Blue kompetens sejtbe transzformáltam, felszaporítottam és onnan tisztítottam. A kész plazmidokat (prm-23kda-yfp és prm-21kda-yfp) szekvenálással (MWG) ellenőriztem PCR (Polymerase chain reaction) A PCR módszert DNS szakaszok amplifikálására használják. A PCR reakció egy ciklusa 3 lépésből áll: DNS szál denaturálása (94 C) - DNS két külön szálra válik szét Hibridizáció a primerek hozzátapadnak az egyszálú DNS lánchoz Elongáció (72 C) - a polimeráz a primertől elindulva szintetizálja a templát DNS szál alapján a másik szálat A ciklust szor ismételjük, ami alatt a kívánt DNS szakasz mennyisége a ciklusok számával exponenciálisan emelkedik. A ciklusok számának további emelése nem vezet lényeges kópiaszám emelkedéshez, mivel a DNS polimeráz enzim aktivitása a ciklusok során lecsökken. Klónozáshoz PfuTurbo DNS polimerázt (Stratagene) használtam, ami egy hibajavító 3-5 exonukleáz aktivitással is rendelkező enzim. 34

35 Külön-külön a 21kDa és a 23kDa dutpázt kódoló szakasz felszaporításához az alábbi primereket terveztem (15.ábra): 5 primer (forward) NheI 21kDa: 5 CTAG CTAGCATGAAGATCGACACGTGCGTCCTGCG3 NheI 23kDa: 5 CTAG CTAGCATGCCATCAACCGATTTCGCCGAC3 NotI 3 primer (reverz): 5 ATAGTTTAGC GGCCGCGTAGCAACAGGAGCCGGAGC3 15.ábra: A felhasznált primerek szekvenciája. A beépített hasítóhelyeket és a restrikciós endonukleázok felismerőhelyeit piros szín jelzi. A PCR reakció az alábbi program szerint zajlott (3.táblázat): 94 C 2perc 62 C 1perc 1 72 C 1perc 94 C 15mp 62 C 30mp C 1perc 72 C 10perc 1 3.Táblázat: dutpáz cdns felszaporítására használt PCR program 4.5. Kompetens E.coli sejt előállítása és transzformálása E.coli XL1Blue törzsből előkultúrát 12,5 µg/ml tetraciklint tartalmazó 5 ml LB tápoldatban (1000 ml desztilált víz, 10 g tripton, 5 g élesztő kivonat, 10 g NaCl, ph 7.0) egy éjszakán át 37 C-on rázatóban növesztjük, majd másnap 50 ml LB-be abból 1 ml átoltunk, és addig növesztjük, míg a sejtek el nem érnek a logaritmikus növekedési fázisba. Ez fotometria alkalmazásával ellenőrizhető, a sejtszuszpenzió OD (optikai denzitás) értékének közé kell esnie. A sejteket lefugáljuk (3600 rpm, 4 C, 20 perc), majd a sejtcsapadékot 5 ml 0.1 M MgCl 2-oldatban felszuszpendáljuk, és jégen inkubáljuk 20 percig. A következő lépésben újra lefugáljuk (3600 rpm, 4 C, 20 perc), ezután a sejtcsapadékhoz 1 ml 0.1 M CaCl 2oldatot adunk és jégen inkubáljuk további 20 percig. 35

36 Az így nyert kompetens sejt 150 µl-ét transzformáljuk 1-10 µl plazmiddal. A sejteket hősokkoljuk (30 perc jégen, 90 másodperc 42 C-on, 2 perc jégen), majd 150 µl LB hozzáadása után 1 órán át 37 C-on rázatjuk. A sejteket a megfelelő antibiotikumokat (12,5 µg/ml tetraciklin µg/ml ampicilin) tartalmazó táplemezre szélesztjük. Éjszkán át 37 C-os termosztátban növesztjük Plazmid preparálás QIAGEN Midi Kittel A munkához szükséges plazmidokat QIAGEN Midi Kittel preparáltam. A kit tartalmaz egy anion-cserélő oszlopot, mely a tisztítási eljárás alapját képezi. Az anion-cserélő oszlop töltete pozitív töltésű és a felvitt oldatból a negatív töltésű ionokat (anionokat) és molekulákat köti. Az itt alkalmazott oszlop töltete dietil-aminoetil (DEAE) csoportokkal fedett, amihez a DNS lánc negatív töltésű foszfát csoportjai kötődnek. A mintát alacsony ph-án és sókoncentráció mellett visszük fel az oszlopra, ekkor a negatív töltéssel rendelkező komponenseket kiköti. Az RNS, a proteinek és alacsony molekulatömegű egyéb szennyeződések az oszlopról egy közepes ionerősségű mosással eltávolíthatóak, és a plazmid DNS szelektíven magas sókoncentrációjú pufferrel lemosható. A plazmid tisztítás lépései a következők: a baktérium tenyészet növesztése a baktérium sejtek összegyűjtése és alkalikus lízise a plazmid DNS tisztítása 1. Transzformált (a kívánt plazmidot hordozó) XL1Blue E.coli sejteket 50 ml LB tápoldatban tetraciklin (12,5 µg/ml) és ebben az esetben ampicilines (167µg/ml) szelekció mellett egy éjszakán át 37 C-on rázatóban növesztjük. 2. A sejteket lefugáljuk (18000 rpm, 4 C, 20 perc) 36

37 3. A sejteket 4ml P1 pufferben (50 mm Tris Cl, ph 8.0; 10 mm EDTA;100µg/ml RNáz A) felszuszpendáljuk. Az oldatban található EDTA a Mg2+ ionok komplexbe vitelével a sejt nukleáz enzimeinek aktivitását gátolja, az RNáz A az RNS-eket bonja ml P2 puffert (200 mm NaOH, 1% SDS) adunk a sejtekhez. Az SDS a membránok lipid szerkezetének dezintegrálásával idézi elő a sejtek lízisét ml jéghideg P3 puffert (3.0 M kálium acetát, ph 5.5) hozzámérésével az oldatban szolubilizált fehérjék, membrán törmelékek, a hozzájuk kapcsolódó genomiális DNS-sel együtt kicsapódnak. A dodecilszulfát kálium sója is oldhatatlan, így az is a csapadékba kerül. 6. Lecentrifugáljuk (18000 rpm, 4 C, 20 perc) a kicsapott anyagokat. 7. Az oszlopot 5ml QBT pufferrel (750 mm NaCl; 50 mm MOPS, ph 7.0; 15% izopropanol; 0.15% Triton X-100) egyensúlyba hozzuk. Az ioncserélő oszlop töltött csoportjaihoz ebben a fázisban könnyen kicserélhető egyszerű ionok (klorid) kapcsolódnak. 8. A tiszta felülúszót, ami tartalmazza a plazmid DNS-t is, az oszlopra visszük, ahová az reverzibilisen köt. 9. Az oszlopról közepes ionerővel és semleges ph-n lemossuk a szennyeződéseket 2 10 ml QC pufferrel (1.0 M NaCl; 50 mm MOPS, ph 7.0; 15% izopropanol) 10. A plazmid DNS-t nagy ionerővel és enyhén lúgos 5 ml QF pufferrel (1.25 M NaCl; 50 mm Tris Cl, ph 8.5;15% izopropanol) eluáljuk. 11. A DNS-t izopropanollal kicsapjuk. 12. A csapadékot lecentrifugáljuk (13400 rpm, 15 perc, 4 C) 13. A DNS csapadékot mossuk 70%-os etanollal 14. A csapadékot lecentrifugáljuk (13400 rpm, 15 perc, 4 C) 15. A DNS csapadékot szárítjuk fülke alatt letakarva egy éjszakán át. 16. A csapadékot 50µl TE (10 mm Tris Cl, ph 8.0; 1 mm EDTA) pufferben feloldjuk és összemossuk 17. A minta DNS koncentrációját fotométerrel megmérjük, a plazmid tisztasága agaróz gélelktroforézissel ellenőrizhető. 37

38 Ezzel a módszerrel 50 µl 0,3-3 mg/ml koncentrációjú DNS izolálható DNS koncentráció mérése A DNS koncentrációját fotometriával a minta nm közti spektrumát felvéve határozzuk meg. A mérést kvarc küvettában végezzük, 600 µl térfogatra hígítunk 1-5 µl mintát. A spektrumról leolvassuk a 260, 280, 350 nm-en mért értékeket. 260 nm-en a nukleinsavaknak, 280 nm-en a fehérjéknek (aromás aminosavaknak) van elnyelési maximumuk, 350 nm-en mért abszorbancia érték az alapvonal. A 280 nm-en mért érték a minta fehérjékkel való szennyezettségére utal. A Lambert-Beer-törvény szerint a minta DNS koncentrációja egyenesen arányos a mért abszorbancia értékkel. Tapasztalati úton meghatározták, hogy ha A260=1, akkor a [dsdns]=50 µg/ml. A két összefüggésből kiszámítható a dsdns (kettős szálú DNS) koncentrációja Agaróz gélelektroforézis Elektromos erőtér alkalmazásával a nukleinsavakat (DNS és RNS) vándorlásra késztetjük, az egyes nukleinsavak eltérő töltésük miatt különböző sebességgel mozognak, így ezen különbség alapján egymástól elválaszthatók. A nukleinsavak töltése arányos a tömegükkel és a hosszúságukkal, tehát a módszer tömeg szerinti elválasztásra is alkalmazható. A futás sebességét a nukleinsavak másodlagos szerkezete befolyásolja, azonos tömegű helikális és lineáris nukleinsav molekulák különböző sebességgel futnak. Nukleinsavak elektroforézisét agaróz gélben végezzük, az elválasztani kívánt nukleinsav méretétől függ a gél agaróz koncentrációja. Általában 0,75%-os agaróz gélt használnak, de 1kb-nál kisebb fragmensek elválasztására töményebb, 1-2%-os gél alkalmazása ajánlott. A nukleinsavakat etídium-bromiddal mutatjuk ki. Az etídium-bromid, ha DNShez kötődik UV fény hatására fluoreszkál. Az etídium-bromidot a gél mátrix tartalmazza. A DNS futtatás lépései a következők: Agaróz gél öntése 38

39 Elektroforézis Detektálás %-os agaróz gélhez 22 ml TAE (0.04 M Trisz-acetát, M EDTA; ph 8.0) pufferben feloldunk 0.15 g agarózt. Az elegyet mikrohullámú sütőben felforraljuk C hőmérsékletű oldatot a tartályba öntjük. 3. Kesztyűt húzunk! µl 0.008% etídium-bromidot adunk hozzá, a tartályt billentgetve alaposan elkeverjük. A fésűt behelyezzük. 5. Kb. 10 perc alatt bepolimerizálódik az agaróz 6. A gélt a tartállyal együtt behelyezzük a futtató kádba, amit feltöltünk TAE pufferrel. 7. A mintákat (1 µl Loading Dye (Fermentas) + 5 µl minta) és 5 µl 1 kb GeneRuler DNS markert (Fermentas) betöltjük a zsebekbe V-on végezzük az elektroforézist, kb. 30 percig. 9. A gélképet UV fénynél transzilluminátorral rögzítjük. 4.9 Drosophila S2 (Schneider) sejtvonal fenntartása Az S2 sejteket Drosophila SFM (Serum Free Medium - Gibco) tápoldatban tartjuk fenn, ami tartalmaz még 8mM L- glutamint és 10Unit/ml penicillin, illetve 0.1mg/ ml streptomicin (Sigma) antibiotikumokat. A sejteket 25 C-on növesztjük. A médiumot 4 naponta cseréljük, és hetente a médium 5 ml-ébe 1 ml S2-t oltunk át. Az átoltást mindig steril körülmények között végezzük S2 sejtek transzformálása és szelekciója S2 sejtet/lyuk, 24 lyukú sejttenyésztő tálcán egy éjszakán át növesztjük, 30-50%-os konfluencia eléréséig. A sejteket 0.5 µg tisztított plazmiddal 5 µl Cellfectin (Invitrogen) lipid alapú reagens jelenlétében transzformáljuk, 100 µl Opti-MEM (Gibco) médiumban. A Cellfectin reagens komplexet képez a plazmid DNS molekulákkal és képes átjutni a sejtmembránon. 39