A humán Rad51 rekombináz nukleoprotein szálak felépülése és lebomlása

Átírás

1 A humán Rad51 rekombináz nukleoprotein szálak felépülése és lebomlása Diplomamunka Biológus mesterszak Molekuláris, Immun, - és Mikrobiológia szakirány Készítette: MOLNÁR ESZTER Témavezető: DR. KOVÁCS MIHÁLY, D.Sc. habilitált tudományos főmunkatárs ELTE Biokémiai Tanszék EÖTVÖS LÓRÁND TUDOMÁNYEGYETEM TERMÉSZETTUDOMÁNYI KAR BIOLÓGIAI INTÉZET Budapest, 2012

2 Tartalomjegyzék Tartalomjegyzék Rövidítésjegyzék Bevezetés Irodalmi háttér A hrad51 szerepe a HR-en alapuló DNS-hibajavításban A hrad51 mint rákellenes gyógyszer-célpont A hrad51 nukleoprotein szál A hrad51 nukleoprotein szál szabályozása A hrad51 nukleoprotein szálak felépülése A szálkicserélés és a homológia-keresés mechanizmusa A hrad51 nukleoprotein szálak lebomlása Célkitűzés Anyagok és módszerek A vad típusú hrad51 fehérjét kódoló plazmid létrehozása A hrad51 fehérje termeltetése E. coli expressziós rendszerben A hrad51 fehérje tisztítása ioncserés kromatográfiával Gyorskinetikai kísérletek Eredmények és megbeszélésük A hrad51 fehérje tisztítása ioncserés kromatográfiával A hrad51 ssdns kötésének követése Cy3 fluoreszens jelölés segítségével A hrad51 filamentum felépülése különböző nukleotid állapotokban 24 s-os időskálán vizsgálva Az aktív helyén nukleotidot nem tartalmazó (apo állapotú) hrad51 ssdns-en való filamentum képzése A hrad51 ssdns-en való filamentum képzése ATP-ben A hrad51 ssdns-en való filamentum képzése ADP-ben

3 A hrad51 ssdns-en való filamentum képzése AMPPNP-ben A fluoreszcencia változás a hrad51 koncentráció függvényében Hill-illesztés A hrad51 filamentum felépülésének vizsgálata különböző nukleotid állapotokban, 3 jelölt ssdns-en 1000 s-os időskálán vizsgálva A hrad51 filamentum lebomlásának követése Cy3 fluoreszcens jelölés segítségével Következtetések Összefoglalás Summary Köszönetmondás Hivatkozások

4 1. Rövidítésjegyzék Rövidítés Magyarázat ADP Adenozin-difoszfát AMPPNP Adenilil-imidodifoszfát ATM Ataxia Telangiectasia mutáns kináz ATP Adenozin-trifoszfát ATPγS Adenozin 5'-O- (3-tio) trifoszfát BER Bázis kivágó javítás (base excision reapir) BIR Törés indukálta replikáció (break-induced replication) BLM Bloom-szindróma helikáz BM Szálvándorlás (branch migration) BRCA2 Breast Cancer susceptibility protein 2 Cy3 Indokarbocianin CDK Ciklin-dependens kináz CK2 Kazein kináz 2 D-hurok Displacement hurok dsdns Duplaszálú (double-stranded) DNS DSB Duplaszálú DNS-törés (double-strand break) DSBR Duplaszálú DNS-törés javítás (double-strand break repair) DTT Ditiotreitol EDTA Etilén-diamin-tetraecetsav HhH Helix-hairpin (hajtű) -helix HJ Holliday kereszt (Holliday junction) HR Homológ rekombináció hrad51 humán Rad51 IC Inhibítor koncentráció 3

5 ICL IPTG JM K 2 HPO 4 k cat KH 2 PO 4 mt MRN-komplex NBP NER NHEJ PI-mix PLK-1 RecA ROS RPA SDS SDSA ssdns SSB yrad51 Szálak közötti kovalens keresztkötés (interstrand cross-link) Izopropil β-d-1-tiogalaktopiranozid Összekapcsolt DNS-molekulákat tartalmazó köztitermék (joint molecule) Kálium-foszfát (dibázikus) Katalítikus állandó Kálium-foszfát (monobázikus) Mitokondriális Mrn11-Rad50-NBP komplex Nijmegen breakage protein Nukleotid kivágó javítás (nucleotide excision reapir) Nem-homológ vég illesztés (nonhomologous end joining) Proteáz inhibítor mix Polo kináz-1 E. coli Rad51-ortológ Reaktív oxigén gyökök (reactive oxygen species) Replikációs protein A Nátrium-dodecil-szulfát Szintézis-függő szálanelláció (synthesisdependent strand annealing) Egyszálú (single-stranded) DNS Egyszálú DNS-kötő fehérje Élesztő Rad51 4

6 2. Bevezetés A genom integritás megőrzése elengedhetetlen a sejtek helyes működéséhez. A DNS-ben kódolt információ sérülése vagy elvesztése a sejtek rákos átalakulásához illetve halálához vezethet, így már a törzsfejlődés kezdetén bonyolult mechanizmusok alakultak ki a DNS hibák kijavítására. A különböző típusú hibák javítására többféle megoldás létezik. A DNS egyik szálát érintő hibák bázis (BER) vagy nukleotid (NER) kivágó illetve károsodást átugró javító mechanizmussal, a DNS mindkét szálát érintő hibák nem homológ vég illesztéssel (NHEJ) vagy homológ rekombináción (HR) alapuló DNS-hibajavítással javítódnak (Gyimesi és mtsai, 2010). Az esetek egy részében homológ rekombináción alapuló DNS-javítással javítódnak olyan súlyos hibák, mint a duplaszálú (ds) DNS törés (DSB), a replikációs villa megakadása valamint a DNS szálak közötti káros kovalens keresztkötés (ICL) (Li és Heyer, 2008). A homológ rekombináció során a javítás templátjául szolgáló homológ DNS-szakasz megkeresése elengedhetetlen a folyamat megfelelő végbemeneteléhez. A homológia keresésért felelős enzim a Rad51 nevű ATP-függő rekombináz. A Rad51 működése során először nukleoprotein szálat 1 képez az egyszálú (ss) DNS-en. A képződött nukleoprotein szál fő feladata - a javításhoz szükséges homológ szekvencia megkeresése és a szálcsere végrehajtása a támadó egyszálú nukleoprotein filamentum és a homológ ds DNS szakasz között - a Rad51 a szálcserélő aktivitásának köszönhetően történhet meg. A szálcserélő aktivitás során a nukleoprotein filamentum betámad a testvér kromatida intakt, homológ dsdns szakaszába és D-hurok szerkezetet hoz létre. A megfelelő DNS szakasz megtalálása után a Rad51 disszociál a DNS-ről, így megtörténhet a hiba kijavítása DNS-szintézissel a homológ szálat templátként használva (1. ábra) (Holthausen és mtsai, 2010). A Rad51, mint a HR alapú DNS-hibajavítás központi fehérjéje, kedvelt kutatási célpont. A Rad51 mélyebb megismerése azért is fontos, mert a DNS-hibajavításban betöltött központi szerepe miatt gyógyszer célpontként is szolgálhat: például Rad51 inhibítorok használatával a rákos sejtek elpusztításának hatékonyságát növelhetik (Nagathihalli és Nagarajn, 2011; Quiros, és mtsai 2011). A következőkben áttekintem a humán Rad51 (hrad51) enzim DNS-javításban betöltött szerepéről illetve a hrad51 nukleoprotein szál tulajdonságairól az irodalomban megtalálható 1 A dolgozatban a nukleoprotein szál szinonímájaként használom a filamentum elnevezést is. 5

7 adatokat, valamint összegzem a hrad51 nukleoprotein szál felépüléséről és lebomlásáról munkám során kapott eredményeket. 3. Irodalmi háttér 3.1. A hrad51 szerepe a HR-en alapuló DNS-hibajavításban A sejtben bekövetkező DNS-hibák közül a DSB (1. ábra), az ICL valamint a replikációs villa elakadásának (3. ábra) javításában van szerepe a HR alapú hibajavításnak (Li és Heyer 2008). 1.ábra A DSB törés javításának lehetőségei (Aguilera és Boulton, 2007 nyomán) A DSB hibajavítása során a törés helyén az 5 végű szál visszemésztődik nukleázok (ExoI) által. A szabadon maradt ss 3 végű ssdns-en a hrad51 filamentumot képez. A képződött szál betámad a testvéekromatid vagy homológ kromoszóma megfelelő dsdns szakaszába és 6

8 D-hurok szerkezetet hoz létre. A folyamat innen több útvonalon is tovább haladhat. A szintézis-függő szálanellálás (SDSA) útvonalon a betámadó szál a DNS-szintézis megtörténte után a másik véggel kapcsolódik, majd a keletkezett szerkezet feloldása nem átkereszteződött terméket ad. A törés-indukált replikáció (BIR) útvonalon a D-hurok replikációs villává alakulva lemásolja az egész törés utáni kromoszóma szakaszt, így a folyamat végül a heterozigócia vesztéshez vezet. A kettősszálú DNS-törés javító (DSBR) útvonal során a DNStörés másik oldalán is hrad51 nukloprotein filamentum képződik, így a két betámadó ssdns kettős Holliday kereszt (HJ) szerkezetet hoz létre (1. ábra). A komplex szerkezet feloldása vezethet átkereszteződött és nem átkereszteződött termékek képződéséhez is. A DSB javítása végbemehet hrad51-től függetlenül, a NHEJ útvonalon, amelyen a törött végek összekapcsolódása történik meg (Li és Heyer 2008). Azt, hogy melyik útvonalat választja a sejt, több faktor is befolyásolhatja (Helleday és mtsai, 2007). A törés helyén a DNS szerkezete fontos szempont lehet: a hosszú ssdns túlnyúló vég a HR útvonalnak kedvezhet (Helleday és mtsai, 2007). Az másik lényeges meghatározója a folyamatnak az, hogy a DNS-törés a sejtciklus mely szakaszában történt. A NHEJ az egész sejtciklus alatt végbemehet, míg a HR-alapú DNS-hibajavítás a ciklus S/G 2 fázisában preferált (Yata, és mtsai, 2012; Helleday és mtsai, 2007). Ennek az egyik oka lehet, hogy a HR következtében megnő a heterozigócia elvesztésének a lehetősége, ami a sejt számára káros lehet, hiszen információ elvesztését jelenti (Helleday és mtsai, 2007). A Polo-kináz 1 (PLK1) fontos szerepet játszik a S/G 2 fázisban bekövetkező DNS-károsodás felismerésében. A PLK1 szerepe eddig a meiózisban volt ismert, azonban nukleáris felhalmozódása az S és G 2 fázisban arra utal, hogy a DNS-replikációban és a DNS-javító útvonalakban is részt vesz (Yata és mtsai, 2012). A hrad51 N-terminusán található PLK1 célszekvencia, amelyben a PLK1 foszforilálhatja a Rad51 14-es pozíciójú szerinjét. Ennek következtében a 13-as helyzetű treonin foszforilása is megtörténhet a segítségével. 2. ábra A PLK-1 útvonal (Yata és mtsai, 2012 nyomán) 7

9 Ezután közvetlen kapcsolódás léphet fel a Nijmegen breakage proteinnel (NBP), amely kapcsolat elősegíti a hrad51 toborzását a sérült DNS-szakaszra. Az NBP kötő partnereivel - Mre11, Rad50 - együtt alkotja az MRN komplexet, amely elősegítheti a a HR-alapú DSB javítását S/G 2 fázisban (2. ábra) (Yata és mtsai, 2011). Az MRN komplex az Ataxia Telangiectasia mutáns kináz (ATM) aktiválásában is meghatározó szereppel bír, mellyel a foszforilációs szignál transzdukciós kaszkád beindítását segíti elő (Riches és mtsai, 2008). A HR folyamatok sejtciklus alatti szabályozásában a ciklin-dependens kinázok (CDK) szerepe is meghatározó. A Breast Cancer Susceptibility Protein 2 (BRCA2) fontos szabályozója a rekombinációs folyamatnak (Esashi és mtsai, 2005). A fehérje mutációja nagy mértékben növeli a számos ráktípus (pl: mellrák, petefészekrák) kialakulásának kockázatát. A BRCA es pozíciójú szerinjének CDK-függő foszforilációja gátolja a hrad51-gyel való interakcióját. Ez a hatás a sejtciklus során a mitózishoz közeledve egyre jelentősebb lesz. Abban az esetben, ha közben DNS-károsodás lép fel, a foszforiláció szintje újból lecsökken, így létrejöhet az interakció a BRCA2 és a hrad51 között (Esashi és mtsai, 2005), mely elősegíti a hrad51 ssdns-en való filamentum képzését a DNS-javításhoz (Carreira és Kowalczikowsky, 2011). Az ICL és a replikációs villa hibák összefüggésbe hozhatóak a DSB-vel, hiszen ezen hibák HR-alapú javítása végső soron DSB generálásán, támadó szál létrehozásán, szálinvázión majd a keletkezett komplex DNS-szerkezet megoldásán keresztül megy végbe (3/a,b. ábra) (Li és Heyer, 2008). In vitro körülmények között kimutatásra került, hogy a replikációs villa javításakor a hrad51 a szálinváziótól eltérő mechanizmussal működő DNS lézió elhagyó aktivitást mutat, melyet templát cserélő mechanizmusnak neveznek és a Rad54-el közreműködve jön létre (Bugreev és mtsai, 2011). A Rad54 egy DNS szálvándorlásban (BM) közreműködő fehérje, ami a megakadt replikációs villát kifordítani (regression) melynek jele a csirkeláb DNSszerkezet - és újraindítani (restore) is képes. A Rad54 a hrad51 nélkül a replikációs villa újraindítását preferálja, azonban in vitro hrad51-gyel közreműködve, az aktivitása a villakifordítás irányába tolódik el (3. ábra). 8

10 3.ábra A hrad51 szerepe a replikációs villa elakadásának javításában (Bugreev és mtsai, 2011 nyomán) A: Amennyiben a hiba a követő szálon található, a javítás a hrad51 szálcserélő aktivitása és egyéb mediátor fehérjék közreműködésének (pl:rad54) következtében a HR útvonalon megy végbe. B: Ha a hiba a vezető szálon található, a javítás megtörténhet az előbb említett szálcserélő aktivitáson alapuló HR útvonalon. C: Alternatív megoldásként a templátcserélő mechanizmus - mely során a hiba miatt a követő szál lesz a vezető szál templátja - következtében történő villakifordítás útján történhet meg a hibán történő áthaladás. Emlőssejtekben kimutatták, hogy a hrad51-nek különbözik a korai és a késői szerepe a megakadt replikációs villa javításában (Petermann és mtsai, 2010). A sejtek hidroxiureával való kezelése a replikációs villa blokkolását idézte elő. Rövidebb ideig tartó kezelés a replikációs villa elakadását, hosszabb ideig tartó kezelés a villa összeomlását idézte elő. Kimutatták, hogy a hrad51-nek szerepe lehet az elakadt villa újraindításában, valamint az összeomlott villa javítása során képződött új replikációs origó bonyolult szerkezetének feloldásában is (Petermann és mtsai, 2010). Fontos megemlíteni, hogy a HR-alapú DNS-hibajavítás nem korlátozódik kizárólag a sejtmagi DNS-re (Sage és mtsai, 2010). A HR javításban résztvevő enzimek egy része megtalálható a citoplazmában is, például a Rad51, Rad51C és Xrcc3 (lásd 2. táblázat) kimutatható a mitokondriumban is. Ezen enzimek eliminálása a mitokondriumból nagyban 9

11 lecsökkenti az mtdns kópiaszámot illetve az oxidatív stressz által okozott kópiaszám növekedést is limitálja. Az mtdns a mitokondrium mátrixában helyezkedik el, így az oxidatív stressz (ROS) okozta hatások veszélyeztethetik az épségét. Az ebből adódó hibák javítására a báziskivágó DNS-javító útvonal megléte már korábban is ismert volt. A hrad51, Rad51C és Xrcc3 enzimek stressz-indukált koncentráció-növekedése, valamint a hrad51 és az mtdns fizikai interakciója mind arra mutatnak, hogy létezik HR-en alapuló mtdns-javító mechanizmus is a mitokondriumban, habár állatokban a mitokondrium anyai öröklődése miatt a rekombináció ritka eseménynek számít (Sage és mtsai, 2010) A hrad51 mint rákellenes gyógyszer-célpont A hrad51 túltermelődése számos rákos megbetegedés jellemzője. Ennek a folyamatnak a direkt tumorgeneráló szerepe még nem leírt, azonban a tumorok túlélésével kapcsolatba hozható, hiszen a hrad51 DSB-javítási útvonalban betöltött központi szerepe miatt fontos szerepet játszhat a gyógyszer-rezisztencia kialalkulásában. Vizsgálatok szerint a hasnyálmirigy rákos megbetegedések esetében hrad51 transzkripciós és transzlációs szintű expressziójának vizsgálata akár markerként is alkalmazható a különböző stádiumok elkülönítésében, valamimt a fehérje gátlása terápiásan is felhasználható lehet (Nagathihalli és Nagarajn, 2011). A hrad51 inhibíció agytumorok esetében alkalmazható lehet. Az agytumorok kezelésére elsősorban különböző alkilálószereket használnak, melyek töréseket okozva a DNS-ben ideális esetben apoptózist váltanak ki a tumorsejtekben. A Rad51 vagy más, DSB-javítás útvonalban szereplő enzim (pl. BRCA2) gátlása növelheti ennek a folyamatnak a hatékonyságát. Glióma sejtekben RNS interferencia segítségével kiütve a hrad51-et vagy a BRCA2-t a sejtek érzékenyebbé váltak a rákellenes alkiláló szerek hatásával szemben (Qiuros és mtsai, 2011). Mint a fenti példák is mutatják, a hrad51 inhibítorok azonosítása hasznos lehet olyan rákellenes szerek hatásának növelésére, amelyek DSB-t vagy ICL hibát okoznak, vagy felhasználhatóak lehetnek a hrad51 funkcióinak minél mélyebb megismerésében. A B02 nevű vegyületet (4/a. ábra), mint specifikus hrad51 inhibítort (IC 50 = 27,4 μm) nagy áteresztő képességű vizsgálattal sikerült azonosítani (Huang és mtsai, 2011). Megállapították, hogy a B02 gátló hatást fejt ki a hrad51- ssdns filamentum kialakulására. A vegyület hatását 10

12 kipróbálva humán sejteken (HEK) azt az eredményt kapták, hogy a szer gátló hatást fejt ki a hrad51 függő DSB javítására (4. ábra) (Huang és mtsai, 2012). A B 4. ábra A: B02 szerkezete. (Huang és mtsai, 2011) B: a B02 hatása a sejtek osztódására (Huang és mtsai, 2012). IR hatására (+IR) a hrad51 toborzása megtörténik. Ha a B02 vegyület is hozzáadásra kerül (50 um), a hrad51 toborzása gátlódik. Zöld: hrad51 Kék: nukleusz 3.2. A hrad51 nukleoprotein szál A hrad51 funkcióját a DNS-hez kapcsolódva, a nukleoprotein szálon keresztül fejti ki. Ezért a filamentum szerkezetének, felépülésének, szálcserélő aktivitásának, lebomlásának és szabályozásának minél pontosabb ismerete lényeges az enzim működésének megértéséhez. Régió neve Pozíció (Aminosav sorszám ) Funkció HhH DNS-kötés Walker A ATPáz Walker B ATPáz L DNS-kötés L DNS-kötés ATP cap ATP-kötés 1.táblázat (Prasad és mtsai, 2006; Amunugama és mtsai 2012 alapján) A 339 aminosavból álló hrad51 fontosabb régiói A fehérje N-terminálisának szerkezetéről NMR (Aihara és mtsai, 1999), a Brca2-vel való interakciós doménjéről röntgenkrisztallográfiás adatok állnak rendelkezésre (Pellegrini és 11

13 mtsai, 2002). A hrad51 teljes szerkezete még nem ismert. A fehérje DNS- és ATP-kötésének valamint a monomerek egymáshoz kapcsolódásának szerkezeti hátterét mutációs vizsgálatokkal próbálták megállapítani (1. táblázat). Az egyik kísérletben a hrad51 aromás aminosavait cserélték le triptofánra, majd az így kapott mutánsokkal triptofán fluoreszcencia vizsgálatot végeztek (Renodon-Corniere és mtsai, 2008). Igazolták, hogy minden mutáns változat megőrizte legalább részlegesen az aktivitását. Megállapították, hogy az ATP- és a DNS-kötés konformáció-változást okoz: strukturális változás zajlik le az ATP-kötés következtében a DNS-kötő helyen, valamint ez fordítva is igaz, tehát a DNS-kötés hatására az ATP-kötő helyen következik be szerkezeti változás. A 294-es pozíciójú hisztidint és a 129-es pozíciójú fenilalanin térszerkezetileg szomszédos aminosavak, valamint a fenilalanin közel helyezkedik el az ATP γ-foszfátjához. Az hisztidin és a fenilalanin triptofánra történő mutációja az ATP indukálta DNS-kötőhely konformáció változásra hatottak, de a DNS-kötést nem akadályozták meg. A mutációk csökkentették a DNS-függő ATP-áz aktivitást is. Ezek az adatok arra utalnak, hogy ezek az oldalláncok részt vehetnek a DNS-kötés ATP-áz aktivitás stimuláló hatásának kialakításában (Renodon Corniere és mtsai, 2008). A hrad51 nukleotidkötő helye az alegységek közötti régióban helyezkedik el, ahol a 322. pozicióban lévő konzervált prolin aminosav felelős az adenin nukleotid megtartásáért (Amunugama és mtsai, 2012). A konzervált prolin mellett a 316-os pozícióban aszparagin található, bár az öt paralóg Rad51-ből (felsorolva lsd 1. táblázat) négyben ezen a helyen lizin található. (A Rad51 paralógok - melyek 20-30%-os szekvencia egyezést mutatnak a hrad51- gyel a nukleoprotein szál stabilizálásában játszanak szerepet (Krejci és mtsai, 2012).) Az aszparagin sóhídat képez az ATP γ-foszfátjával és konformációs érzékelőként működve gyorsítja az ATP-áz aktivitást a rekombináz aktivitás kárára. Ha a 316-os aszparagint lizinre cserélték, csökkent nukleoprotein filamentum ATP-áz aktivitást és megnövekedett rekombináz funkciót tapasztaltak. Érdekes kérdés evolúciós szempontból, hogy a Rad51 esetében miért került lizin helyett aszparagin a 316-os pozícióba. A legvalószínűbb magyarázat az, hogy a HR során a megnövekedett ATP-hidrolizáló képesség kell a megfelelő működéshez (Amunugama és mtsai, 2012). A hrad51 filamentum szerkezetét lineáris dikroizmus spektroszkópiával (a tirozinokat lecserélték triprofánra az erősebb jel érdekében) illetve molekuláris modellezéssel is vizsgálták (Reymer és mtsai, 2009). A kísérletekben dsdns-sel és ATP-vel képzett szál szerkezetét tanulmányozták. A modell szerint a DNS-kötésért az egyes (L1) és kettes (L2) 12

14 hurokrégiók felelősek. Az L1 hurok flexibilis, random coil szerkezetű, míg az nagyobb méretű L2 hurok strukturált α-hélix elemeket is tartalmaz. Az L1 hurok 232-es pozíciójú tirozinja interkalálódik a DNS-bázisok közé, így segítve a megfelelő filamentum-szerkezet kialakítását. Ezt támasztja alá az a megfigyelés, hogy a nagyobb méretű triptofánnal helyettesítve a 232-es tirozint, a filamentum jóval instabilabbnak bizonyult. A 235-ös pozíciójú arginin az L1 hurokban a DNS cukor-foszfát gerincével lép kapcsolatba (5. ábra). Megállapították azt is, hogy a monomer hrad51 nukleotid kötő zsebe közel helyezkedik el a DNS-kötő és a monomer-monomer kapcsolatért felelős régiókhoz is, így könnyen elképzelhető, hogy az ATP hidrolízise szerepet játszhat ezen kapcsolatok destabilizálásában (Reymer és mtsai, 2009). 5. ábra A hrad51 filamentum molekuláris modellezéssel történő ábrázolása (Reymer és mtsai, 2009) Jelölések: L1: lila, L2: zöld, Rad51 monomerek: kék és sárga, dsdns: narancs A hrad51 jobbmenetes hélixet képez a DNS-en, melynek következtében a DNS megnyúlik a normális B-szerkezetéhez képest (Hilario és mtsai, 2009). Egyedi molekula mikroszkópiával kimutatták, hogy az ATP-hidrolízis hatására a filamentum szerkezetváltozáson megy keresztül, melynek következtében a megnyúlt filamentumból tömör filamentummá alakul, mely folyamat reverzibilis. A szálcserélés szempontjából aktív (megnyúlt) filamentum hélixemelkedése nagyobb ( Å), mint az inaktív (tömör) filamentumé (65-85 Å) (Robertson 13

15 és mtsai, 2009). Az ATP-kötött filamentum tekinthető az aktív, az ADP-kötött az inaktív formának (Robertson és mtsai, 2009; Ristic és mtsai, 2010). Teljes belső visszaverődés fluoreszcens mikroszkópia (TIRFM) módszerrel is vizsgálták a hrad51 dsdns kötését. A kísérlet során mutánsokat hoztak létre a hrad51 különböző régióiban: L1, L2, N-terminális régió (1. táblázat) ( Prasad és mtsai, 2006). A mutáns rekombinázok dsdns-megnyújtó képességét illetve szálcserélő aktivitását vetették össze. Az L1 hurok mutánsok a dsdns megnyúlást és a szálcserélő aktivitást is csökkentették. Az N-terminális mutánsok csökkent szálcserélő aktivitással bírtak, így ez a régió szerepet játszhat a szálinvázió során a dsdns-sel való interakcióban. A DNS-megnyúlásra nem volt hatással az N-terminális mutáció. Az L2 hurok mutánsok nem voltak hatással egyik folyamatra sem. A felállított modell szerint a hrad51-nek két DNS-kötő felszíne különíthető el: az elsődleges DNS-kötő felszín, ami az ssdns-t, és a másodlagos DNS-kötő felszín, amelyik a betámadott dsdns-t köti. Az eredmények alapján az elsődleges DNS-kötő felszín tartalmazhatja az L1 hurkot, míg az N- terminális a másodlagos DNS-kötő felszín része (Prasad és mtsai, 2006). In vitro a hrad51 filamentum szálkicserélő aktivitása hatékonyabb Ca 2+ mint Mg 2+ jelenlétében. A jelenség a Ca 2+ ATP-hidrolízis gátló szerepével hozható összefüggésbe (Bugreev és Mazin, 2004). A fentebb említett lineáris dikroizmus spektroszkópiás vizsgálattal a Ca 2+ hatásának szerkezeti okait is megvizsgálták. Az eredmények azt mutatták, hogy Mg 2+/ ATP állapothoz képest Ca 2+ /ATP jelenlétében a filamentum rendezetebb struktúrát vesz fel, ahol a filamentum tengelye merőlegesen helyezkedik el a DNS bázisaihoz képest. A szerkezetbeli különbséget az okozza, hogy a nagyobb méretű Ca 2+ az L2 hurok szerkezetét stabilzálja, ami által szorosabb kötés jön létre a DNS és a fehérje között (Fornander és mtsai, 2012). A Ca 2+ kötés hatására bekövetkező szerkezetváltozást az is igazolja, hogy egyedi molekula fluoreszcens mikroszkópia vizsgálattal kimutatták, ha az ATP hidrolízis megengedett a DNS nagyobb mértékben megnyúlik, mint amikor Ca 2+ jelenlétében az ATPhidrolízis gátolt (Hilario és mtsai, 2009). 14

16 A hrad51 nukleoprotein szál szabályozása A sejtek életében a HR-en alapuló DNS-hibajavítás kettős hatással bírhat: egyrészről megfelelő működése révén a sejt számára akár végzetes DNS-hibák hibamentes javítására szolgál, másrészt túlzott működése rákos folyamatok elindulását, illetve sejthalált válthat ki (Li és Heyer, 2008). A HR megfelelő helyen és időben való végbemenetele számos enzim összehangolt munkáján keresztül valósul meg (1.ábra). A HR szabályozás egyik fő célpontja a hrad51 nukleoprotein szál (Krejci és mtsai, 2012), melynek fontosabb szabályozó partnereit az 1. táblázat foglalja össze. A lényegesebb szabályozó partnerek bővebb ismertetésére a szakdolgozat erre vonatkozó részeiben térek ki. Név BLM BRCA2 FANCM MRN komplex PAR1 Rad51B, Rad51C, Rad51D, XRCC2, XRCC3 Rad51AP1 Rad52 Rad54 RPA RTEL1 SWI5-MEI5 2.táblázat A hrad51 szabályozói (Krejci 2012 alapján) Funkció DNS helikáz, serkentő és gátló hatás a filamentumra Elősegíti a hrad51 ssdns-re kötését Helikáz és szálvándorlás aktivitással bír, D-hurok feloldása, SDSA útvonal elősegítése HR vagy NHEJ útvonal kiváltása HR gátlása, Rad51-hez kötés Rad51 paralógok, rekombinációs mediátorok, szerepük nem teljesen tisztázott D-hurok stabilizáló Rekombinációs mediátor ATP függő dsdns transzlokáz, ss DNS-Rad51 filamentum stabilizálja és a szálinváziót elősegíti, elősegíti a hrad51 heteroduplex DNS-ről való disszociációját ssdns kötése, Rad51 kompetítor ATP függő DNS helikáz, D-hurok formálás gátlása, SDSA útvonal elősegítése Rekombinációs mediátor 15

17 A hrad51 nukleoprotein szálak felépülése A hrad51 képes az ss- és dsdns-en is filamentumot képezni (Chi és mtsai, 2006). A folyamat látszólag a dsdns-en megy végbe gyorsabban - ez annak köszönhető, hogy a hrad51 a dsdns-ről 150-szer lassabban disszociál, mint az ssdns-ről - bár a filamentum felépülésének belső polimerizációs sebessége az ssdns-en nagyobb (Miné és mtsai, 2007). A hrad51 kötésének hatására bekövetkező DNS mobilitás-eltolódást vizsgáló gélelektroforézis módszerrel kimutatták, hogy a hrad51 DNS-kötéséhez nem szükséges nukleotid jelenléte (6/a. ábra) (Chi és mtsai, 2006; Tombline, 2002a). Ez evolúciósan új fejlemény, hiszen prokarióta (E.coli: RecA) (Cox, 2007) valamint élesztő (Saccharomyces cerevisiae: yrad51) (Antony és mtsai, 2009) Rad51-ortológok esetében a folyamat csak ATP jelenlétében megy végbe. Egy másik kísérletben a hrad51 restrikciós endonukleáz emésztés elleni DNS-védő hatását is vizsgálták (Chi és mtsai, 2006). A kísérletet különböző nukleotid állapotokban végezték el és azt az eredményt kapták, hogy nukleotid nélküli és ADP állapotban a hrad51 DNS-kötése nem véd a restrikciós endonukláz emésztésétől, míg ATP és nem hidrolizálható ATP-analógok (AMPPNP, ATPγS) jelenlétében a védelem tapasztalható. A legerősebb emésztés elleni védelem alatt a nem hidrolizálható ATP-analógokkal felépült nukleoprotein szál áll (6/b. ábra) (Chi és mtsai, 2006). 6.ábra A hrad51 DNS-kötésének vizsgálata (Chi és mtsai, 2006) A: DNS mobilitás-eltolódás vizsgálat ss (I) és ds (II) DNS-en. B: Restrikciós endonukleáz emésztése elleni védelem különböző nukleotid állapotokban (PNP= AMPPNP, γs = ATPγS). A felső csík a nem emésztett DNS, az alsó csík az emésztés következtében megjelenő DNS termékre utal. A hrad51 filamentum-formálás mechanizmusát egyedi molekula fluoreszcens mikroszkópiával vizsgálták dsdns-en (Hilario és mtsai, 2009). A fluoreszcens jelölés vagy a DNS egyik végén (ebben az esetben a hrad51 kötés hatására bekövetkező dsdns megnyúlást követhették nyomon) vagy a hrad51 fehérje N-terminális részén volt található. A fehérjén található fluoreszcens jelölés segítségével a filamentumképzés mechanizmusára vontak le következtetéseket (7.ábra). 16

18 7.ábra A hrad51 ds DNS-en történő filamentumképzésének nyomon követése egyedi molekula fluoreszcencia mikroszkópia vizsgálattal (Hilario és mtsai, 2009 nyomán) A vizsgálat során áramló folyadékot tartalmazó kamrában lévő dsdns egyik vége gyöngyhöz volt rögzítve. A: A dsdns másik végén található jelöléssel nyomon követhető a dsdns megnyúlása az idő függvényében. B és C: A hrad51 dsdns-hez való kötése az enzim N-terminálisán található fluoreszcens jelölésnek köszönhetően megfigyelhető az idő függvényében. C ábra: Mivel a hrad51dsdns-hez való kapcsolódása főként ionos másodlagos kölcsönhatások révén valósul meg, só (NaCl-200mM) hozzáadásával csökkenthető a hrad51 ds DNS-hez való affinitása. Így megfigyelhető, hogy a már kialakult magok (sárga nyíl) között később új magok képződnek (rózsaszín nyíl), melyekből az elongációs folyamat kiindulhat. A bemutatott ábrákon a kísérletek Ca 2+ (2mM)/ ATP (1 mm) + Rad51 (100 nm-a,b 300 nm-c) jelenlétében zajlottak. Az idő jelölése: -másodperc, -perc A hrad51 nukleoprotein szál felépülését mágneses csipesz vizsgálattal ss- és dsdns-en is vizsgálták. A DNS egyik vége a cella aljára volt kikötve, míg a másik vége mágneses gyöngyhöz volt rögzítve. A kísérelet során a DNS megnyúlását kísérték figyelemmel. DsDNS-sel összehasonlítva az eredményeket, az ssdns-en való filamentum-felépülés lassabbnak és szabálytalanabbnak bizonyult. A kapott görbe alapján a filamentum kb. 300 s után lassabban hosszabodott, míg 800 s után érte el végleges hosszát (8/b.ábra) (van der Hejden és mtsai, 2007). 17

19 8.ábra A hrad51 nukleoprotein filamentum képzése ss és ds DNS-en Mg 2+ /ATP jelenlétében (van der Hejden és mtsai 2007 nyomán). A kísérlet során 8 kilobázis hosszú dsdns-t (A) és 8,6 kilonukleotid hosszú ssdns-t (B) használtak. A hrad51 koncentráció 186 nm, az ATP koncentráció 1 mm volt. Kimutatták, hogy egy monomer 3 bázispárnyi szakaszt képes lefedni a DNS-en (Hilario és mtsai, 2009). A szálképződés nukleációhoz kötött, amelyhez 2-3 monomer (Hilario és mtsai, 2009) más források szerint 4-5 monomer (Holthausen és mtsai, 2010) szükséges. Mágneses csipesz vizsgálattal megállapításra került, hogy a nukleáció magas koncentráció küszöbhöz kötött, míg a filamentum elongációhoz szükséges koncentráció ennél tízszer kisebb érték lehet (Arata és mtsai, 2009; Mine és mtsai 2007). Ez a tulajdonság arra utalhat, hogy a nukleációhoz nukleáló faktorok jelenléte szükséges, ami fiziológiásan lehetővé teheti a minőségellenőrzést a DNS-hibajavító útvonalban (Arata és mtsai, 2009; Carreira és Kowalczykowski, 2011). Az egyik ilyen feltételezett nukleláló faktor a BRCA2 tumor szupresszor fehérje, amely a hrad51-et toborozza a DNS-károsodás helyére konzervált motívumok segítségével (Carreira és Kowalczykowski, 2011). A BRCA2 segít a Replication protein A (RPA) nevű fehérje eltávolításában is. Az RPA a humán megfelelője az E.coli SSB nevű fehérjének. Az RPA képes a törés helyén keletkezett ss DNS-hez kapcsolódni és stabilizálni azt, de a hrad51-hez hasonló rekombináz aktivitással nem rendelkezik (Carreira és Kowalczykowski, 2011). A nukleációs folyamat megtörténte után, a létrejött magokból indul ki a filamentum növekedése. A nukleációhoz kötött szálképzés következtében fehérjével fedett szakaszok jönnek létre a dsdns-en (2.ábra) (Hilario és mtsai, 2009). Ebből következően a filamentum nem folytonos, a monomerekkel fedett egységek között lehetnek fehérjével nem fedett régiók. Ha az ATP-hidrolízis megengedett, akkor egy egység 30 (ssdns) illetve 35 (dsdns) monomerből áll. A csupaszon maradt DNS-szakaszok flexibilisek, ami kedvező 18

20 tulajdonságokat adhat a nukleoprotein szálnak a DNS-javítás további folyamatainál (Hilario, és mtsai, 2009; van der Heijden és mtsai, 2007). Az újabb monomerek beépülésének kooperativitását Monte Carlo szimulációval próbálták elemezni. Lehetséges, hogy több monomer (4-5) épül be egyszerre (van der Heijden és mtsai, 2007), de a monomerek egyesével történő beépülése sem kizárt (Arata és mtsai, 2009). Utóbbit alátámasztja az a megfigyelés, hogy a monomerenkénti beépüléssel kevesebb csupaszon maradó bázispár marad a DNS-en (Arata és mtsai, 2009). A filamentum növekedése limitált folyamatnak bizonyult, melynek okaként több feltételezés is született. Az egyik feltételezés szerint az ATP-hidrolízis után bekövetkező ADP-kötött állapot gátolja az új egységek beépülését. Ezt a hipotézist nem támasztja alá az, hogy a limitáció nem hidrolizálható ATP-analóg (AMPPNP) jelenlétében is megfigyelhető volt (Hilario és mtsai, 2009). A másik feltételezés szerint olyan hrad51 polimer forma jön létre, amely terminálja a filamentumot (Hilario és mtsai 2009) A szálkicserélés és a homológia-keresés mechanizmusa A homológ rekombináció központi eseménye a szálkicserélés folyamata a támadó ssdns valamint a vele homológ dsdns szakasz között. A szálcsere folyamatát többféle módszerrel is vizsgálat alá vetették. Az egyik kísérletben ATP-áz mutáns hrad51 szálcserélő aktivitását hasonlították össze gélelektroforézis kísérletekben (Chi és mtsai 2006). Megállapították, hogy a szálcserélő aktivitás összefüggésben van a filamentum nukleotid állapotával. A 133-as pozíciójú lizin a hrad51 Walker A motívumában (1. táblázat) helyezkedik el, így mutációja hatással van a hrad51 nukleotid-kötő képességére. Ha a 133-as lizint alaninre (K133A) cserélték a mutáns az ATP-t nem volt képes kötni, ha argininre (K133R), a mutáns az ATP-t kötni képes volt, de azt hidrolizálni nem. A vad típusú, valamint a fent említett mutáns hrad51-gyel végzett kísérletekben a következő megállapításokra jutottak. Azokban a kísérletekben kapták a legtöbb szálcserélő aktivitásra utaló terméket, ahol a hrad51 ATP-áz aktivitása gátolva volt: K133R mutáns (9/c ábra) illetve vad típusú hrad51 és AMPPNP (9/b. ábra) jelenlétében. A K133A mutáns estében nem kaptak terméket (9/b ábra). A kapott adatok alapján elmondható, hogy a szálcserélés szempontjából az ATP-kötött filamentum az aktív, míg az ADP-kötött az inaktív forma (Chi és mtsai, 2006). Ezt alátámasztják egyedi molekula mikroszkópia vizsgálatokból kapott eredmények is (Robertson és mtsai, 2009). 19

21 9. ábra (Chi és mtsai, 2006) A vad típusú (hrad51) és a két ATP-áz mutáns (K133A) és (K133R) hrad51 DNS-szálcserélő aktivitása A: A hrad51 szálcserélő aktivitását a jelölt ssdns koncentrációjának növekedése jelzi B: A hrad51 és a K133A szálcserélő aktivitása különböző nukleotid állapotokban (nukleotid nélkül, ATP, AMPPNP) C: A hrad51 és a K133A szálcserélő aktivitása az idő függvényében. D: C ábra grafikonos ábrázolása. Time:idő, product:termék A szálcsere folyamán kialakuló DNS-terméket (joint molecule - JM) atomerőmikroszkópiával is vizsgálták (10. ábra) (Ristic és mtsai, 2010). A JM-nek a homológ részét vizsgálták csak, a heterológ részek túl instabilak voltak az atomerő mikroszkóppal történő detektáláshoz. 10.ábra (Ristic és mtsai, 2010 nyomán) A: A kísérlet során felhasznált DNS szubsztrátok (I) és a lehetséges termékek (joint molecule - JM) (II, III). A homológ szakaszok azonos színnel vannak jelezve. B: Az egyik JM 3 dimenziós ábrázolása. A vizsgálat során a következő szerkezeti tulajdonságokat állapították meg. A betámadott szakaszon kimutatásra került a DNS megnyúlása, ami azonos mértékű a hrad51-kötött 20

22 dsdns megnyúlásával. A betámadott szakaszon a dsdns flexibilissé vált, ami összefüggésben áll a kettős hélix felbomlásával. Az ssdns 5' vége felé eső szakaszon 90 o -ban meghajlik a dsdns (10/b.ábra), mely tulajdonság felismerési pont lehet a HR-ben közreműködő egyéb fehérjéknek. A DNS-szakaszok közötti heterológia hatását is vizsgálták. A heterológ részen nem volt megfigyelhető a nukleoprotein szál szerkezeti torzulása, így a Watson-Crick bázispárosodást szerkezeti okok nem gátolják a homológ részeknél sem. Lineáris dsdns szubsztrátot használva tíz nukleotid hosszú heterológia esetében mindegyik esetben, míg négy nukleotid hosszú heterológia csak az esetek egy részében volt blokkoló hatással a JM képzésére. Az esetek egyharmadában, ha a heterológia miatt gátolva volt a JM képzés azt tapasztalták, hogy a homológ 5 vég felől történt meg a szálinvázió. Ez azt sugallja, hogy nem feltétlenül szükséges a 3' betámadó szál a szálcseréléshez (Ristic és mtsai, 2010). Számos faktornak vizsgálták a szálcserélő aktivitásra való hatását. A magas Ca 2+ koncentráció serkentő hatással van a folyamatra (Bugreev és Mazin, 2004). Ez a megfigyelés azzal magyarázható, hogy a Ca 2+ gátolja az ATP hidrolízisét, így a filamentum az aktív formában marad. Ez az ön-inaktiváló tulajdonság evolúciósan új tulajdonság, hiszen yrad51 és RecA esetében a Ca 2+ az ATP-áz aktivitást gátolta, ám a szálcserélő aktivitásra nem volt hatással (Bugreev és mtsai, 2004). A sejtben a szabad Mg 2+ koncentrációja 0,4-0,6 mm között van, míg a Ca 2+ koncentrációja 5-10 µm, ami túl alacsonynak tűnik a homológ rekombináció szabályozásához. Azonban a DNS károsodás Ca 2+ - szint növelő hatását már kimutatták, így elképzelhető, hogy a Ca 2+ szerepe in vivo is leírható a HR folyamatában (Popescu és mtsai, 2011). A szálcserélő aktivitás szabályozásában enzimek is szerepet játszanak. A Rad54 transzlokáz stimulálja az aktivitást Ca 2+ jelenlétében (Mazina és Mazin, 2004) valamint segít a heterológ szakaszok átugrásában (Urena és mtsai, 2011). A Bloom-szindróma helikáz (BLM) különböző hatást gyakorolhat a filamentum szálcserélő aktivitására: ha a filamentum aktív formában van és a szálcserélő aktivitás homológ szakaszok között történik, serkentő hatással bír (Bugreev és mtsai, 2009). A hrad51 nukleoprotein szálnak a szálcserélő aktivitása mellett kimutatták szálvándorlást (BM) elősegítő aktivitását is (Rossi és mtsai, 2011). A szálinvázió után a BM a homológ rekombináció következő fontos lépése. A RecA és hrad51 is képes BM-re annak ellenére, hogy elsősorban nem a HJ-hoz kötnek és nincsen DNS transzlokáz aktivitásuk. Kimutatták, hogy a RecA és a hrad51 esetében is a DNS-szálcserélő aktivitás és a BM aktivitás 21

23 különböző filamentum konformációt igényel, ami alátámasztja, hogy a szálcserélés és BM két különböző aktivitás. A szálcseréhez stabil filamentum kell, amihez ATP és Ca 2+ jelenléte szükséges, míg a BM-hez dinamikus filamentum és nagyobb disszociációs képesség szükséges. A hrad51 disszociációjával és polimerizációjával a DNS-en a heteroduplex kiterjesztésének folyamata magyarázható (11/b. ábra). A javasolt mechanizmus szerint a BM során a polimerizáció és a disszociáció több ciklusban történik meg. A hrad51 gyorsabb asszociációjának köszönhetően a születő nukleoprotein szál csapdába ejti a HJ-t, mielőtt a régi nukleoprotein szálról a disszociáció megtörténne. Ennél a pontnál a BM akkor megy tovább, ha a disszociáció teljesen végbemegy, majd elkezdődik a polimerizáció a születő szálon és a ciklus megismétlődik (11/a. ábra). A BM iránya a filamentum felépülésének - amelynek iránya megegyezik a disszociáció irányával, (3-5 ) irányultságával van kapcsolatban (11. ábra). A hrad51 BM aktivitása magyarázatot ad arra, miért van ATP-áz aktivitása a hrad51-nek, hiszen a szálcserélő aktivitáshoz ez nem szükséges (Rossi és mtsai, 2011). 11. ábra (Rossi és mtsai, 2011 nyomán) A: A BM feltételezett mechanizmusa. A hrad51 filamentum felépülése a DNS-en, mellyel csapdába ejti a HJ-t (I). A BM akkor megy végbe, ha a régi nukleoprotein szálról (szürke ovális) disszociáció végbemegy és a születő (barna ovális) nukleoprotein szálon polimerizáció még nem éri el a HJ-t (II). A születő nukleoprotein szál megakadályozza a BM ellenkező irányba menetelét (III). B: A hrad51 BM aktivitásának feltétlezett szerepe a replikációs villa elakadásának javításában. Az ábra a szálinvázió utáni lépéseket mutatja. A szálinvázió után a hrad51 BM aktivitásának köszönhetően történik meg a D-hurok kiterjesztése, melyet később speciális motorfehérjék (kékkel jelölve) folytatnak. 22

24 A Rad51-ortológ rekombinázok BM aktivitása lassúnak mondható (3-4 bp/s, RecA), összehasonlítva a BM funkciót ellátó helikázokkal (10-50 bp/s). A hrad51 BM aktivitása tizenegyszer lassúbbnak bizonyult a RecA-énál, így valószínűleg eukariótákban szerepet játszanak egyéb stimuláló faktorok is a folyamatban (Rossi és mtsai, 2011) A hrad51 nukleoprotein szálak lebomlása A szálcserélés és a D-hurok szerkezet létrehozása után a következő fontos lépés a Rad51 disszociációja a heteroduplex DNS-ről annak érdekében, hogy a HR további lépései (1. ábra) végbemehessenek (Forget és Kowalczikowsky, 2010). A nukleoprotein filamentum lebomlása gyorsabban megy ss- mint dsdns-ről (Mine és mtsai 2007). A folyamat az ATP-hidrolízissel hozható kapcsolatba, nem hidrolizálható ATPanalógok jelenlétében a disszociáció nagyon lassúnak bizonyult (Chi és mtsai, 2006; Miné és mtsai, 2007). A hrad51 ATP-áz aktivitása nagyon alacsony, a k cat értéke 0,21 min -1 ss DNS; 0,11 min -1 ds DNS jelenlétében (Tombline, 2002b). A hrad51 ssdns-sel történő ATP hidrolízise és a DNS-ről való disszociációja között korreláció van, míg ds DNS-el ez nem mutatható ki (Miné és mtsai, 2007). A filamentum lebomlásának mechanizmusát a legtöbb kísérletben dsdns-en vizsgálták (Hilario és mtsai, 2009; van Mameren és mtsai, 2010; Robertson és mtsai, 2009). Egyedi molekula fluoreszcencia mikroszkópiával dsdns-el vizsgálva a lebomlást is megállapították, hogy a képződött filamentum addig stabil, amíg az ATP hidrolízis gátolt. Ha a hidrolízis létrejön a filamentum rövidülni kezd (Hilario és mtsai, 2009). A disszociáció egy gyors - ATP hidrolízis, ADP állapot létrejötte - valamint egy lassú - az ADP kötött hrad51 leválása a DNS-ről - lépésből áll (Hilario és mtsai, 2009; Bugreev és Mazin, 2004). Feltételezik, hogy a lebomlás függhet a terminális monomer nukleotid állapotától (van Mameren és mtsai, 2009). Ha a terminális hrad51 ATP kötött állapotban van, a szomszédos monomerek állapotától függetlenül protein-protein interakcióval stabil marad filamentum. Ha a terminális hrad51 kötött ATP-je hidrolizál, a monomer destabilizálódik és disszociál, melynek következtében az utána következő ADP-kötött monomerek is képesek lesznek leválni (van Mameren és mtsai, 2010). DsDNS-en végzett egyedi molekula mikroszkópiával kimutatták, hogy az ATP-hidrolízis hatására a filamentum szerkezet változáson megy keresztül, melynek következtében a megnyúlt filamentumból tömör filamentummá alakul, mely folyamat reverzibilis (Robertson 23

25 és mtsai, 2009). Amennyiben nem hidrolizálható nukleotiddal vagy ATP hidrolízisre nem képes hrad51 mutánssal (K133R), végezték el a kísérletet, azt az eredményt kapták, hogy a filamentum nem bomlik le még magas NaCl koncentrációnál sem, így arra következtettek, hogy összefüggés lehet a szerkezetváltozás és a hrad51 DNS-ről való disszociációs képessége között. Ha a filamentumképzés során végig magas ATP koncentrációt biztosítottak, a szerkezetváltozás nem volt megfigyelhető. Ez arra utalhat, hogy van egy sebességmeghatározó lépés az ATP-hidrolízis és az ADP + Pi felszabadulás után, ami megelőzi a tömör szerkezetbe való átmenetet. A sebesség-meghatározó lépés lassabb, mint az ATP-kötés sebessége és valószínűleg a monomerek közti kommunikációból ered. A tömör szerkezet eléréséhez több ADP-kötött vagy nukleotid nélküli szomszédosan elhelyezkedő monomer kell a filamentumon (Robertson és mtsai, 2009). A filamentum-lebomlás lassú folyamat, így valószínűleg egyéb faktorok is szükségesek a folyamathoz (Forget és Kowalczikowsky, 2010). A BLM helikáz homológ szakaszok közti szálcserélő aktivitás serkentő hatása mellett (Bugreev és mtsai, 2009), elősegítheti a nukleoprotein szál lebomlását (Bugreev és mtsai, 2007). Ez valószínűleg akkor történhet meg in vivo, ha a szálcserélés illegitim módon megy végbe. Feltételezik, hogy a BLM a hrad51 ATP-áz aktivitását gyorsítja, így az inaktív filamentum kialakítását segíti elő (Bugreev és mtsai, 2007). A BLM interakciós régióinak megismeréséhez rövidített BLM konstrukciókat hoztak létre, melyeknek megvizsgálták az ss DNS-hez és a hrad51-hez való kötődését. A BLM-DNS interaktáló domén hasonló helyen helyezkedik el, mint a BLM-hRad51 interaktáló domén. Ezek a szakaszok a BLM és as pozíciójú aminosavai között helyezkednek el. Ez arra utalhat, hogy a BLM HR szupresszáló hatása a hrad51 eltávolításával és a felszabadult ssdns elfoglalásával valósulhat meg (Bergeron és mtsai 2011). A BLM helikáz kettős hatása révén fontos komponens lehet a kettősszálú DNS törés javításának minőségellenőrzésében (Bugreev és mtsai, 2009). A Rad54 ds DNS transzlokáz sokrétűen képes hatást gyakorolni hrad51 filamentumra (2. táblázat) (Bugreev és mtsai, 2010; Mazina és Mazin, 2004; Urena és mtsai, 2011). A Rad54 a hrad51 filamentumot stabilizálni és disszociálni is képes (Mazin és mtsai, 2010). Ez a két egymásnak ellentmondó aktivitás úgy tud megvalósulni, hogy a Rad54 az N- terminálisán Rad51 kötő, a transzlokáz funkciójáért felelős motormagban pedig dsdns-kötő régióval is rendelkezik. A Rad54 filamentum stabilizáló hatása a hrad51 specifikus N- terminális régióval, míg a filamentum disszociáló aktivitása a dsdns-kötő régióval való kölcsönhatás révén valósul meg. Ezt támasztják alá a következő megfigyelések: A filamentum 24

26 stabilizálás ss- és dsdns esetében is megfigyelhető és ATP-független, míg a disszociáló aktivitás csak ds DNS-en megy végbe, ATP-függő valamint olyan filamentumhoz kötött, amely tartalmaz fehérjementes részeket, a Rad54 transzlokáz aktivitásának iniciálásához (Mazin és mtsai, 2010). 4. Célkitűzés Munkám során a hrad51 fehérje különböző nukleotid állapotokban (nukleotid nélküli, ATP, ADP, AMPPNP, mely egy nem hidrolizáló ATP analóg) történő nukleoprotein szálképződésének, illetve nukleotid nélküli állapotban lévő nukleoprotein szál lebomlásának gyorskinetikai módszerrel történő vizsgálatát végeztem el. A kísérletek során fluoreszcensen jelölt ssdns segítségével követtük nyomon a hrad51 filamentum képződésének és lebomlásának mechanizmusát. A következő kérdésekre kerestük a választ: - Hogyan hat a hrad51 filamentum képzésére annak nukleotid állapota? - Mi a hrad51 filamentum nukleotid nélküli lebomlásának mechanizmusa? 25

27 5. Anyagok és módszerek 5.1. A vad típusú hrad51 fehérjét kódoló plazmid létrehozása A hrad51 fehérjét kódoló plazmid Lumir Krejci laborjának jóvoltából elérhető volt laborunkban. A plazmid szekvenálása után kiderült, hogy a gén a 313-as aminosav kodonjának helyén lizin helyett glutamint tartalmazott. Laborunkban QuickChange Mutagenesis Kit (Stratagene) segítségével végeztük el a vad típusú aminosavra való cserét. A mutagenezishez szükség volt az aminosav-cseréhez szükséges pontmutációt tartalmazó primerek tervezésére (3. táblázat). Forward primer Reverz primer ggggaaaccagaatctgcaaaatctacgactctccc gggagagtcgtagattttgcagattctggtttcccc 3. táblázat A mutációhoz a 937. bázisnál cseréltük le a citozint adeninre (piros színnel jelölve) A primerek segítségével PCR reakció során elvégeztük a mutagenezist és a mutációt tartalmazó plazmidok felszaporítását. A hrad51 génjének 313-as aminosav pozíciójában glutamin kodont tartalmazó plazmidot metilált illetve hemimetilált DNS-t bontó DpnI endonukleáz segítségével emésztettük meg. Mivel az általunk használt E.coli (DH5α) törzsből preparált plazmid DNS-ek metiláltak voltak az enzim képes volt ezeket specifikusan lebontani, így döntő többségben hrad51 génjének 313-as aminosav pozíciójában lizin kodont tartalmazó plazmidok maradtak fent. A DpnI kezelt plazmidokat XL-10 Gold ultrakompetens sejtekbe transzformáltuk, ampicillines lemezre szélesztettük, majd a kapott telepekből plazmidot izoláltunk. A mutagenezis megfelelő végbemenetelét DNS-szekvenálás segítségével igazoltuk A hrad51 fehérje termeltetése E. coli expressziós rendszerben A kapott vad típusú hrad51-et tartalamzó plazmidot E.coli BLR sejtekbe transzformáltuk, majd ampicillint (100 µg/ml), kloramfenikolt (34 µg/ml) és tetraciklint (12.5 µg/ml) tartalmazó antibiotikumos lemezre szélesztettük. A kapott telepeket 12 liter 2YT (5 g pepton, 16 g yeast extract, 5 g NaCl, 1 literhez) táptalajban a fenti antibiotikumokat (kivéve tetraciklint) is hozzáadva OD600=0,8-ig növesztettük, majd 1 mm végkoncentrációban adott IPTG hozzáadásával indukáltuk a sejteket és 4 órán keresztül expresszáltattuk a fehérjét. 26

28 5.3. A hrad51 fehérje tisztítása ioncserés kromatográfiával A sejteket centrifugálással (Beckman Avanti J26, JLA es rotor, 5000 rpm, 10 perc, 4 o C) gyűjtöttük össze, majd folyékony nitrogénben fagyasztottuk és -80 o C-on tároltuk. A következő nap a felolvasztott sejteket grammonként 5 ml Feltáró pufferben (50 mm Tris-HCl, 1 M KCl, 0.5 mm etilén diamin tetraecetsav (EDTA), 1 mm Ditrioteitol (DTT), 10% szukróz, 0.01% Triton X-100, PI-mix, ph=7.5) homogenizáltuk, majd szonikálás segítségével végeztük el a sejtek feltárását. A sejttörmeléket ultrancentrifugálással távolítottuk el (Beckman 55Ti rotor, rpm, 120 perc). A kapott felülúszóhoz milliliterenként 0,242 g ammónium-szulfátot adtunk, ezzel a lépéssel kicsaptuk a fehérjéket, a hrad51-et is beleértve. Többszöri centrifugálás (Beckman Avanti J26, JA-20 rotor, rpm, 15 perc) - melyre a sókoncentráció csökkentése miatt volt szükség után a felülúszót leöntöttük, a pelletet folyékony nitrogénben fagyasztottuk, majd -80 o C-on tároltuk. Következő lépésben a pelletet 150 ml K pufferben (20 mm K 2 HPO 4 (dibázikus) 0,5 mm EDTA, 1 mm DTT, 10% glycerol, 0.01% Triton X-100, ph 7.40) szuszpendáltuk, majd 40 ml 175 mm KCl-ot tartalmazó K- pufferrel egyensúlyba hozott Q Sepharose Fast Flow (GE Healthcare) oszlopra vittük fel. Az oszlopot az egyéb fehérjék lemosása érdekében 10 oszloptérfogatnyi 175 mm KCl-t tartalmazó K pufferrel mostuk. A hrad51-et ÄKTA Prime FPLC rendszer segítségével 400 ml, mm KCl + K puffer lineáris gradienssel mostuk le az oszlopról. A hrad mm-os KCl koncentrációnál kezdett eluálódni az oszlopról. A hrad51-et tartalamzó frakciókat 2 x 2 liter 50mM KCl + T pufferben (25 mm Tris-HCl, 0.5 mm EDTA, 1 mm DTT, 10% glycerol, ph 7.5) 2 x 120 percig dializáltuk. Dialízis után a mintát 100 mm KCl + K pufferrel egyensúlyba hozott 5 ml térfogatnyi Bio-Scale TM Mini, CHT Type II, 40 µm Cartridge hidroxiapatit (Bio-Rad) oszlopra vittük fel, majd mostuk 10 oszloptérfogatnyi 100 mm KCl + K pufferrel. A fehérjét ÄKTA Prime FPLC rendszer segítségével 120 ml, mm KH 2 PO 4 + K puffer lineáris gradienssel mostuk le az oszlopról. A hrad mm-os KCl koncentrációnál kezdett eluálódni az oszlopról. A hrad51-et is tartalmazó frakciókat 2 x 1 liter T pufferben 2 x 120 percig dializáltuk. Következő lépésben a mintát LKB Bromma (Pharmacia) FPLC rendszer segítségével 50 mm KCl + K pufferrel egyensúlyba hozott 1 ml térfogatnyi MonoQ TM 5/50 GL (GE-Healthcare) oszlopra vittük fel, majd mostuk 10 oszloptérfogatnyi 50 mm KCl + K pufferrel. A fehérjét 30 ml, mm KCl + K puffer lineáris gradienssel mostuk le az oszlopról. A hrad mm-os KCl koncentrációnál eluálódott az oszlopról. A kapott frakciókat összegyűjtöttük, majd egy tized térfogatnyi 3 M- 27

29 os KCl oldat hozzáadása után töményítettük a fehérjeoldatot (K23D centrifuga, 3000 rpm, 3x15 perc) ~ 1 mg/ml-es koncentrációig. A fehérje tisztítási lépéseit és a tisztaságát SDS- PAGE módszerrel ellenőriztük. A koncentráció mérés Bradford módszere szerint történt. A töményített mintát folyékony nitrogénben fagyasztottuk és tároltuk Gyorskinetikai kísérletek A gyorskinetikai méréseket BioLogic stopped-flow készülékkel végeztük el. A műszer működési elve alapján a reaktánsok külön tubusokba kerülnek, ahonnan a betöltött oldatok egy precíziós motor segítségével néhány (1-3) ms-os holtidővel a küvettatérbe jutnak. Az itt lejátszódó reakció optikai jel segítségével folyamatosan, valós időben követhető. A módszer nagy előnye, hogy a milliszekundumos időfelbontásának köszönhetően jól elkülöníthetőek a reakció során lejátszódó egyes részlépések. küvetta fotoelektron sokszorozó tubusok (A és B) motor 12. ábra Biologic Stopped flow készülék ( A filamentum felépülésének és lebomlásának mérése során SF ATP-áz puffert (50 mm Tris-HCl, 50 mm NaCl, 5 mm MgCl 2, 1 mm DTT, ph= 7,5) használtunk. A filamentum felépülését 24 s-os időskálán vizsgáló kísérletek bemérései: A tubus: 2; 4; 6; 8; 10 μm hrad51 B tubus: 80 nm Cy3 dt79 és 0 illetve 10 mm koncentrációjú nukleotid (ATP, ADP, AMPPNP) A Cy3 dt79 egy 79 timin bázist tartalmazó nukleotidból felépülő egyszálú oligonukleotid, amely az 5 vagy 3 végen indokarbocianin (Cy3) fluoreszcens festékkel van jelölve. 28