LIPID ÉS GLÜKÓZ METABOLIZMUST BEFOLYÁSOLÓ POLIMORFIZMUSOK VIZSGÁLATA ELHÍZOTT GYERMEK POPULÁCIÓS MINTÁKBAN

Átírás

1 PHD ÉRTEKEZÉS LIPID ÉS GLÜKÓZ METABOLIZMUST BEFOLYÁSOLÓ POLIMORFIZMUSOK VIZSGÁLATA ELHÍZOTT GYERMEK POPULÁCIÓS MINTÁKBAN Horvatovich Katalin Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar, Orvosi Genetikai Intézet Témavezető: Dr. Melegh Béla Pécs 2011

2 TARTALOMJEGYZÉK 1 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE BEVEZETÉS A gyermekkori elhízás kapcsolata kardiovaszkuláris betegségekkel Molekuláris genetikai háttér Az apolipoprotein A-5 (APOA5) A glükokináz regulátor enzim génje (GCKR) VIZSGÁLATI CÉLKITŰZÉSEK APOA5 gén polimorfizmusainak, haplocsoportjainak vizsgálata GCKR gén polimorfizmusainak vizsgálata BETEGEK ÉS MÓDSZEREK A vizsgált betegpopuláció jellemzői Antropológiai mérések és klinikai paraméterek Elhízás definiálása Genotípus elemzés APOA5 gén polimorfizmusainak detektálása haplocsoport analízishez A GCKR gén polimorfizmusainak detektálása Statisztikai elemzés A linkage disequilibrium (LD-blokk) számítások EREDMÉNYEK Apolipoprotein A5 gén haplocsoport (APOA5) analízise A glükokináz regulátor gén vizsgálata (GCKR) EREDMÉNYEK MEGBESZÉLÉSE ÉS KÖVETKEZTETÉSEK Az APOA5 gén polimorfizmusainak és haplocsoportjainak szerepe A GCKR gén polimorfizmusainak egyedi szerepe EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA PUBLIKÁCIÓS LISTA AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ KÖZLEMÉNYEK EGYÉB KÖZLEMÉNYEK IDÉZHETŐ ABSZTRAKTOK IRODALOMJEGYZÉK KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS...64

3 1 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ADA American Diabetes Association APOA1 apolipoprotein A1 APOA4 apolipoprotein A4 APOA5 apolipoprotein A5 APOC2 apolipoprotein C2 APOC3 apolipoprotein C3 BMI body mass index - testtömeg index CDC Centers for Disease Control and Prevention CM kilomikron D.E.S.I.R. Data from an Epidemiological Study on the Insulin Resistance syndrome EDTA etiléndiamin-tetraecetsav FFA free fatty acid szabad zsírsav GCK glükokináz enzim GCKR glükokináz regulátor GPIHBP1 glycosylphosphatidylinositol high-density lipoprotein binding protein 1 GWAS genome wide association study - genomi asszociációs tanulmány HAPSTAT haplotype statistic - haplocsoport statisztika HDL high-density lipoprotein HOMA-IR homeostasis model assessment of insulinresistance HSPG heparan sulfate proteoglycan HTG hipertriglyceridaemia IDDM inzulin-dependens diabétesz mellitusz IDF International Diabetes Federation IOTF International Obesity Task Force LADA latent onset diabetes in adults LD linkage disequilibrium LDL Low density lipoprotein LDLR LDL receptor LPL lipoprotein lipáz MAF minor allél frekvencia MS metabolic syndrome - metabolikus szindróma NCEP National Cholesterol Education Program 3

4 NIDDM NHANES NHBPEP NGHS NTG OÉTI PCR PROCAM RFLP SNP T2DM TG VLDL WC WHO nem inzulin-dependens diabétesz mellitusz National Health and Nutrition Examination Surveys National High Blood Pressure Education Program Northeast Georgia Health System normál triglicerid Országos Élelmezés- és Táplálkozástudományi Intézet polymerase chain reaction - polimeráz láncreakció Prospective Cardiovascular Münster Study restriction fragment length polymorphism - restrikciós fragment hosszúság polimorfizmus single nucleotide polymorphism - egypontos nukleotid polimorfizmus type 2 of diabetes mellitus - 2-es típusú diabétesz mellitusz triglicerid Very low density lipoprotein waist circumferance - derékkörfogat World Health Organisation - Egészségügyi Világszervezet 4

5 2 BEVEZETÉS A szervezet energiaigényénél nagyobb kalóriájú tápanyagbevitel és mozgásszegény életmód miatt egyre elterjedtebb a túlsúlyosság gyermek és serdülőkorban, ami mára epidemiológiai jelentőségűvé vált. Az elhízás problémája Európában és világszerte riasztó, járványos méreteket öltött, ezért a World Health Organisation (WHO) az elhízást a nyugati fejlett és fejlődő kultúrák tíz legsúlyosabb egészségügyi problémája között tartja számon, melyet a globális szó hozzákapcsolásával globesity-nek nevezett el. Az elhízás és a következményeként fellépő betegségek csírái már a korai életszakaszokban is egyre gyakrabban megfigyelhetők, ezért egyre nagyobb kihívást jelent a gyermekgyógyászok számára is. A WHO 2004-ben végzett felmérések alapján az egész világon körülbelül 22 millióra becsüli az öt év alatti túlsúlyos vagy elhízott gyermekek számát. Az International Obesity Task Force (IOTF) felmérése szerint világszerte az 5-17 év közötti iskolás gyermekek 2-3 %-a (35-40 millió) tekinthető elhízottnak (60). Széleskörű epidemiológiai vizsgálatok azt mutatják, hogy Európában (1. táblázat), Amerikában ( év között, 1. ábra) és Ázsiában a gyermekkori túlsúly és elhízás prevalenciája már 10-20% közé tehető (42, 58). Magyarországon az iskolás gyermekek között az elhízás prevalenciája az 1980-as és 1990-es évek között elérte a 15%-ot (43). Napjainkban az Országos Élelmezés- és Táplálkozástudományi Intézet (OÉTI) legutóbbi felmérése alapján a 7-14 éves fiúk 18 százaléka, a lányoknak pedig 20 százaléka túlsúlyos, emellett a fiúk 7,5 százaléka és a lányok 6 százaléka tekinthető elhízottnak (86). Irodalmi adatok szerint az elhízott gyermekek 58%-ánál társult kockázati tényezők is jelen lehetnek (magas vérzsír szint, magasabb vérnyomás vagy inzulinrezisztencia) (10). A gyermekkorban leginkább célravezető,ún. etiológiai (oki) osztályozás szerint az elhízás két nagy csoportja különböztethető meg, az esetek 95 %-át adó exogén (elsődleges, egyszerű, idiopátiás) és az 5%-ban előforduló másodlagos elhízás ( A másodlagos típus egy részében endokrin okok közvetlenül vezetnek elhízáshoz (pl. a pajzsmirigy alulműködése), de ide tartoznak pszichiátriai rendellenességek, bizonyos gyógyszerek okozta elhízásformák és genetikai betegségek. A genetikai kutatásoknak köszönhetően egyre nő az elhízás azon másodlagos formáinak száma, melyek öröklődésmenete és pontos genetikai háttere ismert ( Elsődleges (exogén) elhízás eseteinek nagy többségére vonatkozóan elmondható, hogy az elhízás egy komplex, heterogén állapot, amelyben környezeti és genetikai tényezők egyaránt szerepet játszanak. Ikervizsgálatok eredményei azt mutatják, hogy az öröklött tényezők 50-90%-ban játszanak szerepet a zsírszövet kialakulásában ( A genomszintű kapcsoltság és társulásvizsgálatok segítik az elhízásra hajlamosító genetikai variánsok feltárását. Ma már kb. 200 olyan, 12 különböző kromoszómán 5

6 elhelyezkedő kandidátus (hajlamosító) gén, lókusz vagy kromoszómarégió ismert, melyek kapcsolatba hozhatók az elhízással. Feltételezhető, hogy egyes kandidáns gének a modern (az elhízást elősegítő) környezetben jutnak érvényre, és ez okozza az elhízás járványát ( Elhízás prevalenciája* Amerikai gyermek és serdülők körében az életkor függvényében (Kor 2 19 év) National Health and Nutrition Examination Surveys (NHANES) *Nem-és kor-specifikus BMI > 95-ös percentilis CDC növekedési grafikonjai alapján. Forrás: NHANES data on the Prevalence of Overweight Among Children and Adolescents: United States, CDC National Center for Health Statistics, Health E-Stat. 1. ábra: Az elhízás prevalenciája gyermek- és serdülőkorban az Egyesült Államokban. Az ábrán a NHANES által végzett epidemiológiai vizsgálatok adatai láthatóak. 6

7 1. táblázat: A gyermekkori elhízás prevalenciája Európában IOTF (International Obesity task Force) összegyűjtött adatai alapján 10 éves kor körüli gyermekek körében. túlsúlyos és elhízott (%) Vizsgálat dátuma Gyermek kor/mintaszám. Belgium 18%* / 348 Forrás M Guillaume et al, IJO, 19, S5-S9, 1995 Bulgária 20% / 618 S Petrova et al, Hygiene and Public H, XIV, 2001 Horvátország 27%* / 581 Antoinette Kaic-Rak to IOTF/GBD Csehország 16% / 3345 Jana Vignerova, NIPH Prague Dánia 18% / 319 Anne Nielsen to IOTF/GBD Finnország 13%* / M Fogelholm, IJOb, 23, , 1999 Franciaország 18% / 1582 Németország 15% / 2960 Görögország 31% / 1226 Magyarország 18% / 232 Olaszország 36% / Málta 35% / 519 Hollandia 14%* / ~700 M-F R-Cachera,et al, (IJO in press) (Kromeyer-Hauschild) to IOTF/GBD GE Krassas et al, JPedEndMet 14, 2001 Cole, Bellizzi IOTF, BMJ, 2000 (19) M Caroli et al to IOTF unpub Bellizzi IOTF Ministry of Health, Malta, 1992 AM Frederiks et al, ArchDisCh, 82, 2000 Norvégia 21% / 174 S Tonstad, M Sivertsen ArchDisCh 76, Lengyelország 19% / 250 I Palczewska to IOTF/GBD Szlovákia 10% / 635 K Babinska, A Bederova to IOTF/GBD Spanyolország 30% / 970 LS Majem et al Factors in Childhood Obesity (book) Barcelona, Svédország 18% / 6700 Svájc 16% / ~90 Anglia 22%* / 257 *BMI± SD paraméteren alapuló becslés Staffan Marild to IOTF unpub M Zimmerman et al, EuJClinNut, 54, Health Survey for England

8 2.1 A gyermekkori elhízás kapcsolata kardiovaszkuláris betegségekkel Irodalmi adatok igazolják, hogy a gyermekkori elhízás kritikus szerepet játszik az ateroszklerózis és a metabolikus szindróma (MS) korai kialakulásában, amely jelentősen megnöveli a nem-inzulin-dependens diabétesz mellitusz és a kardiovaszkuláris betegségek (CVD) kockázatát (50, 134). Bár az elhízáshoz társuló kórképek többsége jellemzően felnőttkorban jelenik meg, az obezitás bizonyos ateroszklerotikus következményei már gyermekés serdülőkorban elkezdődnek (9, 117), továbbá klinikai vizsgálatok azt mutatják, hogy a fokozott kardiovaszkuláris kockázat már az intrauterin időszakban is fennállhat (62). Prospektív vizsgálatok egyértelműen bizonyították, hogy a gyermekkori elhízás - a felnőttkori testsúlytól függetlenül is lényegesen befolyásolja a felnőttkori megbetegedést és halálozást (22). Irodalmi adatok szerint az elhízott gyermekekben is kimutathatóak olyan szív-érrendszeri rizikófaktorok, mint a dyslipidemia (emelkedett koleszterin és triglicerid koncentráció), hipertónia, glükóz intolerancia, 2-es típusú diabétesz és a zsírmáj jelenléte (14, 34, ). Ezen faktorok együttes előfordulása jellemző a metabolikus szindróma fellépése esetén (14, 34, ). Az elhízás és MS kialakulásának hátterében a környezeti faktorok, beleértve a táplálkozási szokásokat és az életstílust (csökkent fizikai aktivitás, fokozott zsír- és szénhidrátfogyasztás), és a genetikai tényezők állnak (37). Az MS 7-30%-ban fordul elő a kaukázusi felnőtt populációkban (17). A betegség gyermek és fiatalkori prevalenciájára vonatkozóan igen kevés adat áll rendelkezésre. Epidemiológiai vizsgálatok során Magyarországon a 8-18 év közötti elhízott serdülők 8,9%-ánál (20), míg Amerikában a év közötti elhízott serdülők 28,7%- ánál és a 8-13 éves elhízott gyermekek 30%-ánál detektálták a metabolikus szindrómát (125, 127) ( Gyermekkorban az MS fellépése nemcsak kedvezőtlen prognosztikai problémát jelent a szív és érrendszeri megbetegedések kockázatát illetően, hanem jelen idejű kedvezőtlen jelenségekkel is jár, mint a csökkent fizikai terhelhetőség (96). További különböző klinikai vizsgálatok azt mutatják, hogy a gyermekkorban már fennálló MS kb %-ban perzisztál felnőttkorra (125, 141, 142). Ami a metabolikus szindróma definícióját illeti, a felnőttekre nézve több kritérium rendszer is rendelkezésre áll, míg a gyermek és serdülőkori betegség definíciójára még nem született általánosan elfogadott konszenzus, habár néhány tanulmány segítséget nyújt az azonosításhoz (14, 122) (2. táblázat). 8

9 2. táblázat. A gyermekkorban fellépő metabolikus szindróma defíníciójával kapcsolatos határértékek bemutatása néhány publikált tanulmányban. Cook et al. Arch Pediatr Adolesc Med, 2003; 157, (125) de Ferranti et al. Circulation, 2004; 110, (127) Három vagy több a következők közül: Cruz et al. J Clin Endocrinol Metab, 2004; 89, (126) Weiss et al. N Engl J Med, 2004; 350, (117) Ford et al. Diabetes Care, 2005; 28, (129) 1. Éhgyomri glükóz 110 mg/dl Éhgyomri glükóz 6.1 mmol/l ( 110 mg/dl) Csökkent glükóz tolerancia (ADA kritérium) Csökkent glükóz tolerancia (ADA kritérium) Éhgyomri glükóz 110 mg/dl (további elemzés szerint 100 mg/dl) 2. WC (derékkörfogat) 90-es percentilis (kor- és nemspecifikus) NHANES III 3. Triglicerid 110 mg/dl (kor-specifikus) NCEP 4. HDL-C 40 mg/dl (összes kor/nem) NCEP WC (derékkörfogat) >75-ös percentilis Triglicerid 1.1 mmol/l ( 100 mg/dl) HDL-C <1.3 mmol/l (<50 mg/dl) WC (derékkörfogat) 90-es percentilis (kor-, nem- és rassz-specifikus) NHANES III Triglicerid 90-es percentilis (kor- és nemspecifikus) NHANES III HDL-C 10-es percentilis (kor- és nemspecifikus) NHANES III BMI Z érték* 2.0 (kor- és nem specifikus) Triglicerid >95-ös percentilis (kor-, nem- és rassz-specifikus) NGHS HDL-C <5-ös percentilis (kor-, nem- és rassz-specifikus) NGHS WC (derékkörfogat) 90-es percentilis (nem-specifikus) NHANES III Triglicerid 110 mg/dl (kor-specifikus) NCEP HDL-C 40 mg/dl (összes kor/nem) NCEP 5. Vérnyomás 90-es percentilis (kor-, nem- és magasságspecifikus) NHBPEP Vérnyomás >90-es percentilis Vérnyomás >90-es percentilis (kor-, nem- és magasságspecifikus) NHBPEP Vérnyomás >95-ös percentilis (kor-, nem- és magasságspecifikus) NHBPEP Vérnyomás 90-es percentilis (kor-, nem- és magasság specifikus) NHBPEP *Z érték: a mintaelem értékének standardizált pontszáma, azt adja meg, hogy a mintaelem értékének az átlagtól való eltérése hányszorosa a standard deviációnak. Forrás: 9

10 A 2-es típusú diabétesz klasszikus példája a környezeti, viselkedési és genetikai hatások közötti kölcsönhatások eredményeképpen létrejött komplex betegségeknek (128, 131, 135, 136). Alapos bizonyíték van rá, hogy az elhízás a betegség egyik fő kiváltó nem-genetikai tényezője (44, 66). Az elhízással kapcsolatos kedvezőtlen tendencia a 2-es típusú diabétesz mellitusz (T2DM) gyermek- és serdülőkorban való megjelenése is (29, 134). A 2-es típusú diabéteszben szenvedők 80%-a túlsúlyos ( A betegség érinti a szénhidrát-, a lipid-, sőt a fehérje és a nukleinsav-anyagcserét is. A kórképet kezdetben hiperinzulinémia jellemzi, majd hipertónia lép fel, és sokszor kísérik kardiovaszkuláris megbetegedések (36). A 2. ábra mutatja be a cukorbetegségek típusait és a T2DM kialakulásának a kóroki hátterét. Egy 2007-es Amerikai Egyesült Államokban végzett felmérés szerint a T2DM előfordulási gyakorisága a 20 év alatti korosztálynál eléri a 2 %-ot (3. ábra). Az utóbbi években egyes populációkban járványszerű mértékben növekedett a gyermekés serdülőkori T2DM esetek száma, arányuk megközelíti az új megbetegedések 50%-át (61, 76, 88). A T2DM gyermek- és serdülőkori előfordulása mindegyik etnikai csoportot érinti, de egyeseket jobban, mint másokat: elsősorban ott figyelhető meg, ahol a felnőttkori esetek száma is jelentős (61). Ezt először a pima indiánok körében észlelték, ahol a T2DM incidenciája a legnagyobb értéket mutatta a világon (29, 76). A pima indián gyermekek között a T2DM előfordulási aránya nagyobb, mint az átlagnépességben, és ez az arány az életkorral tovább nő (29, 76). Az 1980-as évek végétől az 1990-es évek közepéig a T2DM előfordulási aránya 54%- kal nőtt a tizenéves pima indiánok körében (29, 76). Hasonló növekedésről számoltak be japán, ázsiai-amerikai, mexikói-amerikai és afroamerikai gyermekek esetében is (29, 88). Egyes adatok szerint a mexikói-amerikai származású cukorbeteg gyermekek 21%-a T2DM-ban szenved (88). Több intézet adatai szerint a T2DM-ban szenvedő gyermekek 69%-a afroamerikai származású (61, 76, 88). A T2DM öröklődési formája lehet monogénes vagy poligénes ( (88). Az igen ritka előfordulású monogénes formához az autoszómális domináns öröklődésű 2-MODY (maturity-onset type 2 diabetes of the young), valamint az anyai öröklődésű, ún. mitokondriális diabétesz szindrómák tartoznak, az utóbbiak súlyos fejlődési rendellenességekkel járnak együtt ( (88). Genetikai vizsgálatok során azonosították ezen monogénes típusú formák hátterében álló géneket és lókuszokat ( A poligénes öröklődésű diabéteszhez kapcsolódó genetikai vizsgálatokat napjainkig szinte kizárólag felnőtt betegeken végezték el, a legjelentősebbnek eddig a 2-es kromoszóma ún. NIDDM1 (nem inzulin dependens diabétesz mellitusz 1) lókusza bizonyult, amely mexikói etnikumú családok diabéteszes tagjaiban 30%-ban volt kimutatható (88). 10

11 2. ábra. A cukorbetegségek típusai és a 2-es típusú diabétesz mellitusz kialakulásának kóroktana. LADA: latent onset diabetes in adults. Forrás: 3. ábra: A 2-es típusú diabétesz mellitusz prevalenciája az életkor függvényében az Egyesült Államokban (2007-es becslés). Forrás: 11

12 2.2 Molekuláris genetikai háttér Az elhízás környezeti (helytelen táplálkozási szokások vagy csökkent fizikai aktivitás) valamint öröklődő tényezők kölcsönhatásának eredménye. Különböző vizsgálatok bizonyították, hogy a testsúly variabilitás 30-80%-a genetikailag meghatározott (52). Az elhízás molekuláris markereinek vizsgálata rövid múltra tekint vissza, de az obezitással kapcsolatos genetikai ismereteink az elmúlt évtizedben jelentősen bővültek. A genetikai tényezők közül kiemelt jelentőséggel bírnak a glükóz- és lipidmetabolizmusban résztvevő fehérjéket kódoló gének defektusai, melyek a glükóz- és lipidháztartás zavarát okozzák, és következményesen szív- és érrendszeri károsodást eredményeznek (112). A viszcerális típusú elhízás súlyos anyagcsereabnormalitást okoz (112). Ennél az elhízás típusnál, a portális vénán keresztül emelkedett szabadzsírsav készlet kerül a májba, amely nagymértékben módosítja a máj lipid és szénhidrát anyagcseréjét, fokozva ezzel a glükoneogenezist és a trigliceridgazdag VLDL (very low density lipoprotein) szintézist (112). Emellett a megnövekedett szabad zsírsav gátolja az inzulin hatását és az inzulin clearance gátlás révén hiperinzulinémia és inzulinrezisztencia kialakulásához vezet (112). Számos tanulmányban az emelkedett triglicerid-szint hajlamosító tényezőnek bizonyult a kardiovaszkuláris megbetegedések manifesztációjában (6, 51, 69), ezért a vizsgálatok kiterjedtek a gének által kifejtett közvetett hatásokra, így a triglicerid-szint változásokra is (99, 118). A 4. ábra egy nyolc évig tartó tanulmány triglicerid-szint és a koronária rizikó közötti kapcsolatra vonatkozó adatait mutatja be (6). 12

13 4. ábra. A triglicerid-szint emelkedése együtt jár a koronária események számának emelkedésével (százalékos előfordulás). A triglicerid 1,8 mmol/l szintje esetén a relatív rizikó már meghaladja a kétszeres értéket. PROCAM (Prospective Cardiovascular Münster Study) tanulmány (6). 13

14 2.2.1 Az apolipoprotein A5 (APOA5) A 11-es kromoszómán található APOA1-C3-A4-A5 gén család tartalmaz legalább három olyan gént, amely befolyásolja a plazma lipoprotein metabolizmusát (56, 59). Az elmúlt közel két évtizedben a legtöbb tanulmány az APOA1 szerepével foglalkozott, amely befolyásolja a HDL szintézis mértékét (31), illetve az APOC3 kutatása is előtérbe került, ugyanis a génben előforduló polimorfizmus szerepet játszik a plazma triglicerid szintjének modulációjában (16). A 80-as években kezdték vizsgálni az APOA4 gént, amelyről kiderült, hogy kapcsolatban áll a kilomikron és HDL partikulumok képződésével (116). Ezen kívül számos tanulmány kiderítette, hogy ez a gén fontos szerepet játszik a postprandiális lipoproteinémia és a szív és érrendszeri betegségek kialakulásában (49, 55). Az apolipoprotein család legújabb tagját, az apolipoprotein A5 (APOA5) gént az egér és humán genom összehasonlító szekvenálása során fedezték fel 2001-ben (83). Az APOA5 gén vizsgálatai fényt derítettek arra, hogy ennek a génnek szignifikáns szerepe van a lipidek és lipoproteinek modulációjában (83). A humán APOA5 gént az APOA1-APOC3-APOA4 génklasztertől 27 kb távolságra azonosították a 11q23-as kromoszómális régióban (83) (5.ábra). 5. ábra: Az APOA5 gén lokalizációja a 11-es kromoszómán. Az ábrán függőleges piros vonal jelzi a 2q23.3 pozícióban elhelyezkedő APOA5 gént (forrás: A négy exont tartalmazó APOA5 gén egy 366 aminosavból álló, 39kDa molekulasúlyú polipeptidet kódol, amely a májban történő expresszálódását követően a HDL és VLDL alkotórészeként a plazmába szekretálódik, ahol központi szabályozó hatást fejt ki a triglicerid metabolizmusára (41, 85). A 6. ábra mutatja be az ApoA-V fehérje triglicerid metabolizmusára kifejtett hatását (6. ábra) 14

15 Forrás: (119) 6. ábra. Az APOA-V fehérjének a TG-ben gazdag lipoprotein anyagcserére irányuló, feltételezett extracelluláris hatásai: Az ApoA-V kölcsönhatása a heparin-szulfát-proteoglikánnal (HSPGs) megkönnyíti a lipoprotein lipáz (LPL) apoc-ii-re ható aktiválását, ami gyorsított TG hidrolízist eredményez (33, 119). A TG-ben gazdag lipoproteinek [VLDL és kilomikronok (CM)] lebontása során keletkezett maradék partikulum az ApoA-V fehérje disszociációját eredményezi a TG-ben gazdag partikulumokról, ezt követően az ApoA-V fehérje rákapcsolódik a HDL partikulumra, ahol addig marad, amíg a plazmában vissza nem kerül az ott keletkező TG-ben gazdag lipoproteinekre (33, 119). Az ApoA-V kapcsolódása a GPIHBP1 (glycosylphosphatidylinositol high-density lipoprotein binding protein 1) proteinhez megkönnyítheti a TG szabadzsírsavakra (FFA) történő hidrolízisét a CM-ban (33, 119). A GPIHBP1 fehérje homodimert alkot, melynek negatív töltésű doménjei hozzákötődnek az LPL és az ApoA-V fehérjékhez, amely a CM hatékony lipolitikus folyamatát eredményezi (82). Az ApoA-V kölcsönhatása az LDLR (LDL receptor) család tagjaival megkönnyítheti a maradék lipoprotein részecskék endocitózisát (33, 119). Folytonos nyilak jelzik a lipoprotein részecskék útját; szaggatott nyilak jelzik az ApoA-V molekula útját. 15

16 Számos különböző felnőtt populációt vizsgáló tanulmány bizonyítottan leírta, hogy az APOA5 gén variánsainak jelenléte [T-1131C (rs662799), IVS3+G476A (rs ), T1259C (rs ) és C56G (rs )] emelkedett triglicerid koncentrációt eredményez (4, 54, 84). A T-1131C az APOA5 gén promóter régiójában, a T1259C a 3 nem transzlálódó régiójában, az IVS3+G476A a 3. intronban, míg a C56G a 3. exonban találhatók (83). Felnőtt betegpopulációkban végzett vizsgálatok kimutatták, hogy a -1131C allél hajlamosító tényezőként hat a szívkoszorúér betegség, a stroke és a metabolikus szindróma kialakulásában (47, 94, 121). Az APOA5 gén vizsgálatai során kiderítették, hogy a gén természetes variánsai által determinált haplocsoportok fontosabb, komplexebb hatással bírnak a lipid paraméterekre és egyes haplocsoportok szoros genetikai kapcsoltságban állnak az APOC3 gén természetes variánsaival (80). Egészséges, felnőtt, kaukázusi populációban végzett haplocsoport analízisek azt mutatták, hogy az APOA5*2 (-1131C, IVS3+476A és 1259C) és *3 (-1131T, IVS3+476G, 1259T, 56G) haplotípusok kockázati tényezőt jelentenek különböző kardiovaszkuláris betegségek kialakulására (74). Ezen felül, az APOA5*2 haplotípus jelenléte felnőtt MS populációban az APOA5 haplotípusok közül kizárólagos hajlamosító kockázatot mutatott a metabolikus szindróma kialakulására (54). Gyermekek tekintetében a szakirodalom kevés információt nyújt az APOA5 gén haplocsoport-jelölő polimorfizmusainak prevalenciáját illetően (28). Mindezen túl, az APOA5 haplocsoportok lehetséges hajlamosító hatásait elhízott gyermekekben még eddig nem vizsgálták. Ez arra ösztönzött minket, hogy magyar elhízott gyermekekben megvizsgáljuk az APOA5 gén természetes haplocsoportjainak előfordulási gyakoriságát, továbbá, hogy tanulmányozzuk a klinikai paraméterekre és az elhízásra kifejtett hatását. 16

17 3. táblázat. Az Apolipoprotein A5 (APOA5) gén haplotípusai. *a pirossal jelölt betűk a variánst jelentik. Haplotípusok T-1131C* IVS3+ G476A* T1259C* C56G* APOA5*1 T G T C APOA5*2 C A C C APOA5*3 T G T G APOA5*4 C G T C APOA5*5 T G C C 7. ábra Az Apolipoprotein A5 (APOA5) gén variánsainak elhelyezkedése a 11q23 kromoszómális régióban. Forrás: 17

18 2.2.2 A glükokináz regulátor enzim génje (GCKR) A glükokináz regulátor gént (GCKR) a 23-as kromoszómán lokalizálták (2p23.3-p23.2), amely 19 exont tartalmaz, és egy 625 aminosavból álló proteint kódol. A glükokináz regulátor protein (GCKR) 68 kda molekulasúlyú, és a máj kulcsfontosságú glükokináz (GCK, hexokináz IV) enzimének működését szabályozza (24, 65, 91, 102, 104, 107). A glükokináz enzim központi szerepet játszik a vér glükóz-homeosztázisában, valamint a májsejtekben, és a hasnyálmirigy β- sejtjeiben a glükóz-foszforilációt végzi (2, 23, 24, 91, 107). A glükóz-szenzorként működő enzim közvetve fokozza a májban a glükóz metabolizmusát és a hasnyálmirigy β- sejtjeinek inzulin-szekrécióját (2, 113). A GCKR protein regulátor- és receptorfehérjeként egyaránt szerepet játszik a GCK enzim működésében (104, 114, 123, 124, 130, 132). A glükokináz-regulátor protein negatívan szabályozza a GCK enzim aktivitását: reverzibilisen hozzákötődve inaktív komplexet alkot, amely képes a sejtmagba jutni (39, 48). A sejtmagban a komplexképzés révén a GCKR protein stabilizálja és védi a GCK enzimet a degradációtól (3, 30, 35, 39, 48). A vér glükóz szintje befolyásolja a komplex képződését (13, 15, 18). A vér magas glükóz koncentrációja esetén (>10mM), a glükóz a GLUT2 transzporteren keresztül bejut a májsejtbe, ahol aktiválja a GCK enzimet, aminek következtében a glükóz foszforilálódik (13, 15, 18). A glükóz szint drasztikus csökkenése (éhezés, 5 mm alatti koncentráció) és/vagy a fruktóz-6-foszfát jelenléte előidézi a GCKR protein GCK enzim működésére irányuló inhibitor funkcióját (103, 106). A sejtmagban a GCKR-GCK inaktív komplex addig marad fent, amíg a sejtplazma glükóz koncentrációja meg nem emelkedik, a glükóz át nem áramlik a nukleáris pórusokon keresztül a sejtmagba, melynek hatására a GCK disszociál a GCKR proteinről és visszaáramlik a sejtplazmába, ahol megindul a glükóz-foszforiláció (103, 106). A GCKR szabad ligand-kötőhelyére a fruktóz-1-foszfát kapcsolódik megakadályozva a protein glükokináz enzimre irányuló gátló funkcióját (103, 106). In vitro kísérletek megerősítették, hogy a GCKR mind a GCK protein expresszióját, mind az enzimatikus aktivitását képes fokozni (92). Az elmúlt években végzett genomi asszociációs tanulmányok (GWAS, genome-wide association studies) eredményei szoros összefüggést mutattak ki a GCKR gén több funkcionális variánsa és a hipertrigliceridemia között (90, 110, 111). Több irodalmi adat utal rá, hogy a GCKR gén inverz hatást gyakorol a glükóz- és triglicerid-szintekre, mely szerint a gén bizonyos polimorfizmusainak közvetett hatására emelkedik a plazma triglicerid-szintje, ezzel egyidejűleg a glükóz koncentráció csökkenése figyelhető meg (81, 90, 109). A glükokináz enzim 18

19 aktivitásának fokozása (vagy kevésbé hatékony gátlása) segítséget nyújthat a 2-es típusú diabétesz terápiás stratégiájának felépítésében (27, 35, 40, 64). A GCKR gén két leggyakrabban vizsgált polimorfizmusa az intronikus (intron 16) rs variáns és az exonikus (exon 15) rs (1337T) variáns, mely a 446. aminosavpozícióban prolin-leucin cserét eredményez (P446L). A 2-es típusú diabéteszre irányuló GWAS vizsgálatok kimutatták, hogy az intronikus rs polimorfizmus közvetve magas triglicerid koncentrációval, alacsony glükóz szinttel és csökkent inzulin rezisztenciával van összefüggésben (87, 90, 93). Ezen felül az rs A allél hordozása kisebb kockázatot mutatott a 2-es típusú diabétesz kialakulására nézve (87, 93). Vaxillaire és mtsai korábban azt tapasztalták, hogy a GCKR gén exonikus rs variánsa szintén kapcsolatban áll a glükóz-homeosztázis paramétereivel (glükóz-, inzulinkoncentráció, HOMA-IR) és a 2-es típusú diabétesz kialakulásával (109). A GCKR-446L variánst hordozók esetén alacsonyabb éhgyomri glükóz szintet, kisebb inzulin rezisztenciát állapítottak meg, és ez a variáns csökkent rizikót jelentett a 2-es típusú diabétesz manifesztációjára a mért emelkedett TG szint és dyslipidemia ellenére (109) ben egy kínai felnőtt populáción végzett vizsgálat során azt tapasztalták, hogy az rs A allél hordozói védettebbek a 2-es típusú diabétesz és az elhízás kialakulásával szemben, emellett megerősítették mindazokat a szakirodalomban leközölt adatokat, miszerint ez a polimorfizmus inverz hatást gyakorol a triglicerid és glükóz koncentrációkra (87). A munkánk célja az volt, hogy egyrészt megvizsgáljuk a lehetséges összefüggéseket a GCKR gén variánsai és a triglicerid- illetve éhgyomri vércukorszint között, másrészt, hogy tanulmányozzuk rs és rs polimorfizmus allél eloszlását magyar elhízott és egészséges, normál súlyú gyermekek csoportjában. Egy genom-méretű tanulmány összefüggést talált a GCKR gén rs polimorfizmusa és a plazma kórosan megemelkedett triglicerid szintje között. A tanulmányban az rs L változat (MAF 52%) jelentős felhalmozódást mutatott a hipertrigliceridémiás alanyok körében (HTG) (133). Elhízott gyermekek tekintetében a szakirodalomban hasonló adatok nem állnak rendelkezésünkre, azonban egészséges felnőtt és serdülő populációban egy kínai tanulmány vizsgálta a GCKR rs variánsának és GCK gén rs variánsának metabolikus paraméterekre kifejtett interakciós hatásait. (137). A munkánk célja az volt, hogy egyrészt megvizsgáljuk a lehetséges összefüggéseket a GCKR gén variánsai és a triglicerid- illetve éhgyomri vércukorszint között, másrészt, hogy tanulmányozzuk az rs és az rs polimorfizmus allél eloszlását magyar elhízott és egészséges, normál súlyú gyermekek csoportjában. 19

20 3 VIZSGÁLATI CÉLKITŰZÉSEK Az elhízott gyermekeken végzett vizsgálatainkban két gén kapcsolatát elemeztük a lehetséges triglicerid- és glükóz-szint változásokkal, valamint tanulmányoztuk az esetleges összefüggéseket a gyermekkori elhízás kialakulásával. Vizsgálataink céljai a következők voltak: 3.1 APOA5 gén polimorfizmusainak, haplocsoportjainak vizsgálata 1. Elhízott gyermekpopuláción végzett vizsgálataink egyik fő tárgya a felnőtt metabolikus szindrómával, hipertrigliceridémiával és ischémiás szívbetegséggel összefüggésbe hozott apolipoprotein A5 gén (APOA5) gyakori természetes variánsainak alléleloszlására (T-1131C, C56G, IVS3+G476A, T1259C) és a variánsok által képzett haplocsoportok (APOA5*1, APOA5*2, APOA5*3, APOA5*4, APOA5*5) prevalenciájára irányult. 2. Továbbá vizsgáltuk az APOA5 T-1131C, C56G, IVS3+G476A, T1259C alléljeinek és a variánsok által képzett haplocsoportoknak (APOA5*1, APOA5*2, APOA5*3, APOA5*4, APOA5*5) az elhízott és normál súlyú, egészséges gyermekek laborparamétereire gyakorolt hatását (triglicerid, koleszterin, BMI). 3. Megfigyeléseink egy részét az APOA5 génben található négy variáns minor alléljeinek, másik részét az általuk képezett haplocsoportoknak (APOA5*1, APOA5*2, APOA5*3, APOA5*4, APOA5*5) a gyermekkori elhízás kialakulásában betöltött esetleges kockázati, hajlamosító szerepének felderítése képezte. 20

21 3.2 GCKR gén polimorfizmusainak vizsgálata 1. Az elhízott gyermekpopuláción végzett vizsgálataink másik fő tárgyát a glükóz metabolizmusban kulcs szerepet játszó glükokináz regulátor (GCKR) gén két gyakori, természetes variánsának (rs , rs780094) alléleloszlása képezte. 2. További megfigyeléseket végeztünk annak kiderítésére, hogy a GCKR génben található két eltérés (rs , rs780094) a nemzetközi szakirodalomban leírtakhoz hasonlóan ellentétes hatást gyakorolnak-e a triglicerid és glükóz értékekre. 3. Végül vizsgálatainkkal arra kerestük a választ, hogy az rs és az rs variánsok összefüggésbe hozhatóak-e emelkedett trigliceridszinttel illetve, hogy ezek a variánsok milyen összefüggést mutatnak a gyermekkori elhízás kialakulásával. 21

22 4 BETEGEK ÉS MÓDSZEREK 4.1 A vizsgált betegpopuláció jellemzői Az APOA5 gén vizsgálatában 232 elhízott gyermek (138 fiú, 94 lány, kor: 13,7 ± 0,16 év, BMI: 31,8 ± 0.34 kg/m 2 ) és 137 egészséges, normál testsúlyú kontroll (58 fiú, 79 lány, kor: 14,8 ± 0,19 év, BMI: 20,0 ± 0,25 kg/m 2 ) gyermek vett részt; míg a GCKR gén esetében 221 elhízott gyermek (122 fiú, 99 lány, kor: 13,5±0,16 év, BMI: 31,5±0,32 kg/m 2 ) és 115 kontroll egyén (56 fiú, 59 lány, kor: 14,1±0,21 év, BMI: 20,2±0,32 kg/m 2 ) mintájával dolgoztunk. Munkánk során a rendelkezésünkre álló DNS vizsgálati minták egy része elfogyott, ez magyarázza az egyes polimorfizmusok esetén a különböző mintaszámokat. A vizsgálatból kizártuk azokat az egyéneket, akik bármiféle krónikus megbetegedésben szenvedtek, endokrinológiai, táplálkozási zavart, növekedésbeli és renális problémákat vagy hormonális elhízást mutattak. A vizsgálatban résztvevők közül egyik egyén sem kapott gyógyszerkezelést. Az elhízott és kontroll gyermekminták a Szegedi és a Pécsi Gyermekklinika Endokrinológiai Osztályáról származnak. A vizsgált alanyok DNS mintái és klinikai adatai egy helyi biobankban lettek elhelyezve. A vizsgált gyermekek szülei írásban engedélyezték gyermekeik mintáinak felhasználását genetikai vizsgálatokhoz és adataik analízisét. A helyi biobank létrejötte az Egészségügyi Tudományos Tanács és Kutatásetikai Bizottság engedélye alapján valósult meg. 4.2 Antropológiai mérések és klinikai paraméterek Az antropológiai méréseket azonos mértékegységben végeztük. A testmagasságot 0.1 cm pontosságú Holtain stadiométerrel, a testsúlyt 0,1 kg pontosságú mérlegkaron végeztük. A BMI értékét a mért testsúly és a magasság négyzetének hányadosával (kg/m 2 ) kaptuk meg. Az éhgyomri vérminták levétele és megfelelő előkészítése után a triglicerid és a totál koleszterin paraméterek mérését Roche Modular automatikus rendszer (Hoffmann-La Roche Ltd, Basel, Switzerland) segítségével végeztük. Azokat a gyermekeket tekintettük hipertrigliceridémiásnak (HTG), akiknek a triglicerid szintje egyenlő vagy nagyobb értéket mutatott a gyermekeknél leírt határértékkel (TG 1.1 mmol/l) (127). 22

23 4.3 Elhízás definiálása Az elhízás biztos felismeréséhez antropometriai mérési adatokra van szükség. Az elhízás egyik legalapvetőbb diagnosztikai paramétere a testtömeg index (BMI), amely a kg-ban kifejezett testsúly és a méterben kifejezett testmagasság négyzetének a hányada (kg/m 2 ). Egy gyermeket akkor tekintettünk elhízottnak, ha a BMI értéke túllépte a Cole és mtsai. által közölt határértéket, amely a 18 éves korra nézve 25 (19). 4.4 Genotípus elemzés A DNS-izolálást EDTA-val alvadásgátolt vérmintákból rutin kisózásos módszerrel végeztük. A DNS-analízis kiindulópontja a polimeráz láncreakció (PCR) útján végzett amplifikáció volt, mely standard módon az adott szekvenciára specifikus, szintetikus oligonukleotid primerek, Taq polimeráz, dntp, reakció puffer és az adott genomiális DNStemplát jelenlétében játszódott le. A vizsgált összes variáns esetén a PCR reakció 50 µl végtérfogata 5 µl reakció puffert (500 mm KCl, 14 mm MgCl 2, 10 mm Tris-HCl, ph 9,0), 1 µl 50 mm MgCl 2 -ot, 0,2 mm dntp-t, 1 Unit egység Taq polimerázt, 0,2 mm adekvát specifikus primer párt és 1 µg DNS templátot tartalmazott. A vizsgált SNP-ket tartalmazó szekvenciák amplifikációjához MJ Research PTC 200 PCR készüléket (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) alkalmaztunk. A PCR termékek analizálása gélelektroforézis, etidium bromidos festés és UVmegvilágítás segítségével történt. A polimeráz láncreakciót követően a különböző génekben (APOA5, GCKR) lévő eltérések esetén a mutációk/polimorfizmusok meghatározására RFLP módszert alkalmaztunk. Ennek során a felsokszorozott DNS szakaszokat restrikciós endonukleázokkal hasítottuk. Mindegyik módszert úgy terveztük, hogy a restrikciós enzimek egy obligát hasító hellyel rendelkezzenek az amplifikált fragmentumon belül, így ellenőrizhettük az enzimatikus emésztés eredményességét. Az analízisekre etikai bizottsági engedély birtokában került sor. 23

24 4.4.1 APOA5 gén polimorfizmusainak detektálása haplocsoport analízishez A genotípus analízishez a haplocsoportokat meghatározó négy variánst alkalmaztuk. A PCR reakció kivitelezése a négy SNP esetében 35 cikluson keresztül az alábbi kondíciók alapján történt: kezdeti denaturáció 96ºC-on 2 percig, denaturáció 96 o C-on 20 másodpercig, primerkötődés 60 o C-on 20 másodpercig, DNS-szintézis 72 o C-on 20 másodpercig, majd befejező lépésként további DNS-szintézis 72 o C-on 5 percig. A T-1131C polimorfizmus amplifikációjához a következő primer párokat alkalmaztuk: a forward primer: 5 -CCC CAG GAA CTG GAG CGA AATT-3 és a reverse primer: 5 -TTC AAG CAG AGG GAA GCC TGT A-3. Az amplifikált DNS szakaszokat allélspecifikus, obligát hasítóhellyel rendelkező restrikciós endonukleázzal emésztettük. Mismatch primertervezés során a forward primerbe egy hamis timidint vittünk be a normál guanin helyére, melynek következtében egy mesterséges TruI felismerő helyet kaptunk. A 2 órán keresztül tartó 65 -os TruI enzimmel történő emésztési folyamat után a keletkezett restrikciós fragmenteket 3%-os, etídium-bromidot tartalmazó agaróz gélen futtattuk meg és UV transzilluminator segítségével detektáltuk (Uvitec, Cambridge, UK). Normál esetben TT genotípusnál 22, 109, 267 bp hosszúságú terméket detektáltunk. Heterozigótáknál (TC genotípus) 22, 109, 267, 289 bp, homozigóták esetén (CC genotípus) 109, 289 bp nagyságú szakaszok keletkeztek. Az IVS3+G476A SNP-t tartalmazó szekvencia amplifikációjához a következő primereket terveztük: forward: 5 -CTC AAG GCT GTC TTC AG-3 és reverse: 5 -CCT TTG ATT CTG GGG ACT GG-3 (Metabion, Planegg-Martinsried, Germany). A 15 µl PCR terméket 1 Unit egységnyi MnII restrikciós endonukleázzal emésztettük (Fermentas, Burlington, ON, Canada) 37 o C on egy éjszakán keresztül. A homozigóta, normál egyéneknél (GG genotípus) az emésztés 25, 114 és 141 bp hosszúságú termékeket, a homozigóta variáns esetén (AA forma) 25, 41, 73 és 141 bp nagyságú restrikciós fragmenteket eredményezett. A T1259C polimorfizmust a következő primer párokkal detektáltuk: 5 -TCA GTC CTT GAA AGT GGC CT -3 (sense) és 5 -ATG TAG TGG CAC AGG CTT CC -3 (antisense). A PCR termék BseGI (Fermentas, Burlington, ON, Canada) enzimmel történő emésztése (37 o C-on egy éjszakán keresztül) a normál (TT) genotípus esetén 122 és 165 bp hosszúságú termékeket, míg a homozigóta formánál (CC) 35, 87 és 165 bp nagyságú restrikciós fragmenteket eredményezett. A C56G polimorfizmust tartalmazó szekvencia amplifikációjához az 5 -AGA GCT AGC ACC GCT CCT TT-3 szekvenciájú forward és 5 -TAG TCC CTC TCC ACA GCG TT-3 szekvenciájú reverse primereket terveztük. A PCR termék emésztése Cfr13I restrikciós 24

25 enzimmel történt 65 C-on 2 órán keresztül (Fermentas, Burlington, ON, Canada). Az emésztési folyamat végén a normál CC homozigóta minták esetén 79, 177 bp hosszúságú fragmentek, míg a homozigóta GG variánsoknál 26, 79 és 151 bp nagyságú szakaszok keletkeztek A GCKR gén polimorfizmusainak detektálása A GCKR gén rs polimorfizmusának detektálásához a következő primer párokat terveztük: forward 5 -TGC AGA CTA TAG TGG AGC CG-3 és reverse 5 -CAT CAC ATG GCC ACT GCT TT-3 ; míg a GCKR rs polimorfizmust tartalmazó szekvencia amplifikációjához a 5 -GAT TGT CTC AGG CAA ACC TGG TAG-3 szekvenciájú forward és 5 -CTA GGA GTG GTG GCA TAC ACC TG-3 bázissorrendű reverse primerpárt alkalmaztuk. Az rs SNP esetén az amplifikáció kivitelezése 35 cikluson keresztül az alábbi kondíciók alapján történt: kezdeti denaturáció 96 C-on 2 percig, denaturáció 96 C-on 20 másodpercig, primerkötődés 60 C-on 20 másodpercig, DNS szintézis 72 C-on 30 másodpercig; majd befejező lépésként további DNS-szintézis 72 C-on 5 percig. Az rs SNP esetén a kezdeti denaturáció, a DNS szintézis és a befejező DNS szintézis kondíciói azonosak voltak az előző polimorfizmus kondícióival. Ugyanakkor a DNS szakasz felsokszorozása 30 cikluson keresztül zajlott le, illetve a denaturáció 96 C-on 20 másodpercig, a primerkötődés 62 C-on 30 másodpercig tartott. A felsokszorozott DNS szakaszokat az rs esetén HpaII, míg az rs esetén PscI restrikciós endonukleázzal hasítottuk (Fermentas, Burlington, ON, Canada). Az rs SNP-t tartalmazó amplifikált szakaszok emésztése (231 bp), normál CC genotípus esetén 18, 63, 150 bp hosszúságú fragmenteket eredményezett, a homozigóta TT genotípusú minták esetén 18 és 213 bp nagyságú szakaszokat, míg a heterozigóta genotípusoknál 18, 63, 150, 213 bp nagyságú termékeket mutatott. Az rs (427 bp) SNP-t tartalmazó szekvenciák emésztése során a normál GG genotípus esetében 62, 177, 188 bp nagyságú szakaszokat kaptunk, a homozigóta AA genotípusnál 62, 365 bp, míg heterozigóta genotípusnál 62, 177, 188, 365 bp hosszúságú restrikciós fragmenteket detektáltunk. 25

26 4.5 Statisztikai elemzés A statisztikai analíziseket az SPSS 15.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) programcsomaggal végeztük. Minden kvantitatív analízis eredménye átlag ± SEM (standard error of mean) formájában van feltüntetve. A változók eloszlását Kolmogorov-Smirnov-teszt segítségével állapítottuk meg. Normál eloszlás esetén paraméteres próbákat, míg a nem-normál eloszlású változóknál nem-paraméteres próbákat alkalmaztunk. Az egyes csoportok paramétereinek vizsgálatához Student-féle páros t-tesztet alkalmaztunk normál eloszlású, folytonos változók esetében, míg a nem-normál eloszlású változók esetén Mann-Whitney-teszttel dolgoztunk. A klinikai paraméterek különbségeinek összehasonlításához a betegcsoport és a kontroll csoport között szintén a Mann-Whitney-tesztet használtuk. Az APOA5 gén esetében, a variánsok haplotípus-csoportba való osztályozásához a HAPSTAT 3.0 verziójú programot alkalmaztuk ( Az allélok (APOA5 és GCKR gén variánsai) és a haplotípus-csoportok (APOA5 gén) frekvenciáit (direkt változók) χ 2 -teszt segítségével hasonlítottuk össze a beteg és a kontroll csoportok között. A kvantitatív paraméterek haplotípus-csoportok (APOA5 gén) közötti összehasonlításait ANOVA teszttel végeztük. Az elhízás és a vizsgált genetikai variánsok, illetve haplotípuscsoportok között fennálló összefüggés feltárására logisztikus regressziós analízist alkalmaztunk (korreláció analízis és esélyhányadosok). A szignifikancia (p) határértéke p= 0.05, míg a konfidencia intervallum (CI) 95%-os volt minden egyes számításnál. 4.6 A linkage disequilibrium (LD-blokk) számítások A vizsgált variánsok közötti LD meghatározásához az SNP genotípus adatokat a HapMap adatbázisából töltöttük le (HapMap Data Rel 24 / phase II Nov 08. on NCBI B36 assembly dbsnp b126), és az LD számításokat a HaploView 4.2 szoftver segítségével végeztük. 8. ábra. Az LD-blokk a két GCKR SNP esetében. 26

27 5 EREDMÉNYEK 5.1 Apolipoprotein A5 gén genotípus és haplocsoport (APOA5) analízise A vizsgált elhízott és kontroll gyermekek fő klinikai és laboratóriumi paramétereit a 4. táblázatban foglaltam össze. A BMI, a triglicerid, a totál koleszterin szintek mind szignifikánsan emelkedett értéket mutattak az elhízott gyermek csoportban viszonyítva az egészséges, normál testsúlyú kontroll gyermekekhez (p<0.05). 4. táblázat: Az elhízott és kontroll gyermek csoport főbb klinikai és laboratóriumi paraméterei. Elhízott gyermekek n=232 Kontroll gyermekek n=137 Nem (fiú/lány) 138/94 58/79 Kor (évek) fiú/lány BMI (kg/m 2 ) fiú/lány Szérum triglicerid (mmol/l) fiú/lány 13.7± ± ±0.25/13.7±0.21 # 14.2±0.28/15.2±0.25 # 31.8±0.34* 20.0± ±0.45/31.9±0.52 # 20.0±0.38/20.0±0.32 # 1.27±0.03* 0.88± ±0.04/1.26±0.05 # 0.88±0.03/0.87±0.02 # Összkoleszterin (mmol/l) fiú/lány átlagok±sem 4.42±0.06* 4.07± ±0.07/4.33±0.08 # 3.93±0.08/4.17±0.08 # * p <0.05 vs. egészséges, normál testsúlyú gyermekekhez viszonyítva. # nincs nembeli különbség Az egyes APOA5 variáns és a triglicerid szintek közötti összefüggéseket a 5. táblázat mutatja. A C56G polimorfizmust kivéve, az összes minor allél (-1131C, az IVS3+476A és a 1259C) összefüggést mutatott emelkedett triglicerid szinttel mind az elhízott és kontroll gyermek csoportban, összehasonlítva a hordozó és a normál genotípusú alanyok triglicerid értékeivel. A BMI és a összkoleszterin szinteket tekintve, nem kaptunk variáns-függő különbségeket. 27

28 5. táblázat: Az egyedi genotípusok triglicerid, összkoleszterin és BMI értékei a elhízott és kontroll gyermekekben. Genotípus T-1131C IVS3+G476A T1259C C56G (TT) (TC+CC) (GG) (GA+AA) (TT) (TC+CC) (CC) (CG+GG) n=177 n=55 n=184 n=48 n=184 n=48 n=203 n=29 BMI (kg/m 2 ) 31.9± ± ± ± ± ± ± ±0.82 Szérum triglicerid (mmol/l) 1.17± ± ± ± 0.10 * 1.22± ± 0.10 * 1.29± ± 0.06 Összkoleszterin (mmol/l) 4.37± ± ± ± ± ± ± ±0.17 Elhízott gyermekek (TT) Genotípus n=121 (TC+CC) n=16 (GG) n=125 (GA+AA) n=12 (TT) n=118 (TC+CC) n=19 (CC) n=116 (CG+GG) n=21 BMI (kg/m 2 ) 19.9± ± ± ± ± ± ± ±0.69 Szérum triglicerid (mmol/l) 0.83± ± ± ±0.07 # 0.86± ±0.07 * 0.88± ±0.07 Összkoleszterin (mmol/l) 4.05± ± ± ± ± ± ± ±0.14 Kontroll gyermekek átlagok±sem *p<0.05, # p<0.01, p<0.005 vs. normál homozigóta genotípushoz viszonyítva (a T1131C és a T1259C esetén TT, az IVS3+G476A esetén GG, a C56G esetén CC) 28

29 A 6. táblázat tartalmazza az APOA5 variánsok alléleloszlását, allélfrekvenciáját és a logisztikus regressziós analízis eredményeit. Az APOA5 gén variánsainak allélfrekvenciái követték a Hardy-Weinberg ekvilibrium szabályát mindkét csoportban. A 1131C allélikus variáns prevalenciája szignifikánsan emelkedett értéket mutatott az elhízott csoportban összehasonlítva az egészséges, normál testsúlyú egyénekkel. A regressziós analízis eredményei kimutatták, hogy a 1131C rizikó allél jelentős független kockázati faktort jelent a gyermekkori elhízás kialakulására. Az IVS3+476A allél frekvenciája az elhízott gyermekekben szignifikánsan magasabb értéket mutatott a normál testsúlyú, egészséges csoporthoz viszonyítva. Ennek ellenére az IVS3+476A allél hordozása nem jelentett rizikófaktort az elhízás kialakulására nézve. A 1259C és 56G allélikus variáns eloszlása nem mutatott szignifikáns különbséget az elhízott és kontroll gyermekek között, és a két polimorfizmus jelenléte nem mutatott korrelációt az elhízással (6. táblázat.). A haplocsoport analízis eredményeit a 7. táblázatban foglaltam össze. A haplocsoportokat az analízis előtt az APOA5 gén négy haplocsoportokat meghatározó variánsai alapján osztályoztuk a HAPSTAT 3.0 verziójú program segítségével. Kíváncsiak voltunk arra, hogy a vizsgált négy APOA5 haplotípus milyen hatást gyakorolhat a lipid paraméterekre és a BMI-re. A vizsgálat eredményei azt mutatták, hogy az APOA5*2 és APOA5*4 haplotípus variáns hordozása szignifikáns trigliceridszint emelkedést eredményez mindkét csoportban. Ezzel ellentétben, az APOA5*5 haplotípus jelentős trigliceridszint-csökkentő hatást mutatott. Egyik haplocsoport esetén sem találtunk haplotípus-függő változást a BMI és össz koleszterin szinteket tekintve (7. táblázat). Az APOA5 haplotípusok frekvenciáját a vizsgált két csoportban a 7. és 8. táblázatban tüntettem fel. Az elhízott gyermekekben az APOA5*2 prevalenciája 2.59-szer nagyobb, míg az APOA5*5 előfordulási gyakorisága 3.88-szor kisebb értéket mutat, mint a kontroll gyermekekben (7. táblázat, 8. táblázat). A logisztikus regressziós analízis kimutatta, hogy az APOA5*2 haplotípus gyermekekben erősen hajlamosít az elhízás kialakulására. Ezzel ellentétben, az APOA5*5 haplotípus védő fakorként hat az elhízással szemben (8. táblázat). 29

30 6. táblázat: Az APOA5 variánsok prevalenciái és az elhízással kapcsolatos esélyhányados értékei (odds ratio; OR) 95%-os konfidencia intervallumon (CI). APOA5 variánsok T-1131C (TC+CC) hordozó IVS+G476A (GA+AA) hordozó T1259C (TC+CC) hordozó C56G (CG+GG) Kontroll gyermekek n= (0.12) (0.12) (0.13) (0.15) hordozó # Korrigálva korra, nemre és összkoleszterinre. Elhízott gyermekek p n=232 *p<0.05 vs. egészséges, normál testsúlyú gyermekcsoporthoz viszonyítva. Nem-korrigált modell 95% CI p OR Korrigált modell 95% CI p OR# 55 (0.24) 0.13* ( ) ( ) (0.19) 0.11* ( ) ( ) (0.21) ( ) ( ) (0.13) ( ) ( )

31 7. táblázat: Az APOA5 haplotípusok triglicerid, összkoleszterin és BMI értékei az elhízott és kontroll csoportban. APOA5*1 Haplotípus variánsok (TGTC) APOA5*2 (CACC) APOA5*3 (TGTG) APOA5*4 (CGTC) APOA5*5 (TGCC) Frekvencia BMI (kg/m 2 ) 31.6± ± ± ± ±1.13 Szérum triglicerid 1.18± ±0.12^ 1.17± ± 0.15 # 0.91±0.08 (mmol/l) Összkoleszterin 4.40± ± ± ± ±0.23 (mmol/l) Elhízott gyermekek Frekvencia BMI (kg/m 2 ) 19.5± ± ± ± ±1.32 Szérum triglicerid 0.84± ± 0.06 # 0.78± ± ±0.03 (mmol/l) Összkoleszterin 4.08± ± ± ± ±0.27 (mmol/l) Kontroll gyermekek átlagok ±SEM, ^p=0.001; # p=0,0001; p= 0.026; p=0.002; p=0.036 vs. APOA5*1 haplotípushoz viszonyítva. Az analízishez használt SNP-k sorrendje: T-1131C, IVS3+G476A, T1259C, C56G. (A variánsok aláhúzva). 31

32 8. táblázat: Az APOA5 haplotípusok prevalenciái és az elhízással kapcsolatos esélyhányados értékei (OR) 95%-os konfidencia intervallumon (CI). Haplotípus variánsok Kontroll gyermekek n=137 Elhízott gyermekek p n=232 Nem-korrigált modell 95% CI p OR Korrigált modell 95% CI p OR # APOA5*1 89 (0.65) 135 (0.58) ( ) ( ) 0.32 APOA5*2 8 (0.058) 35 (0.15)^ ( ) ( ) APOA5*3 19 (0.14) 29 (0.13) ( ) ( ) 0.49 APOA5*4 7 (0.051) 16 (0.069) ( ) ( ) 0.51 APOA5*5 9 (0.066)^ 4 (0.017) ( ) ( ) 0.02 # Korrigálva korra, nemre és összkoleszterinre. ^p<0.05 vs. egészséges, normál testsúlyú kontroll gyermek csoporthoz viszonyítva. 32