Vérsejtszámlálás. 1. Az emberi vér alakos elemei. Vörösvértestek

Átírás

1 Vérsejtszámlálás 1. Az emberi vér alakos elemei vörösvértestek (vvt, angol: RBC = red blood cells) fehérvérsejtek (fvs, angol: WBC = white blood cells) vérlemezkék (trombociták, angol: PLT = platelet, thr = thrombocyte) limfociták granulociták vérlemezkék monociták vörösvértestek granulociták A vérben az alakos elemek térfogati aránya a hematokrit érték, ez normálisan 36 47% közötti. Vörösvértestek a vér alakos elemeinek több, mint 99%-át teszik ki a vöröscsontvelőben képződnek az érett vörösvérsejtnek már nincs sejtmagja (ezért vörösvértest) érésük közben hemoglobin-molekulákat szintetizálnak, így oxigén szállítására képesek részt vesznek a CO2 szállításában is számuk felnőtt nő vérében 4, db/liter, férfiakban valamivel magasabb, db/liter átmérőjük 7 8 µm átlagos élettartamuk 120 nap, a lépben és a májban bomlanak le. 1

2 Fehérvérsejtek valódi sejtek, sejtmaggal rendelkeznek a szervezet védekezési mechanizmusaiban játszanak szerepet számuk átlagosan db/liter, de a db/liter is normális 3 fő típusuk: granulociták, monociták és limfociták egészséges ember fehérvérsejtjeinek 50 70%-a granulocita, 20 40%-a limfocita és 2 8%-a monocita granulociták a citoplazmában előforduló, nagy mennyiségű granulum (szemcse) a szemcsékben tárolt anyagok szerepet játszanak a gyulladásos, illetve allergiás reakciókban A fiatal granulociták patkó alakú sejtmagja a sejtek érésével párhuzamosan lebenyezetté válik. Hisztológiai festési tulajdonságaik alapján különíthetőek el a neutrofil (semleges), bazofil (lúgos) vagy eozinofil (savas) granulociták. neutrofil granulociták ezekből van a legtöbb ( db/l). a keringésben eltöltött féléletidejük rövid (átlagosan kb 6 óra), ezért naponta igen nagy mennyiségben keletkeznek. A bakteriális fertőzések elleni sejtes védelem alapját biztosítják, nagy mennyiségben képesek a szövetekbe is belépni. Granulumaikból antimikrobiális hatású fehérjék, proteolitikus hatású és oxidatív szabadgyökök előállítására képes enzimek szabadulhatnak fel. Fagocitáló képességük miatt mikrofágoknak is nevezik őket. eozinofil granulociták vérben normálisan csak 1, db/liter allergiás reakciók esetén több elsősorban a lég-, húgy- és bélutak nyálkahártyájában találhatóak, ahol a paraziták elleni védekezésben játszanak szerepet. bazofil granulociták granulumaikban heparint, hisztamint és más gyulladásmediátorokat tartalmaznak számuk alacsony (< db/liter) szerepük van: az azonnali túlérzékenységi immunreakciókban és az anafilaxiás rohamok kiváltásában limfociták viszonylag kicsik citoplazmájukat a kerek sejtmag szinte kitölti számuk normálisan 1, db/liter között az adaptív immunválasz kialakításában vesznek részt 2 fő csoportjuk: a T limfociták a sejtes immunválasz, a B limfociták a 2

3 humorális immunválasz kialakításában és az ellenanyagok termelésében játszanak szerepet. prekurzor sejtjeik a vörös csontvelőben alakulnak ki a T sejtek érése a csecsemőmirigyben (thymusban) a B sejtek érése a Bursa-ekvivalens nyirokszervekben a limfociták döntő többsége a nyirokszervekben tartózkodik és a nyirokkeringésen keresztül jut a véráramba a perifériás keringésben csak mintegy 2%-uk található monociták a fehérvérsejtek mintegy 2 8%-a ( db/liter) sejtmagjuk nagy, vese alakú A vörös csontvelőből a véráramba jutnak, ahonnan mintegy 72 óra elteltével az érfalakon átlépve szöveti makrofágokká alakulnak (ilyenek pl. a máj Kupfer sejtjei, az agyi mikroglia sejtek vagy a tüdőalveolusokban található makrofágok). Aktivációjukat a T limfociták által szekretált limfokinek indítják meg, aminek hatására idegen anyagokat, így pl. baktériumokat tudnak fagocitálni és számos gyulladás-mediátort (pl. prosztaglandin E-t) szabadítanak fel. A vérlemezkék a megakariociták sejthártyával körülvett sejtplazmatöredékei, sejtmagjuk nincs szintén a vöröscsontvelőben keletkeznek méretük 2 5 µm az érpályából kilépve és az egyenetlen érfalon lebomlanak, a véralvadásban van jelentős szerepük átlagos trombocita szám db/liter 1,4 4, db/liter normális 3

4 2. Statisztikai háttér Több, azonos térfogatban számoljuk majd az egyes térfogatokba eső sejtek számát. Ha a sejtek egymástól függetlenül helyezkednek el az oldatban, azaz (1) elég ritkák ahhoz, hogy egymás helyét a térfogatban ne befolyásolják lényegesen, és (2) az oldatot elég jó felráztuk és (3) a sejtek nem ragadnak össze és nem is taszítják egymást akkor az egy-egy térfogatban talált sejtek száma Poisson eloszlást követ Poisson eloszlás Mit ír le: Sok független, ritka esemény közül hány következik be egy adott időintervalumban, vagy hány kerül egy adott téri intervallumba. Annak a valószínűsége, hogy k következik be: Itt f(k, λ) = λk e λ λ > 0 az eloszlás paramétere k = 0, 1, 2, 3,... a bekövetkezések száma. e = 2, a természetes alapú logaritmus alapja, Euler-szám. k! = k faktoriális A λ paraméterű Poisson eloszlás Jele: Pois(λ) Várható értéke: λ Szórásnégyzete: λ Szórása: λ A Poisson eloszlás λ = 1, λ = 3 és λ = 10 esetén k! 4

5 Közelítés normális eloszlással Nagy λ (kb. λ > 1000) esetén a Poisson eloszlás jól közelíthető λ várható értékű λ szórásnégyzetű normális eloszlással. Ez a közelítés már λ > 10 esetén is elég jó, ha folytonossági korrekcióként N(λ, λ) helyett N(λ 0.5, λ). Kapcsolat a binomiális eloszlással Egy n és p paraméterű binomiális eloszlás azt adja meg, hogy egy p valószínűségű esemény n független próbálkozásból milyen valószínűséggel következik be éppen k- szor: Jele: Binom(n, p) P (X = k) = ( ) n p k (1 p) n k k 5

6 A ritka események törvénye : Binomiális eloszlások olyan sorozata ahol a várható érték (np) állandó és n a λ = np paraméterű Poisson eloszláshoz tart. A λ = 4 paraméterű Poisson eloszláshoz közeledő binomiális eloszlások Ha n 20 és p 0.05, akkor Binom(n, p) elég jól közelíthető Poisson eloszlással. Ha n 100 és np 10, akkor nagyon jól. Konfidenciaintervallum a λ paraméterre Guerriero és mások (2009): Poisson eloszlás λ paraméterére 95%-os konfidenciaintervallum: [ ( N L ), N 1 ( N L )] N 1 ahol N az események száma, L az intervallum hossza, N/L az egységnyi intervallumra jutó események száma. Alkalmazási feltétel: N 15 Így ha N sejtet számoltunk, ( akkor ez szerint ( a sejtek gyakorisága 95% valószínűséggel a végeredmény N 1 )-szerese és N 1 )-szerese közé esik. Például ha 241 sejtet számoltunk, akkor ± = ± ±13% 6

7 3. Vérsejtszámlálás Eszközök ujjbegy fertőtlenítéshez spray steril, egyszer használatos injekciós tű gumikesztyű vatta (vér törlése ujjbegyről) automata pipetták (1000 és 200 µl), pipettahegyek, Eppendorf csövek (1.5 ml, fedeles) Hayem oldat (hipertóniás, vvt-k zsugorodnak) Türk oldat (vvt-t hemolizálja, fvs magját metilénkékkel festi) (Türk-oldat: 0,5 %-os ecetsav metilénkékkel színezve) Bürker kamra mikroszkóp (40 nagyítás) Bürker kamra Számláló kamra H alakú vájat Fedőlemez Csavar két 3x3 mm-es számlálókamra vonalakkal 3x3 részre osztva a részeken belül közeli vonalak 1/20 mm távolságra, távoliak 1/5 mm-re a fedőlemez alatt 1/10 mm magas hely van 7

8 Teendők Elővigyázatosság: csak saját vérrel dolgozik! Ha segíteni kell: gumikesztyű Bürker kamra előkészítése mosás csapvízzel, alkohollal, szárítás fedőlemez rögzítése bal kéz középső ujj ujjbegy fertőtlenítése steril tűvel 2 3 mm mélyen megszúr első csepp vér letörlése száraz vattával pipetták P1000 pipettán: 10 µl a beállított szám a térfogat P200 pipettán: 1 µl a beállított szám a térfogat vvt: 1:100 higítás Hayem oldat 990 µl (P1000 pipetta, számot 099-re) Vér: 10 µl fvs: 1:10 higítás Türk oldat: 180 µl (P1000/018 vagy P200/180) Vér: 2 10 µl keverés: Eppendorfot lezár, 2 percig rázza oldatot a Bürker kamra felső szélén az üvegcsík és fedőlemez közé, a számlálókamrába szivárogtat (pipettával 6 µl) Bürker kamra a mikroszkóp alá szűk diafragma, süllyesztett kondenzor a kamra vonalkáit élesen lássuk 40 nagyítás vvt számolás: mindkét számlálókamrában kis négyzetben fvs számolás: mindkét számlálókamrában nagy négyzetben Bürker kamra elmosása 8

9 Számolás Becslés: adatok a négyzetekbeli sejtszámok x 1,..., x 40 vvt: x az x 1,..., x 40 átlaga. Ez egy négyzetre vonatkozik, azaz = mm3 oldatra 1 mm 3 = 1 10 liter szoros higítás volt x = x 0, a literenkénti szám nő: 4,5 4, a normál férfi: 4,5 5, a normál SI előtag: =tera (T), ezért néha T/L mértékegységgel adják meg (L vagy l a liter) fvs: x az egy négyzetbeli térfogatra vonatkozó átlag ez = mm3 oldatban volt 1 mm 3 = liter 10-szeres higítás volt x = x 2, a literenkénti szám a normál SI előtag: 10 9 =giga (G), ezért néha G/L mértékegységgel adják meg Az egy-egy négyzetben talált sejtszámok szórásnégyzete: s 2 = Poisson eloszlás esetén s 2 = λ = x kellene hogy legyen. Hasonlítsa össze az s 2 és x értékeket (vvt-re és fvs-re is) (xi x) 2 Ha a sejtek csoportosulnak (például összeragadnak), akkor s 2 > x lehet. Ha a sejtek taszítják egymást, akkor s 2 < x lehet. Ebbe az irányba hat ha túl sok sejt van, ezért nem elhanyagolható a méretük. n 1 9

10 4. Vércsoport AB0 vércsoport-rendszer vvt felületén antigén: A vagy/és B. Ebből 4 vércsoport: 0 A B AB Vérplazmában lehet anti-a vagy/és anti-b antitest. A saját vvt-ken előforduló (A,B) antigének elleniek nincsenek, de a többi antigén elleni antitestek általában jelen vannak. Vérátömlesztéskor: anti-x ne találkozzon az X antigénnel. teljes vér adása ritka, vvt és plazma általában külön Az AB0 mellett sok más vércsoport-rendszer is létezik (kb 30). AB0 vércsoport megállapítása ezért csak a kezdet, a páciens vére és a készítmény egymásra hatását alkalmazás előtt tesztelni kell Bombay-jelenség: ritka, de előfordul, hogy az A és B antigének közös alapanyaga, a H antigén hiányzik. Ekkor a vércsoport nullás, noha genetikailag nem feltétlenül az. A normális nullások vérében van H antitest, ezért a Bombay fenotípusúak csak Bombay fenotípusúaktól kaphatnak vért. Rh vércsoport-rendszer Rh vércsoport: D antigén (Rh+). Az Rh vércsoportrendszerben vannak még további antigének (kb 50), de a hétköznapi szóhasználatban az Rh+ vércsoportot a D antigénre használják. Rh embernek lehet anti-d antitestje, de nem feltétlenül van. Ha Rh+ vérrel találkozik, megjelenhetnek az anti-d antitestek. Rh anya anti-d antitestjei megtámadhatják az Rh+ magzat vörösvértestjeit. Szülőképes Rh nők ne kapjanak Rh+ vörösvértesteket Rh nő Rh+ magzattal: ha a magzat vére az anyáéba juthat (például szüléskor) anti-d-t kap, hogy ne kezdjen saját maga anti-d-t termelni (a következő magzat miatt). 10