A neutrofil granulociták és monociták fagocitózis indexe egészséges és preeclampsiás terhességben

Átírás

1 A neutrofil granulociták és monociták fagocitózis indexe egészséges és preeclampsiás terhességben Kövér Ágnes ÁOK VI. évfolyam Debreceni Egyetem Klinikai Központ Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika Témavezető: Dr. Lampé Rudolf

2 A preeclampsia 1. A humán terhesség legveszélyesebb megbetegedése Terhesség specifikus, multiszisztémás Világszerte vezető oka az anyai és magzati morbiditásnak és mortalitásnak A preeclampsia és az eclampsia évente az anyai halálesetek körülbelül 14%-áért felelős, ami nőt érint

3 A preeclampsia 2. Korábban egészséges nők terhességének 20. hete után kialakuló hypertonia és proteinuria Terhességi magas vérnyomás: legalább kétszer mért 140/90 Hgmm feletti érték esetén Fehérjevizelés (>300 mg/nap) A terhesség okozza, közvetlen oka nem ismert, de az utóbbi időben egyre inkább a károsodott anyai immunfunkció kerül előtérbe

4 Hajlamosító tényezők Életkor Elhízás Első terhesség Ikerterhesség Cukorbetegség Vesebetegség Korábban megállapított magas vérnyomás Genetikai háttér (protein C, protein S, antitrombin deficienciák, Leiden mutáció)

5 Szövődményei 1. Magzati szövődmények Koraszülés Tartós méhen belüli oxigénhiány Magzati retardáció Halál 2. Anyai szövődmények Görcs (eclampsia) HELLP szindróma Tüdővizenyő Lepényleválás Veseelégtelenség Májelégtelenség Stroke Halál

6 A preeclampsia pathogenezise A gyulladás központi szerepe. Tüneteinek megjelenése előtt megfigyelhető a károsodott vaszkuláris endothel funkció. A gyulladásos stimulus kialakításához: a nem megfelelő placentáció okozta hipoxia trofoblaszt mikropartikulumok útján gyulladás és endothel diszfunkció másik lehetséges okozója, az infekció is nagy valószínűséggel részt vesz a preeclampsia etiológiájában. A trofoblaszt mikropartikulumok és az infekciót okozó mikróbák eliminálásában fontos szerepe van a fagocitózisra képes fehérvérsejteknek.

7 Mikropartikulumok szerepe Egészséges terhesség során is, de preeclampsiában szignifikánsan nagyobb mennyiségű syntitiotrophoblast mikropartikulum (STMP) jut az anyai vérkeringésbe Kísérletesen bizonyított, hogy preeclampsiában ezen mikropartikulumok endothélsejt diszfunkciót okoznak Nem tisztázott, hogy a mikropartikulumok eliminálása hogyan történik, de a fagocita funkció jelentős szerepet játszhat benne

8 Fagocita funkció A fagocitózis olyan folyamat, melynek során az erre képes fehérvérsejtek (pl. neutrofil granulociták, monociták) részecskéket kebeleznek be. A fagocitózis funkciója kettős: egyrészt a bekebelezett mikróbák elpusztítása effektor funkció, másrészt kapocs a veleszületett és szerzett immunitás között. Partikulum Aktin filamentum Lizoszóma Fagolizoszóma Lizoszóma Opszonin Fagoszóma Stern et al.: Particle and Fibre Toxicology 2012, 9:20

9 Monociták szerepe Anyai és magzati vérben is jelen vannak, szerepet játszanak a preeclampsiában megfigyelhető megnövekedett vaszkuláris rezisztenciában. Nagy mennyiségben termel gyulladásos citokineket (pl.:il-6, IL-8). A.Victor Hoffbrand, John E.Pettit- Clinical Haematology, Mosby-Wolfe, London, 1994.

10 Granulociták szerepe Perifériás vérben aktiválódnak, az endothel-diszfunkció okozói Oxidatív stressz indukálta gyulladásos folyamatok Szuperoxid-anion termelés (nem csökken le, ellentétben az egészséges terheseknél mért értékkel) A.Victor Hoffbrand, John E.Pettit: Clinical Haematology, Mosby-Wolfe, London, 1994.

11 Tudományos előzmények, célkitűzés Egészséges terhességben és preeclampsiában a fehérvérsejtek fagocita funkciójának jellemzésére nincs ismert irodalmi adat. Célunk volt mind egészséges terhességben, mind preeclampsiában a fagocita funkció megfigyelése neutrophil granulocitákban és monocitákban. Egészséges terhesség fiziológiájának és preeclampsia pathofiziológiájának jobb megismerése.

12 Vizsgált betegek Egészséges, nem terhes (n=20) hasonló életkorúak és testtömeg indexűek, nem dohányoznak, gyógyszert rendszeresen nem szednek Egészséges terhes (n=25) hasonló életkorúak, gesztációs korúak, testtömeg indexűek, nem dohányoznak, gyógyszert rendszeresen nem szednek Preeclampsiás (n=25) vérnyomásuk egyenlő, vagy nagyobb, mint 140/90 Hgmm, egy nap kétszer mérve, min. 6 óra különbséggel, valamint vizeletük fehérjetartalma több, mint 0,3 gramm/24 óra

13 Vizsgálatban résztvevő személyek klinika adatai Nem terhesek (n=20) Egészséges terhesek (n=25) Preeclampsiások (n=25) P érték Életkor 29,1 3,2 29,0 5,2 29,3 3,4 >0,05 Gestatios kor a vérvételkor (hét) NA 36,4 1,2 36,1 0,9 0,05 Gestatios kor a szüléskor (hét) NA 40,4 1,7 37,6 2,6 <0,01* Terhesség előtti BMI (kg/m 2 ) NA 23,3 1,2 24,2 1,7 0,05 BMI a szüléskor (kg/m 2 ) 21,2 2,5 24,9 1,5 29,8 1,3 <0,05* Paritás a NA 0 (0-2) 0 (0-2) 0,05 Systolés vérnyomás a vérvételkor (Hgmm) 106,5 6,1 108,9 7,4 148,9 7,9 <0,001* Diastolés vérnyomás a vérvételkor (Hgmm) 66,9 5,4 70,9 7,3 100,7 7,4 <0,001* Újszülött súlya (gramm) NA , ,1 <0,01* Proteinuria a vérvételkor (vizeletben kereszt) a 0 (0-0) 0 (0-0) 2 (1-3) <0,001* a Az értékek átlagot jelölnek (tartomány). BMI= testtömeg-index (kg/m 2 ). NA: nem értelmezhető. *szignifikáns különbség egészséges terhesek és preeclampsiás terhesek között.

14 A vizsgálat menete 1. Fehérvérsejt szeparálás Plazma PMNLs Ficoll g/cm³ centrifugálás 24 C 400 G 30 min Ficoll 1,110g/cm³ PMNLs Vvt. PMNLs: polimorfonukleáris sejtek: monocita, granulocita; Vvt: vörösvértest

15 2. Sejtek kitapasztása Sejttenyésztő kamra: granulocyták és monocyták kitapasztása Sejttenyésztő kamra 3. Zymosan hozzáadása és fixálás Zymosan A hozzáadása, mely jelölve van fluorescein- isothiocyanate-tal(fitc) Opszonizált fagocitózist indukál Sejtek fixálása tárgylemezre 4%-os Paraformaldehid oldattal Paraformaldehid oldat

16 4. Festés 4.1 Granulocyták festése DAPI-t tartalmazó fedőmédiummal sejtmagok festése (DAPI: 4 6 -diamidino-2-fenilindol) 4.2 Monocyták festése Kettős antitest jelölés (indirekt): A monocita specifikus antitestet (egérben termeltetett) anti humán CD 14+ Egér IgG ellenes fluoreszcensen jelölt (Texas Red) másodlagos antitest Fedés

17 5.Kiértékelés Kiértékelés: Fluoreszcens mikroszkóppal történt Fagocitózis index= Fagocitált részecskék száma 100 Statisztikai próba: kétmintás t-próba, szignifikanciaszint: p<0,05

18 Granulociták Egészséges nem terhes Egészséges terhes Preeclampsiás (kontroll) Zöld: fagocitált zymosan részecskék; kék: granulociták sejtmagja

19 Monociták Egészséges nem terhes Egészséges terhes Preeclampsiás (kontroll) Zöld: fagocitált zymosan részecskék; kék: monociták sejtmagja; piros: monociták sejthártyája

20 Fagocitózis index Neutrofil granulociták fagocitózis indexe 5 4 * * p<0,001 (b vs. a) # p<0,001 (c vs. b, c vs. a) 3 2 # Egészséges nem terhes Egészséges terhes Preeclamsiás terhes 1 0 a b c

21 Fagocitózis index Monociták fagocitózis indexe 5 * p<0,001 (b vs. a) 4 * # p<0,001 (c vs. b, c vs. a) 3 2 # Egészséges nem terhes Egészséges terhes Preeclamsiás terhes 1 0 a b c

22 Konklúzió I. Egészséges terhességben mindkét vizsgált fehérvérsejt típus fagocita funkciója szignifikánsan csökkent az egészséges nem terhes kontrollokéhoz képest. Ez egy védekező mechanizmus lehet a magzat, mint hemiallograft érdekében, az anyai immunszuppresszió jeleként. Magyarázatot adhat arra a jelenségre, hogy egészséges terhességben az anyai fertőzések nagyobb számban fordulnak elő, mint nem terhesekben; illetve a fertőzések lefolyása súlyosabb.

23 Konklúzió II. Preeclampsiás betegeknél mind neutrofil granulociták, mind monociták esetében a sejtek fagocita funkciója szignifikánsan csökkent az egészséges terhesek és egészséges nem terhesek fagocita funkciójához viszonyítva. A preeclampsiában mért csökkent fagocita funkció része lehet a kórkép immunregulációs zavarának. A keringő STMP-k eliminálása ezáltal zavart szenvedhet, így azok kifejthetik károsító hatásukat az endothel sejtekre, következményes endothel diszfunkciót okozva, ami a preeclampsiára jellegzetes szisztémás endothelsejt károsodást kialakíthatja.

24 Köszönetnyilvánítás Dr. Lampé Rudolf Prof. Dr. Póka Róbert Prof. Dr. Ádány Róza DE Megelőző Orvostani Intézet dolgozóinak: Dr. Szűcs Sándor Dr. Pál László Dr. Árnyas Ervin Debreceni Egyetem belső kutatási pályázata

25 Köszönöm a megtisztelő figyelmet!

26 Függelék A bemutatott eredmények közül önállóan végeztem az alábbiakat: Fehérvérsejtek szeparálása, kitapasztása (neutrofil granulociták, monociták) Kezelés zymosan-nal (opszonizált fagocitózist utánozza, jelölve van fluoresceinisothiocyanate-tal) Sejtek festése (DAPI-sejtmag, monociták - Kettős AB jelölés: monocita specifikus antitestet, azaz anti humán CD 14+ és IgG ellenes antitest Texas Red fluoreszcens festékkel van konjugáltatva, ami anti CD14-hez kötődik) Kiértékelés: fagocitózis index: fagocitált részecskék száma/100 Statisztikai próba: kétmintás t-próba, szignifikancia szint: p<0,05 Előadás, táblázatok és diagramok készítése A részt vevő személyek klinika adatainak gyűjtése