A vörösvérsejtek süllyedési sebességének mérése

Átírás

1 A VÉR ÉLETTANA A vér, mint speciális kötıszövet, sejtekbıl és sejtközötti állományból áll. Ez utóbbi a vérplazma, míg a sejtek a vér alakos elemeit alkotják. A vérplazma 90%-a víz. Valódi és kolloidális oldott állapotban tartalmaz gázokat, elektrolitokat, bomlástermékeket, tápanyagokat, hormonokat. Fontosabb ionjai: Na +, K +, Cl -, Ca 2+, Mg 2+, HCO - 3. Nagy molekulájú anyagai a plazmaproteinek, immunglobulinok, glükoproteidek, szteroidok. A vérplazma fehérjéit három csoportba soroljuk a fibrinogén (kb.5%), albuminok (kb. 60%) és a globulinok (35%). A vérplazmában különbözı fehérje bomlástermékek, zsírok, lipoidok (koleszterin), monoszacharidok, tejsav, különbözı hormonok, alkohol, oxigén és széndioxid is található. A fibrinogén a véralvadásban játszik fontos szerepet. Az albumin viszonylag kis molekulasúlyú fehérje, a vér ozmotikus koncentrációjának fenntartásában, illetve tartalék fehérjeként jelentıs. A globulinok (α, β és γ) különbözı anyagok transzportfolyamataiban, illetve a szervezet védekezésében fontosak. Termelıdésük fokozódásával a szervezet védekezı képessége megnı a fertızı betegségekkel szemben. A vér alakos elemei a vértérfogat 45%-át adják. A sejtes elemek és a vérplazma aránya a hematokrit érték, ami férfiakban 42-47%, nıkben %. A vörösvértestek (erythrocyta) emlısökben magvatlan sejtek, innen van a vörösvértest elnevezés. A vörösvérsejtképzés a vöröcsontvelıben történik, melynek intenzitását egy, a vesében termelıdı hormon az erythropoetin szabályozza. A hormon oxigényhiány (hypoxia) hatására termelıdik és a véráram útján jut el a vöröscsontvelıbe. A vörösvértestek mérete kb. 7 µm. Számuk férfiakban 5,0-5,5 millió/mm 3, nıkben 4,5-4,8 millió/mm 3. A normál értéknél alacsonyabb vörösvértest szám esetén vérszegénységrıl beszélünk. A fehérvérsejtek (leukocyták) festékanyagot nem tartalmazó, magvas sejtek. Számuk 1 mm 3 vérben Felosztásuk történhet annak alapján, hogy a sejtek plazmájában található-e szemcse (granulum) vagy sem. Ennek alapján a fehérvérsejtek lehetnek szemcsézetlen plazmájú agranulocyták és szemcséket tartalmazó granulocyták. A 86

2 szemcsézetten belül - festıdésük alapján - neutrofil, bazofil, illetve eozinofil granulocytákat lehet elkülöníteni. Az agranulocyták további két alcsoportra, a lymphocytákra és a monocytákra oszthatók. A vérlemezkék (thrombocyták) magvatlan 2-4 µm nagyságú tojásdad formájú plazmatörmelékek. Számuk /mm 3, élettartamuk 9-11 nap. Szerepük a véralvadásban jelentıs. A kísérletekhez szükséges vért a különbözı fajokból az alábbi módszerekkel nyerhetünk. 1. Vérvétel nyúlból Nyúlból a fül széli vénájából nyerhetünk vért. A véna fölött a bırt xilolba vagy toluolba mártott vattával bedörzsöljük, ezáltal az ér kitágul, jól kidomborodik. A tőt a fül hegye irányában a vénába vezetjük, óvatos szívással néhány ml vért nyerhetünk. Kisebb mennyiségő vért vehetünk olyan módon, hogy a vízszintesen tartott fül vénáját megszúrjuk, és a kifolyó vért Hagedorn pipettába szívjuk. 2. Vérvétel emberbıl (ld. etikai szabályok emberre vonatkozó része) Kis mennyiségő vért legegyszerőbben ujjbegybıl vehetünk. A bal kéz középsı ujját zsíroldó, fertıtlenítı oldattal bedörzsöljük, majd annak elpárolgása után steril tővel 3-4 mm mélységig megszúrjuk. Az elsı vércseppet letöröljük, a továbbiakat használhatjuk kenetkészítéshez, vérsejtszámláláshoz, stb. Nagyobb mennyiségő vért a vena cubitibıl nyerhetünk. Ezt a mőveletet azonban csak megfelelı egészségügyi szakképesítéssel rendelkezı személy végezheti. A vér alvadását megakadályozhatjuk, ha a levett vért alvadásgátlóval (pl. 3,8 % Na-citráttal) 1 : 4 arányban keverjük. A vörösvérsejtek süllyedési sebességének mérése Anyagok és eszközök: Westergreen csı, vér A vizsgálatot alvadásgátolt vérrel végezzük. Fecskendı segítségével az 1 : 4 arányú citrátos vért (1 rész 3,8% Na-citrát és 4 rész vér) Westergreen pipettába (1. ábra) fecskendezzük a 0 jelig. (a pipetta 300 mm hosszú, a 0 jel a pipetta aljától 200 mm-re van.) A vért tartalmazó pipettát gumi alátét segítségével Westergreen 87

3 állványba helyezzük. A vörösvérsejtek nagyobb fajsúlyuk miatt süllyedni kezdenek, így a véroszlop a fölötte lévı plazmától jól elkülöníthetı. A vörösvérsejtoszlop magasságát 1 és 2 óra múlva leolvassuk, és a két érték átlaga adja a vérsüllyedést. 1. ábra: Westergreen állvány, Westergreen csövekkel A süllyedés normál értéke férfiakban 2-6 mm, nıkben 3-10 mm/óra. A plazmaglobulinok mennyiségének szaporodásával járó állapotok növelik a vérsejtsüllyedést (terhesség, akut és krónikus fertızés, daganatos megbetegedések), mert a globulinok a vörösvérsejtek felszínén adszorbeálódnak, és azok agglutinációját segítik elı. A süllyedési sebesség fokozódása az albumin/globulin arány megváltozását jelzi. A normális albumin% / globulin% fehérje kvóciens értéke 1,5. A vér fajsúlyának mérése Anyagok és eszközök: rézszulfát (CuSO4 Ms: 159,6g), desztillált víz, kémcsövek, szemcseppentı Az emberi vér, a plazma ill. a vérsejtek átlagos fajsúlya 1,0595, 1,0269 ill.1,0964 (SI: 1059, 1026 ill kg/m 3 ). A plazma fajsúlya a plazma fehérjetartalmától függ, a vér és a plazma fajsúlyviszonyából pedig a vér 88

4 hemoglobin tartalmára lehet következtetni (ld. a 2. ábra nomogrammját). Ezért a Phillips és munkatársai által kidolgozott, egyszerően végrehajtható fajsúlymeghatározási eljárásnak nagy gyakorlati jelentısége van. A módszer azon a jelenségen alapul, hogy ha fehérjetartalmú oldatot rézszulfát oldatba cseppentünk. A csepp felszínén réz-proteinát-réteg képzıdik, amely másodpercre megakadályozza a folyadékcserét a csepp belseje és az oldat között, melynek hatására a vércsepp szilárd testként viselkedik. Ha a csepp fajsúlya az oldatéval megegyezik, másodpercig lebeg. Ha könnyebb felszáll, ha nehezebb lesüllyed. Az eljárás kivitelezéséhez réz-szulfát-oldatsorozatot készítünk, és megkeressük azt az ismert fajsúlyú oldatot, amelyben a vér ill. plazmacsepp lebeg. A rézszulfát oldatsorzatot 1,1 fajsúlyú törzsoldat hígításával készítjük. A törzsoldathoz 170g kristályos rézszulfátot 1002 ml vízben oldunk fel. Az így kapott oldat fajsúlya 1,1. Adott fajsúlyú oldatok készítésének módját az 1. táblázat tartalmazza. Pl es fajsúlyú oldathoz 3,9 ml CuSO 4 oldatot mérünk ki, majd ezt desztillált vízzel 10 ml-re feltöltjük. fajsúly 1,030 1,040 1,050 1,060 1,070 CuSO 4 (ml) 2,9 3,9 4,9 5,9 6,9 H 2 O (ml) 7,1 6,1 5,1 4,1 3,1 1. táblázat: A különbızı fajsúlyú oldatok elkészítésének táblázatos mennyisége Az alvadásgátolt vért fecskendıbıl vagy szemcseppentıbıl kb. 1 cm magasságból az 1,060 fajsúlyú oldatba cseppentjük. Ha a csepp felszáll alacsonyabb, ha lesüllyed magasabb fajsúlyú oldattal folytatjuk a vizsgálódást, amíg meg nem találjuk azt az oldatot, amelyben a csepp lebeg. Ennek a fajsúlya megegyezik a vér fajsúlyával. Centrifugálás után ugyanezt az eljárást megismételjük a plazmával. Itt az 1,020 ill. az 1,030 fajsúlyú oldatokkal kezdjük az eljárást. A szérum fehérjetartalmának meghatározása Plazmafehérje meghatározás fajsúly alapján A fajsúly és fehérjetartalom közti összefüggést a 2. ábrán látható nomogrammból lehet leolvasni. 89

5 2. ábra: Nomogramm a vér fajsúlyának Phillips Van Slyke-féle meghatározásához A plazma fehérjetartalma és a fajsúly összefüggését a következı egyenlet adja meg: g % fehérje = (fajsúly 1,007) x k A k faktor értéke: 360. A szérumfehérjék elválasztása elektroforézissel Az emberi plazmafehérjék mennyisége g/l. Ebbıl g/l az albuminok mennyisége. Régebben kisózással tudták az albumint a többi plazmafehérjétıl, a globulin frakciótól elkülöníteni. Ma az egyszerőbb és gyorsabb elektroforézis módszerét használják, amellyel a plazmafehérjék albumin, és számos globulin frakcióra különíthetık. A módszer lényege, hogy a fehérjék elektromos térben töltésüknek megfelelıen elmozdulnak. A vándorlási sebességet az oldat ph-ja, valamint a fehérjék izoelektromos pontja határozza meg (3. ábra). Mennél nagyobb a kettı közti eltérés, annál gyorsabb a vándorlás. 90

6 COOH NH 3 + kation anion 0 ph 14 COO- NH 2 3. ábra: A fehérjék amfoter karaktere A gyakorlatban az elválasztást ph 8,0 feletti pufferban végzik. Ilyenkor az alacsony izoelektromos pontú albumin vándorol a leggyorsabban az anód felé. A közel azonos izoelektromos pontú fehérjék közel azonos sebességgel vándorolnak és közel azonos helyen sőrősödnek. Igy a globulinoknak négy frakciója különíthetı el, amelyeket görög betővel jelölünk. α1, α2, β és γ globulinok (4. ábra). 4. ábra: Szérumfehérjék elektroforetikus elválasztása Az elektroforézis történhet szabadon ill. oldatban, vagy sokkal gyakrabban, speciális hordozó segítségével. Ilyenkor a fehérjeoldatot hordozóra viszik, és elektromos térben futtatják. Hordozóként használhatnak papírt, cellulóz-acetát membránt, poliakrilamid, agar- vagy keményítı gélt. A futtatás befejeztével Coomassie-festékbe áztatjuk a gélt, amelyben rövid idın belül láthatóvá válnak a fehérje frakciók. A festési eljárások denzitometriás ill. fotometriás méréssel kombinálva mennyiségi vizsgálatokra is felhasználhatók. A különbözı csíkok által 91

7 kötött festék mennyisége arányos a zónákban található fehérjemennyiséggel. Az egyes fehérjefrakciók relatív koncentrációja az emberi szérumban az alábbi táblázat szemlélteti. frakció régi egység SI egység albumin % g/l α1 globulin 2,5-5 % 1,4-3,2 g/l α 2 globulin 7-13 % 4,2-7,7 g/l β globulin 8-14 % 5,6-8,8 g/l γ globulin % 9,1-14,7 g/l 2. táblázat: Plazmafehérjék százalékos eloszlása A vörösvérsejtek ozmotikus viszonyainak vizsgálata Anyagok és eszközök: NaCl Ms: 58,44g, desztillált víz, dietiléter, kémcsövek, fızıpoharak, fénymikroszkóp A vörösvérsejtek membránja féligáteresztı hártya, a víz és a benne oldott sók ionjai számára szabadon átjárható. A vérplazmánál nagyobb ozmotikus koncentrációjú (hiperozmotikus) oldatba helyezve vizet veszítenek, ezért zsugorodnak. A plazmánál hígabb, (hipozmotikus) oldatban a vízfelvétel miatt megduzzadnak, majd memránjuk felreped, és tartalmuk kifolyik. Ez a jelenség a vörösvérsejtek hemolízise. Hemolízis bekövetkezhet a membránt károsító anyagok pl. szerves oldószerek hatására is. Tegyünk egy csepp vért az alábbi oldatokba: 1. humán fiziológiás (0,9 %-os) NaCl oldat 2. 0,4 %-os NaCl oldat 3. desztillált víz 4. 3 %-os NaCl oldat 5. néhány csepp étert vagy benzint tartalmazó fiziológiás sóoldat Vizsgáljuk meg az oldatok színét, majd mikroszkóp segítségével a vérsejtek alakját. Megfigyelés: A fiziológiás sóoldatban változást nem tapasztalunk. A 0,4 %- os sóoldat színe a vérsejtek duzzadása miatt valamivel sötétebb lesz, a vérsejtek 92

8 alakja gömbölyőre duzzad. A 3 %-os sóoldat a vérsejtek zsugorodása miatt valamelyest világosabb lesz, a vérsejtek alakja buzogányfejre emlékeztet. A desztillált víz és az étert vagy benzint tartalmazó oldat a vérsejtek hemolízise miatt átlátszó, lakkfesték jellegő vörös színt mutat. A vörösvérsejtek ozmotikus rezisztenciájának meghatározása Anyagok és eszközök: NaCl, desztillált víz, kémcsövek A vérplazma ozmotikus koncentrációjánál hígabb oldatban a vörösvérsejtek megduzzadnak, majd hemolizálnak. Minél hígabb oldatban következik be a hemolízis, annál nagyobb a vérsejtek ozmotikus rezisztenciája. Az ozmotikus rezisztenciát azzal a legkisebb NaCl koncentrációval jelöljük, amelynél a vörösvérsejtek még éppen nem hemolizálnak. Ez az érték a minimális rezisztencia. Az az oldatkoncentráció amelynél a hemolízis teljessé válik, a maximális rezisztencia értéke. Az elıbbi értéke egészséges embernél 0,46-0,42 %-os, az utóbbi 0,34-0,30 % NaCl oldatnak felel meg. Tíz kémcsıbe mérjünk 4-4 ml 0,70, 0,65, 0,60, 0,55, 0,50, 0,45, 0,40, 0,35, 0,30, 0,25 % NaCl oldatot! Az oldatokat 1 % NaCl törzsoldat hígításával készítjük a 3. táblázatban leírt módon. Ezután minden kémcsıbe 1-1 csepp vért cseppentünk. Összerázzuk a kémcsövek tartalmát, majd két óra hosszat állni hagyjuk. % 0,70 0,65 0,60 0,55 0,50 0,45 0,40 0,35 0,30 0,25 1% NaCl 2, ,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 H 2 O 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 3,0 3. táblázat: A különbözı ozmotikus koncentrációjú oldatok elkészítésének táblázatos mennyisége Míg azokban a kémcsövekben amelyekben bekövetkezett a hemolízis, a folyadék pirosra festıdik. Kezdıdı hemolízis esetén a felülúszó sárgás színő. Ennek az oldatnak a koncentrációja adja meg a minimális rezisztencia értékét. Annak a kémcsınek a NaCl koncentrációja, amelyben üledék nem látható, és az oldat színe vörös, a maximális rezisztencia értékét adja meg. A 93

9 vörösvérsejtmembrán anyagcserezavarok vagy genetikai okok miatt bekövetkezı károsodása mindkét ozmotikus értéket magasabb NaCl koncentráció felé tolja el. A vér hemoglobin tartalmának meghatározása Anyagok és eszközök: Drabkin reagens (1000 ml: 0,2g kálium ferricianid (K 3 Fe(CN 6 ), 0,05g kálium-cianid (KCN), 0,14g kálium-hidrogén-karbonát (KHCO 3 ), desztillált víz), spektrofotométer A hemoglobin koncentráció változásai összefüggenek a hematokrit, illetve vörösvérsejtszám változásaival. A hemoglobin koncentráció fokozódik a vörösvérsejtszám bármilyen okból történı növekedése, vagy a plazmavíz mennyiségének csökkenése esetén. Az anémiák bármelyik formája, illetve a plazmavíz térfogatának növekedése a hemoglobintartalom csökkenését vonja maga után. A vér hemoglobin tartalmának normál értékei: férfiban: g/l, nıben: g/l. A vér teljes hemoglobin koncentrációja meghatározható, ha a vér teljes hemoglobin tartalmát kálium-ferricianid hozzáadásával methemoglobinná (hemiglobin) alakítjuk, majd káliumcianid hozzáadásával cián-hemoglobinná alakítjuk át, amelynek fényelnyelési maximuma 540 nm-en mérhetı. Az oldatot ph 7 körüli értéken kell tartani. Savas közegben ugyanis HCN (ciánhidrogén) gáz szabadul fel, ami az egyik legerısebb méreg. A Drabkin oldat fényérzékeny, ezért sötét üvegben kell tárolni. Mivel a kálium-cianid erısen mérgezı, ügyeljünk arra, ne hogy fölszívjuk, vagy a bırünkre kerüljön. Pipettázni csak ballonnal szabad! Kémcsövekbe 5 ml Drabkin reagenst mérünk, majd 20 µl vért pipettázunk ismételt bemosással a reagenshez (a pipettára kívülrıl rátapadt vért letöröljük). Vakpróbaként az oldatot használjuk, vér nélkül. A vért tartalmazó mintát jól összerázzuk, majd 15 perc állás után 540 nm-en fotometráljuk. A hemoglobin koncentráció megállapítása pontosan ismert hemoglobin tartalmú, hasonlóan kezelt vér (standard vér) extinkciójával való összehasonlítás alapján történik. A standard vér hemoglobin tartalmának meghatározása történhet a vastartalom mérése, vagy az oxigénkapacitás meghatározása alapján. 94

10 Kevésbé pontos, de tájékozódó vizsgálat céljára elfogadható, ha a standard oldat extinkcióját 0,4-nek vesszük,amely 149 g/l hemoglobintartalomnak felel meg. Ennek alapján a meghatározni kívánt vér hemoglobin tartalma a következı képlet segítségével számítható ki: E minta Hb. konc. g/l = x 149 ( g/l ) Estandard Hemoglobin koncentráció emelkedés csontvelıi erytropoesis hormon fokozódása (hypoxia, vörösvérsejt daganatos burjánzás), illetve plazmavíz csökkenés (exsiccosis) esetén történhet. Csökkenés különbözı anémiákban, illetve plazmavíz térfogat emelkedés során alakulhat ki. A vér kémhatásának meghatározása Anyagok és eszközök: ph-mérı, ph-papír, desztillált víz A gyakorlat kombinált üvegelektróddal vagy erre a célra használatos ph papírral történik (5. ábra). A ph-mérı készülék üvegelektródját desztillált vízzel alaposan lemossuk, a nedvességet szőrıpapírral leitatjuk. Az üvegelektródot ph 4- es oldatba merítjük, majd a készülék mutatóját ph 4 értékre állítjuk. Az oldatból kivéve desztillált vízzel alaposan lemossuk, majd a mőveletet ph 9-es oldattal is elvégezzük. A készülék kalibrálása után az elektródot a vizsgálni kívánt oldatba merítjük, majd a mért értéket leolvassuk. (a humán vér fiziológiás normál értéke: ph=7,35-7,45). Használat befejeztével az üvegelektródot híg sósavba merítve tartjuk. 95

11 5. ábra: Kémhatás mérésére alkalmas digitális készülék, illetve hagyományos indikátor papír Vérzési idő meghatározása emberen Anyagok és eszközök: steril injekcióstő, stopper óra, 96%-os etanol Az ujjbegyet fertıtlenítjük és kb. 2 mm mélységig megszúrjuk. A vérzési idıt stopper órával mérjük úgy, hogy a megjelenı vércseppeket 20 másodpercenként leitatjuk mindaddig, amíg a sebbıl vér szivárog. A normális vérzési idı 2-3 perc, 5 percen túl kórosnak tekintjük. A vérzési idı függ az érreakcióktól, a trombociták számától és mőködésétıl, valamint a szöveti tromboplasztin aktivitás mértékétıl. A vérzési idıt egyebek közt a hı, egyes kigyómérgek (vipera mérge), hipertóniás só gyorsítja. A vérzési idı jóval rövidebb, mint az alvadási idı, mert a vérzés megállításában az alvadáson kívül egyéb tényezık (pl. érszőkület) is szerepet játszanak. Az alvadási idő meghatározása Anyagok és eszközök: steril injekcióstő, parafinozott óraüveg, üvegpálca, üvegkapilláris, stopper óra, 96%-os etanol 96

12 Ujjbegybıl vett vért (3-4 csepp) parafinozott óraüvegre cseppentünk. Húsz másodpercenként vékony üvegpálcát húzunk a vércseppen keresztül. A vérvételtıl az elsı fibrinszál megjelenéséig eltelt idıt mérjük. Mérjük meg a vér alvadását szobahımérsékleten és 37 C-on. Az alvadási idı meghatározását elvégezhetjük úgy is, hogy 10 cm hosszú üvegkapillárisba ujjbegybıl vett vért szívunk, majd 1/2 percenként 5 mm hosszú darabokat törünk belıle. Az alvadási idıt az az idıpont adja meg, amikor a letörés helyén fibrinszálakat észlelünk. Egészséges ember vérének alvadási ideje 5-10 perc, mely a hımérséklet emelkedésével rövidül. Az alvadási idı elsısorban a véralvadás belsı útjáról (intrinsic út) ad felvilágosítást. A vörösvérsejtek vizsgálata A vörösvérsejtszám meghatározása Anyagok és eszközök: tárgylemezek, steril injekciós tő, Melangeur-pipetta (nagy, piros keverıvel), Bürker-kamra, Hayem-olda t (0,5 % NaCl, 2,5 % Na2SO4, 0,025 % HgCl 2 ), 96%-os etanol Ujjbegybıl vett vért szoros hígítás után számlálókamrába cseppentünk, és a vérsejteket mikroszkóp alatt megszámoljuk. A vörösvérsejtszám az 1 mm 3 (1 µl) vérben lévı vörösvérsejtek száma. A hígítást kétféle módon végezhetjük: A klasszikus módszer szerint, keverı (Melangeur) pipetta segítségével szívjuk fel a vért, a piros gyöngyöt tartalmazó pipetta 0,5 (200 x-os hígítás ) vagy 1-es jeléig (100 x-os hígítás). A meniszkuszt pontosan beállítjuk, majd a 101-es jelig Hayem oldat szívunk fel. A Hayem oldat hipertóniás, a vörösvérsejtek zsugorodását okozza, így megakadályozza összetapadásukat. A gumicsövet a pipettáról levesszük, és a pipetta két végét ujjainkkal befogva a tartalmát jól összerázzuk, majd néhány cseppet kifújunk belıle. Hegedős módszere szerint egy kis üvegedénybe a kívánt hígítás mértékétıl függıen 9,9 ml (100 x-os), vagy 9,95 ml (200 x-os) Hayem oldatot készítünk elı, majd Hagedorn pipettával 0,1 ml vagy 0,05 ml vért szívunk fel és többszöri 97

13 átöblítéssel a hígítófolyadékba mossuk. A bemosás elıtt kívülrıl töröljük le a vért a pipettáról. Alapos összerázással egyenletes vérsejtszuszpenziót hozunk létre, amelybıl Pasteur pipettával juttatunk 1-1 cseppet a számlálókamrába. A vérsejtszámlálást Bürker kamrában végezzük (6. ábra). Ez egy különlegesen kialakított vastag tárgylemez, amelynek a középsı harmadán három üvegcsík fut keresztül, amelyek közül a középsı 0,1 mm-el alacsonyabb, mint a két szélsı. Az utóbbiakra speciális fedılemezt helyezünk, ami így egy 1/10 mm mély rést zár el. A középsı üvegcsík felsı és alsó részén meghatározott mérető négyzethálós beosztás van, amelyben a számlálás történik. 6. ábra. Bürker kamra A háló 1/5 mm élhosszúságú nagy és 1/20 mm élhosszúságú kis négyzetekbıl, valamint 1/5 x 1/20 mm élhosszúságú téglalapokbál áll. Miután a beosztást tartalmazó rés mélysége 1/10 mm, a háló vonalai meghatározott térfogatú mértani idomokat (kockákat és hasábot) határolnak, amelyeknek a térfogata kiszámítható. A kis kocka 1/20 x 1/20 x 1/10 = 1/4000 mm 3 a nagy kocka 1/5 x 1/5 x 1/10 = 1/250 mm 3, a hasáb 1/20 x 1/5 x 1/10 = 1/1000 mm 3 térfogatú. 98

14 7. ábra: Bürker kamra beosztása A hígított vérbıl 1-1 cseppet a megfelelıen elıkészített Bürker kamra fedılemezének széléhez cseppentünk. A vér a kapilláraktivitás következtében a fedılmez alá szívódik és egyenletesen kitölti a rendelkezésére álló teret. A fedılemezre és a két beosztott részt elválasztó vályúba került vért vattával itassuk ki. Mindkét rész kis négyzetében megszámoljuk a vörösvérsejteket és kiszámítjuk az egy négyzetre esı átlagot. A vonalra esı sejtek közül csak a felsı és a baloldali vonalra esıket számoljuk. Ha 100X hígítást használtunk, az átlagértéket el megszorozva megkapjuk az 1 µl vérben lévı vörösvérsejtek számát. (1/4000 mm 3 a kis kocka térfogata, a hígítás mértéke 100X. A 200X hígításnál a szorzószám értelemszerően ). Figyeljünk arra, hogy az alsó és jobb oldali vonalakat érintı sejteket (az ábrán fekete) ne számoljuk (8. ábra). 8. ábra. A vörösvérsejtek számolásának sémás rajza 99

15 Valamivel gyorsabb az a módszer, amelyiknél 10 hasábban számoljuk meg vörösvérsejteket, melyeknek összegét 100X hígításnál el, 200X hígításnál el szorozzuk meg. A vörösvértest-térfogat (MCV) meghatározása A vörösvérsejtek átlagos térfogata (mean corpuscular volume, MCV) megadható a vér hematokrit, illetve a vörösvérsejtszám ismeretében. MCV= hematokrit \ vörösvérsejtek száma egységnyi térfogatban Az MCV mértékegysége a vörösvérsejtszám vonatkoztatott egységétıl függ. Példa: ha a mért vörösvérsejtszám 5 millió /µl= 5*10 12 /l; a vér hematokrit értéke= 0,42, azaz 1 liter vérben a vörösvérsejtek térfogata 0,42 / l MCV= 0,42 / 5*10 12 /l = 84*10-15 l = 84 fl Az érték normál tartománya: újszülöttnél fl, csecsemınél fl, felnıtteknél fl. Felnıtteknél 94 fl-t meghaladó érték macrocytosisra (pl. B 12 vitaminhiány), 80 fl alatti érték microcytosisra (pl. vasszintézis zavara) utal. A vörösvértestek átlagos hemoglobin-tartalma (MCH) A vörösvértestek átlagos hemoglobin-tartalma (mean corpusular haemoglobin, MCH) a vér hemoglobin koncentrációjának és a vörösvértestszámnak a hányadosa fejezi ki: MCH = hemoglobin koncentráció (g/l) / vörösvértestszám (sejt /l) Példa: ha a vörösvértestszám = 5 millió /µl= 5*10 12 /l; a vér hemoglobintartalma = 150 g/l vér MCH = 150 g/l / 5*10 12 /l = 32*10-12 g = 32 pg Az érték normál tartománya: pg. Az MCH növekedése mindig macrocytosist jelent. A vörösvértestek átlagos hemoglobin-koncentrációja (MCHC) Az vörösvértestek átlagos hemoglobin-koncentrációja (mean corpuscular haemoglobin concentration, MCHC) a vér hemoglobin koncentrációjából, illetve a hematokrit értékbıl számítható. MCHC = hemoglobin koncentráció (g/l) / hematokrit 100

16 Az eredmény dimenziója g hemoglobin /l vörösvértest. Példa: ha a hemoglobinkoncentráció = 144 g/l; a vér hematokrit értéke = 0,45 MCHC = 144g/l / 0,45 = 320 g/l vörösvértest Az érték normál tartománya: g hemoglobin /liter vörösvértest. Az MCHC értéke gyakorlatilag nem emelkedik a normál érték fölé, mert a a vörösvértest hemoglobinnal telített. Fehérvérsejt számolás Anyagok és eszközök: tárgylemezek, steril injekciós tő, Melangeur-pipetta (kicsi, fehér keverıvel), Bürker-kamra, Türk-oldat (0,5 % ecetsav oldat metilénkékkel színezve), 96%-os etanol A fehérvérsejt számolás a vörösvérsejt számoláshoz hasonló módon történik. Az ujjbegybıl vett vért a kisebb, fehér gyöngyöt tartalmazó Melangeur pipetta 1-es jeléig szívjuk fel, majd Türk oldattal hígítunk, amelyet a 11-es jelig szívunk fel. A Türk oldatban (hipotóniás oldat) a vörösvérsejtek hemolizálnak, a fehérvérsejtek magvai pedig megfestıdnek, így könnyen láthatóvá válnak. Hegedős eljárása szerint 0,05 ml vért 0,95 ml, vagy 0,1 ml vért 0,9 ml Türk oldatba pipettázunk. A hígítás mértéke az elıbbi esetben 20X, az utóbbiban 10X. A hígított vérbıl a vörösvérsejt számolásnál leírt módon a Bürker kamrába cseppentünk 1-1 cseppet, és mindkét beosztott részen nagy négyzetben megszámoljuk a fehérvérsejteket. A számolt mennyiség átlagát 2500-al, vagy el megszorozva (1/250 mm 3 a nagy kocka térfogata, 10X, ill. 20X a hígítás mértéke) megkapjuk a fehérvérsejt számot 1 µl vérben. A gyors módszer szerint kis nagyítással beállítunk egy hármas vonalakkal határolt "nagy" négyzetet, melynek alapterülete 1 mm 2. A "nagy" négyzet területén leszámoljuk a fehérvérsejteket, ezt még kétszer megismételjük, átlagolunk, majd a kapott eredményt 10 ill. 20X hígítás esetén 100-al ill. 200-al szorozva megkapjuk a fehérvérsejt számot 1 µl vérben. A fehérvérsejt szám meghatározásának hibája % ( +_ 1000). 101

17 A trombocitaszám meghatározása Reer-Ecker eljárással Anyagok és eszközök: tárgylemezek, steril injekciós tő, Hagedorn-pipetta, Wasserman-csı, Reer-Ecker oldat (3,8 % Na-citrát oldatot Löffler-féle metilénkék oldattal megfestve), Bürker-kamra, 96%-os etanol Wassermann-csıbe kimérünk 0,9 ml Reer-Ecker oldat és Hagedorn-pipetta segítségével 0,1 ml kapilláris vért pipettázunk bele. A keveréket szobahımérsékleten 1-2 óra hosszat állni hagyjuk, hogy a vörös- és fehérvérsejtek leülepedjenek. A folyadék felszínén kialakuló fehér plazmarétegben a trombociták feldúsulnak. Az ebbıl rétegbıl vett mintát cseppentjük az elıkészített Bürker kamrába. A számolást 10 téglalap felett végezzük, amelynek alapterülete egyenként 1/100 mm 2. A kapott sejtszám összegét 1000-el megszorozva kapjuk meg az 1 µl vérben lévı trombocitaszámot. A trombocitaszám normál értéke: /µl vér. A trombocitszám csökkenése (thrompocytopenia) létrejöhet a vérlemezkék fokozott pusztulása, felhasználása, illetve megnövekedett lép miatt, míg az emelkedés (thrombocytosis) számos betegség következményeként alakulhat ki. Festett vérkenet vizsgálata Anyagok és eszközök: tárgylemezek, steril injekciós tő, May-Grünwald oldat (1% eosinsavas metilénkék, metilalkohol, glicerin), Giemsa oldat (61% glicerin, 0,16% azur II, 0,6% azur II eosin 60 C-on oldva, 38,3% metilalkohol), immerziós lencse A vér alakos elemeinek morfológiáját, elıfordulási arányát festett vérkenetben vizsgáljuk. Cseppentsünk egy csepp vért alkohol-éter keverékben zsírtalanított tágylemezre. Egy másik tárgylemez rövidebb élét kb. 45 -os szögben helyezzük a vércsepp mögé úgy, hogy az a tárgylemez alatt szétterüljön, majd húzzuk végig a vízszintesen tartott lemezen. 102

18 a kikenés iránya vércsepp 9. ábra. A vérkenet készítése A kenet akkor jó, ha a vér vékony rétegben, egyenletesen vonja be a tárgylemezt. A kenetet száradni hagyjuk, majd közvetlenül, vagy festés után vizsgáljuk. A vérkenet festése Pappenheim szerint: egy nagy Petri csészébe tegyünk egy kisebbet és erre helyezzük a festendı lemezeket. Elıször May- Grünwald oldatot cseppentünk a kenetekre. Az oldat metilalkohol tartalma fixálja a készítményt, de festés csak vizes közegben jön létre, ezért 2-3 perc múlva a kenetre öntött festékhez kb. ugyanolyan mennyiségő vizet adunk, majd a hígított festéket 1-2 perc múlva leöntjük. Ezután frissen hígított Giemsa oldatot (3 csepp törzsoldat 1 ml vízhez) rétegzünk a lemezre és ezt kb. 10 percig rajta tartjuk. A festékoldatot desztillált vízzel, majd csapvízzel alaposan lemossuk. Immerziós olajat cseppentünk a kenetre és 100X objektív alatt vizsgáljuk a megfestıdött sejteket. 103

19 10. ábra: Festett vérkenetben megfigyelhetı fehérvérsejt típusok. A és D neutrofil granulocita (9-12 µm); B és E eosinofil granulocta (12-14 µm); C basofil granulocita (8-11 µm); F plazmasejt; G, H, I kis limfocita (6-8 µm); J, K, L monocita (12-20 µm) Karakterizáljuk a fehérvérsejteket a 9. ábra alapján és számoljuk meg az egyes típusokat. Mivel a sejtek eloszlása nem egyenletes, a kenet széli részein több nagy sejt (granulocita, monocita), a középsı részén pedig több limfocita van, a számolást kezdjük szélrıl és meander vonalban haladjunk közép felé (11. ábra). Összesen 100 sejtet számoljunk meg, így %-os megoszlásuk könnyen meghatározható. A normál értékeket a 4. táblázat foglalja össze. 104

20 . 10. ábra. A kvalitatív vérkép számolási technikája (meander vonalak) neutrofil granulocita % eozinofil granulocita 2-4 % bazofil granulocita 0,5 % Monocita 4-8 % Limfocita % 4. táblázat: Az emberi vér fehérvérsejtjeinek százalékos megoszlása Vércsoport meghatározás A vörösvérsejtek membránja számos agglutinogénnek nevezett antigént tartalmaz. Ezek közül legnagyobb gyakorlati jelentıséggel az AB0 vércsoportrendszer antigénjei, az A és B agglutinogén, valamint az Rh rendszer D agglutinogénje bírnak. Az ABO vércsoport meghatározása Anyagok és eszközök: tárgylemezek, steril injekciós tő, AB0 serotyp, 96%-os etanol Az A és B agglutinogének glikoprotein molekulák, amelyek jelenléte vagy hiánya alapján különböztetjük meg az A, B, AB és 0 vércsoportokat. A plazmában az A és B agglutinogénekre specifikus antitestek, agglutininek találhatók. Az A vércsoportú egyén plazmája anti B (α), a B vércsoportúé anti A (β) agglutinint, a 0 vércsoportúé mindkettıt, az AB egyiket sem tartalmazza. Az agglutininek a nekik megfelelı antigénekhez kapcsolódva a vörösvérsejtek összetapadását (agglutinációját) idézik elı, amit hemolízis követ. Ez következik be, ha véradásnál nem megfelelı, azaz inkompatibilis vért adnak. 105

21 A vércsoportmeghatározást ismert vércsoportú szérumokkal végezzük. Gondosan letisztított tárgylemez hátoldalát A, 0, B jelzésekkel látjuk el, és a színére cseppentjük a megfelelı savókat, amelyek antitesteket tartalmaznak. A savócseppekbe ujjbegybıl vett vért keverünk olyan módon, hogy egy tárgylemez három sarkát a vércseppbe mártva külön-külön elkeverjük a savócseppekkel, vigyázva arra, hogy egyik savót a másikba ne vigyük át. A vérsejtek azokon a helyeken csomósodnak össze, ahol a felszínükön lévı antigén a neki megfelelı antitesttel találkozik. A reakció szobahımérsékleten végezhetı és néhány perc múlva kiértékelhetı. tesztsavók: (A) (0) (B) anti B anti A anti B anti A AB A B ábra. Vércsoportmeghatározás az AB0 rendszerben Rh vércsoport meghatározás Anyagok és eszközök: tárgylemezek, steril injekciós tő, anti-d savó, termosztát, 96%- os etanol Az Rh vércsoportrendszert 6 antigén alkotja, amelyek közül legerısebb a D agglutinogén. Ennek jelenléte vagy hiánya alapján sorolhatók az emberek Rh + vagy Rh - vércsoportba. A D agglutinogén ellen anti D agglutinin termelıdik, ha Rh - ember vérébe Rh + vérsejtek kerülnek. Az így termelıdött agglutininek a D + vérsejtek ismételt bejutásakor okoznak agglutinációt. Ez olyan terhességnél szokott elıfordulni, amikor Rh - anya másodszor, illetve többedszer is Rh + magzatot hordoz. Tisztított tárgylemezre három csepp anti D savót cseppentünk. Az egyik szélsı cseppbe biztosan Rh +, a másikba biztosan Rh - vért keverünk, míg a középsıhöz a vizsgálandó vér egy cseppjét tesszük. 106