(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

Átírás

1 !HU T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E (22) A bejelentés napja: (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 786 A (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 786 B (1) Int. Cl.: C12N 1/90 (06.01) A61K 38/00 (06.01) C12N /06 (06.01) C12N 9/22 (06.01) C12N 1/8 (06.01) A01K 67/027 (06.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 0070 PCT/EP 03/00707 () Elsõbbségi adatok: DE (72) Feltalálók: MISKEY, Csaba, 1312 Berlin (DE); IZSVAK, Zsuzsanna, 1312 Berlin (DE); IVICS, Zoltan, 1312 Berlin (DE); PLASTERK, Ronald, NL-384 CT Utrecht (NL) (73) Jogosultak: MAX-DELBRÜCK-CENTRUM FÜR MOLEKULARE MEDIZIN, 1312 Berlin (DE); Netherland Cancer Institute, 66 CX Amsterdam (NL) (74) Képviselõ: dr. Svingor Ádám, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda KFt., Budapest (4) Gerincesekben géntranszfer céljára alkalmas transzpozon vektor, a Frog prince. (7) Kivonat HU T2 A találmány tárgyát képezi transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer, amely az alábbiakat tartalmazza: (a) funkcionális transzpozázt kódoló polinukleotidtól mentes transzpozont, amely tartalmazza a hasznos polinukleotidot, ahol a transzpozon olyan fordított ismétlõdéseket tartalmaz, amelyek legalább 90%¹os azonosságot mutatnak a 2. azonosító számú szekvencián belüli ismétlõdésekkel, valamint annak fordított ismétlõdésével; és (b) transzpozázt, amely N¹terminális végén olyan DNS-kötõ domént hordoz, amely tartalmazza a 3. és 4. azonosító számú szekvenciákat; vagy (c) a (b) pont szerinti transzpozázt kódoló polinukleotidot. A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás hasznos polinukleotid gerinces állat sejtjeibe történõ bejuttatására, amely eljárás tartalmazza a találmány szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer fenti sejtekbe történõ bevitelének a lépését. A leírás terjedelme 24 oldal (ezen belül lap ábra) Ezen túlmenõen, a találmány tárgyát képezi eljárás RNSi elõállítására, amely eljárás tartalmazza (a) olyan expressziós kazettát tartalmazó transzpozon sejtbe történõ stabil bevitelét, amely a találmány szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer részeként rövid interferáló RNS¹t és szelektálható markergént expresszál; (b) a szelektálható markert expresszáló sejtek szelektálását; és (c) annak értékelését, hogy a kívánt gén transzkripcióját/transzlációját befolyásolja¹e az RNSi. A találmány tárgyát képezi továbbá gének géncsapdázására alkalmas eljárás, amely az alábbi lépéseket tartalmazza: (a) a találmány szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer sejtbe történõ bevitelét; és (b) szelektálható marker expressziójának az értékelését, ahol a szelektálható marker expresszálódása a transzpozonnak a sejt átírt génjébe történõ integrálódását jelzi. Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 199. évi XXXIII. törvény 84/H. -a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.

2 A találmány tárgyát képezi transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer, amely az alábbiakat tartalmazza: (a) funkcionális transzpozázt kódoló polinukleotidtól mentes transzpozont, amely tartalmazza a hasznos polinukleotidot, ahol a transzpozon olyan fordított ismétlõdéseket tartalmaz, amelyek legalább 90%¹os azonosságot mutatnak a 2. azonosító számú szekvencián belüli ismétlõdésekkel, valamint annak fordított ismétlõdését; és (b) transzpozázt, amely N¹terminális végén olyan DNS-kötõ domént hordoz, amely a 3. és 4. azonosító számú szekvenciákat tartalmazza; vagy (c) a (b) szerinti transzpozázt kódoló polinukleotidot. A találmány tárgyát képezi továbbá transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer alkalmazása gyógyhatású készítmény elõállítására, amely készítmény alkalmas adott polinukleotidnak gerinces állat sejtjeibe történõ átvitelére azáltal, hogy a találmány szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszert a fenti sejtekbe juttatja. Ezen túlmenõen, a találmány tárgyát képezi in vitro eljárás RNS-interferencia (RNSi) elõállítására, amely az alábbiakat tartalmazza: (a) a találmány szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer részeként rövid interferáló RNS¹t és szelektálható markergént expresszáló expressziós kazettát tartalmazó transzpozon sejtbe történõ stabil bejuttatását; (b) szelektálást a szelektálható markert expresszáló sejtekre; és (c) annak megállapítását, hogy az RNSi befolyásolja¹e a kívánt gén transzkripcióját/transzlációját. Ugyancsak a találmány tárgyát képezi in vitro géncsapdázó eljárás, amely az alábbi lépéseket tartalmazza: (a) a találmány szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer bejuttatását sejtbe; és (b) a szelektálható marker expressziójának meghatározását, ahol a szelektálható marker expressziója a transzpozonnak a sejt átíródott génjébe történõ integrálódását jelzi. Jelentõs energiákat fektettek in vivo génátviteli stratégiák kifejlesztésébe, amelyek alkalmasak örökletes és szerzett rendellenességek kezelésére emberekben (szomatikus géntranszfer), valamint bizonyos, mezõgazdasági és orvosi biotechnológiai hasznosítású gerinces fajok transzgenezisére (csírasejtes géntranszfer). A hatékony génterápiához elengedhetetlen, hogy (1) a terápiás gének nagy hatékonysággal jussanak be specifikusan a releváns sejtekbe, 2) a gén hosszú idõn át expresszálódjon; 3) bizonyosság legyen arra nézve, hogy a terápiás gén bejuttatása nem ártalmas. Több eljárást és vektort is alkalmaznak humán génterápiás célból gének átvitelére [Verma és Somia, (1997)]. Ezek az eljárások nagyjából vírus- és nem vírusalapú módszerekként csoportosíthatók, és mindegyiknek vannak elõnyei és korlátai; egyik sem nyújt tökéletes megoldást. Általánosságban, a transzgén integrálására képes vektorok tartós expressziót is képesek biztosítani. Másrészt, aggodalomra ad okot a véletlenszerû integráció a kromoszómákba, mivel számolnunk kell az inszerciós helyen és annak közelében található endogén génmûködések potenciális megszakadására. Széles körben elterjedt megközelítési mód vírusok adaptálása géntranszferre, a vektor genetikai tervezését korlátozza azonban az adott vírus mérete, struktúrája, és abban az expresszió szabályozása. A retrovírus vektorok (Miller; 1987) hatékonyan integrálnak idegen DNS¹t a transzdukált sejtek kromoszómájába, és nagy lehetõségeket rejtenek, ami az élethosszig tartó génexpresszió biztosítását illeti. Az elõállításukhoz szükséges idõ- és költségbefektetés miatt azonban nemigen alkalmasak ipari méretû elõállításra. Ezenfelül, több egyéb faktor is megfontolást érdemel, például a biztonságosság, véletlenszerû kromoszomális integráció, és az a tény, hogy az integráció feltétele a sejtosztódás. A humán immundeficiencia víruson (HIV) alapuló lentivírus rendszerek a retrovírusok közé tartoznak, de képesek mind osztódó, mind nem osztódó sejteket megfertõzni. Az adenovírus-vektorok képesnek bizonyultak arra, hogy in vivo transzgéneket juttassanak osztódó és nem osztódó sejtek széles skálájába, valamint arra, hogy magas szintû, azonban rövid ideig tartó transzgénexpressziót közvetítsenek. Az adenovírusokból hiányzik az a képesség, hogy a bejuttatott gént kromoszomális DNS¹be integrálják, és jelenlétük a sejtekben rövid életû. Ezáltal, rekombináns adenovírus-vektorokat ismételten be kell adni, azzal a következménnyel, hogy a vektor immunogenitása miatt nem kívánt immunválaszt váltanak ki emberekben. Az adeno társult vírus (AAV) vektorok több kiaknázható potenciális elõnnyel bírnak, ezen belül azzal a tulajdonsággal, hogy képesek a transzgén célzott integrációjára. Az AAV-hordozóeszközök egyik nyilvánvaló hátránya az alacsony maximális inszertméret (3, 4,0 kb). Újabban, kombinált (hibrid) vektorokat fejlesztettek ki (retrovírus/adenovírus, retrovírus/aav stb.), amelyek képesek áthidalni az egyes vírusvektor-rendszerekkel kapcsolatos bizonyos problémákat. A nem virális módszerek, ezen belül DNS-kondenzáló szerek, liposzómák, mikroinjekció és génpuska eljárás alkalmazása egyszerûbb és biztonságosabb lehet, mint a vírusoké. A csupasz DNS bejuttatásának és felvételének hatékonysága azonban alacsony, amely növelhetõ liposzómák alkalmazásával. Általánosságban, a napjainkban alkalmazott, nem virális rendszerek nincsenek úgy felszerelve, hogy támogassák az integrációt a kromoszómába. Következésképp, a nem virális rendszerek alkalmazásával elérhetõ stabil géntranszfer gyakorisága igen alacsony volt. Ezen túlmenõen, a nem virális rendszerek többsége gyakran konkatamerizációhoz és a bejuttatott DNS véletlenszerû töréseihez vezet, ami géncsendesítést eredményezhet. Röviden, transzpozícióra képes (áthelyezõdõ) elemek vagy transzpozonok mobilis DNS-szegmensek, amelyek egyik helyrõl a másikra áthelyezõdhetnek a genomban [Plasterk és mtsai.: (1999)]. Ezek az elemek konzervatív kivágás és beillesztés ( cut-and-paste ) mechanizmus révén mozognak: a transzpozáz katalizálja a transzpozon kivágását annak eredeti helyérõl, és elõsegíti reintegrációját máshova a genomban. Transzpozázdeficiens elemek mobilizálhatók, ha a transzpozázok in-trans biztosítva vannak más transzpozáz gén által. Ily módon, a transzpozonok hasznosíthatók hordozókként, hogy transzgenezis révén új feno- 2

3 típusos tulajdonságokat vigyenek át genomokba. Nem fertõzõek, és a gazdájukhoz történõ adaptáció szükségessége miatt a vírusoknál vélhetõleg kevésbé ártalmasak a gazdára. DNS-transzpozonokat rutinszerûen alkalmaznak inszerciós mutagenezisre, géntérképezésre és géntranszferre jól megalapozott, nem gerinces modellrendszerekben, például Drosophila melanogaster vagy Caenorhabditis elegans rendszerekben és növényekben. Transzponálható elemeket nem alkalmaztak azonban gerinces genomok tanulmányozására, két okból. Elõször, mindeddig nem álltak rendelkezésre jól meghatározott, DNS-alapú, mobilis elemek ezekben a fajokban. Másodszor, állatokban, aktív transzpozonrendszerek egyik fajból a másikba történõ átvitelének fõ akadálya a transzpozíció fajspecifitása volt, mivel az a természetes gazda által termelt faktorokat igényelt. A csipkerózsika ( Sleeping Beauty ; SB) aktív Telszerû transzpozon, amely csontos halak genomjában található inaktív elemek darabjaiból lett összeállítva [Ivics és mtsai.: (1977)]. Az SB hatékony és pontos kivágás és beillesztést ( cut-and-paste ) közvetít halban, békában és számos emlõs fajban, például egér- és emberi sejtekben [Ivics és mtsai: (1997); Luo és mtsai.: (1998); Izsvak és mtsai.: (00); Yant és mtsai: (00)]. Az SB által közvetített transzpozíció hatékonysága különbözõ fajokból származó sejtvonalakban azonban változó. Például, az SB¹transzpozíció hatékonysága zebradánió sejtjeiben igen alacsony [Izsvak és mtsai.: (00)], ami korlátozza az SB alkalmazhatóságát ebben fontos gerinces modell organizmusban. A jelenség nem teljesen világos, és több faktor együttes következménye lehet. Mivel az SB haleredetû elem, egy lehetséges magyarázat szerint, interferál a zebradánió genomjának endogén elemeivel. Ezért megoldaná a problémát, ha különbözõ gerinces eredetû transzpozon-készlet állna rendelkezésre. A jelen találmány hátterében álló módszertani probléma tehát az volt, hogy alternatív transzpozonalapú génszállítórendszereket biztosítsunk, hogy szélesebb körben tegyük lehetõvé gerincesekben a transzpozonok genomi eszközökként történõ alkalmazását. Ennek megfelelõen, a találmány tárgyát képezi transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer, amely a következõket tartalmazza: (a) funkcionális transzpozázt kódoló polinukleotidtól mentes transzpozont, amely tartalmazza a hasznos (az adott esetben jelentõséggel bíró) polinukleotidot, ahol a transzpozon olyan fordított ismétlõdéseket tartalmaz, amelyek legalább 90%¹os azonosságot mutatnak a 2. azonosító számú szekvencián belüli ismétlõdésekkel vagy azok fordított ismétlõdéseivel; és (b) transzpozázt, amely N¹terminális végén a 3. és 4. azonosító számú szekvenciákat vagy a 3. és/vagy 4. azonosító számú szekvenciával legalább 90%- ban azonos szekvenciákat tartalmazó DNS-kötõ domént tartalmaz; vagy (c) a (b) szerinti transzpozázt kódoló polinukleotidot Elõnyösen, a DNS-kötõ domén a 6. azonosító számú szekvenciát tartalmazza, vagy abból áll. A találmány ezen és valamennyi következõ elõnyös megvalósítási módjai szerint, a transzpozon fordított ismétlõdéseket (fordított irányú ismétlõdéseket, inverted repeat ) tartalmaz, ahol az ¹ismétlõdés az ¹végen a 2. ábra 1. pozíciójában kezdõdik és 214. pozíciójában végzõdik, és a 3 ismétlõdés az ¹végen a 2. ábra 18. pozíciójában kezdõdik és pozíciójában végzõdik. Szintén elõnyösen, a fordított ismétlõdés és/vagy a transzpozáz N¹terminális vége legalább 9%¹os, például legalább 98%¹os, elõnyösebben 99%¹os és legelõnyösebben 0%¹os azonosságot mutat a 2. azonosító számú szekvenciával, illetve a fordított ismétlõdésekkel, a 2. azonosító számú szekvencia rövidebb fragmensével és annak fenti fordított ismétlõdésével, és a 3. és/vagy 4. vagy 6. azonosító számú szekvenciákkal. Nukleinsavszekvenciák (valamint aminosavszekvenciák) azonossága meghatározható szokásos eljárásokkal vagy számítógépes programokkal, ezen belül a BLAST programmal [Altschul S. F., Gish W, Millers E. W. & Lipman D. J.: J. Mol. Biol. 21, 3 4 (1990)] vagy azok változataival [Altschul S. F. és Gish W: Methods Enzymol. 266, (1996)], FASTA [Pearson W. R. és Lipman D. J.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8, (1998)] vagy a Smith Waterman algoritmus alkalmazásával [Smith T. F., Waterman M. S.: J. Mol. Biol. 147, 19 7 (1981)]. A fordított ismétlõdés fogalmát a technika állása szerint ismert értelemben használjuk. A transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer kifejezést, amely magában foglalja a géntranszfer rendszer jelentést, olyan rendszerre vonatkoztatva használjuk, amely DNS¹be, például kromoszomális DNS¹be történõ integráció közvetítéséhez szükséges komponenseket biztosít. Ezek a komponensek a találmány szerint a Frog Prince transzpozonból származnak, amelynek azonosítását a csatolt példákban ismertetjük, és további tulajdonságait a találmány fõ megvalósítási módjának fenti (a), (b) és (c) pontjában definiáljuk. Az elért integráció a találmány szerint tipikus II. osztályba tartozó transzpozíciós esemény. A találmány szerint elért integráció általában véletlenszerû esemény, de célzott módon is megvalósítható, ha a transzpozon például DNS-célzó doménhoz kapcsolt, vagy specifikus módon kölcsönhatásba lép valamely proteinnel (például linkeren keresztül kapcsolt protein interakciós doménnal), amely bizonyos DNS-szekvenciákat felismerõ DNS-célzó domént tartalmaz; lásd az EP , EP és EP számú európai szabadalmi leírásokat. Ezen szabadalmi leírások tartalma teljes egészükben a leíráshoz tartozó kitanítás részét képezi. A találmány szerinti transzpozáz sejtmag-lokalizációs szignált ( nuclear localisation signal, NLS), a 3. és 4. azonosító számú szekvenciák szerinti hélix hurok hélix motívumokon felül további DNS-kötõ domént, valamint katalitikus domént is tartalmaz. Az (a) és (b) és/vagy (c) komponensek elõnyösen külön komponensekként vannak jelen a rendszerben. Egyes esetekben elõnyös továbbá, hogy legalább a 3

4 transzpozon külön komponensként megtartott. A külön komponensek kifejezés arra a tényre utal, hogy a komponensek, azaz a transzpozon, a találmány szerinti rendszerben felsorolt polinukleotidok és/vagy transzpozáz fizikailag elkülönült molekuláris entitások. Lehetséges például, az (a) pont szerinti transzpozon és a (c) pontban felsorolt polinukleotid nem alkot egyetlen polinukleotidot, hanem két külön, adott esetben egymástól függetlenül sokszorozódó polinukleotidként vannak jelen a találmány szerinti DNS-integrációs rendszerben. Funkcionális transzpozázt kódoló polinukleotidtól mentes transzpozon kifejezés alatt olyan transzpozonalapú DNS-molekulát értünk, amely többé nem tartalmazza a funkcionális, elõnyösen természetben elõforduló transzpozázt kódoló teljes szekvenciát. Elõnyösen, a funkcionális, elõnyösen természetben elõforduló transzpozázt kódoló teljes szekvencia vagy annak része deletálva van a traszpozonból. Más megoldás szerint, a transzpozázt kódoló gén olyan mutációt hordoz, hogy abban természetben elõforduló transzpozáz vagy annak transzpozázfunkciót betöltõ fragmentuma vagy származéka, azaz, amely a transzpozon inszercióját a DNS célhelyre közvetíti, már nincs jelen. További megoldás szerint, az aktivitás jelentõsen csökkent, legalább 0%-kal, elõnyösebben 80%-kal, 90%-kal, 9%- kal vagy 99%-kal. A fenti mutációk lehetnek szubsztitúciók, duplikációk, inverziók stb., melyek leírása megtalálható standard molekuláris biológiai szakkönyvekben, például a következõben: Molecular Biology of the Gene, szerk.: Watson és mtsai., 4. kiadás, The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., Menlo Park, CA (1987). A transzpozonnak meg kell tartania azokat a szekvenciákat, amelyek in-trans biztosított transzpozáz általi mobilizálásához szükségesek.[2] Ezek a transzpozáz számára kötõhelyeket tartalmazó terminális fordított ismétlõdések. A leírásban polinukleotid kifejezés alatt bármely típusú polinukleotidot értünk, például RNS¹t, DNS¹t vagy PNS¹t vagy azok módosulatait. A találmány szerint a kifejezés elõnyösen DNS¹t jelent. Az azonossági fokot mutat a 2. azonosító számú szekvencián belüli ismétlõdésekkel és annak fordított ismétlõdésével kifejezés arra a tényre utal, hogy a 2. azonosító számú szekvencia a transzpozon ¹végén levõ ismétlõdõ szekvenciát jelöli, vagy azt tartalmazza. Az azonosság foka a transzpozon ¹ és 3 ¹végeinél található fordított szekvenciák összességére vonatkozik (azaz az és pozíciókra, 2. ábra). A reverz komplementer szekvencia (a fordított ismétlõdés) a transzpozon 3 ¹végén található. A találmány szerint, az ismétlõdés és a 3 ismétlõdés a hasznos polinukleotidot tartalmazó transzpozonon belül megmarad. További szemléltetés céljából a 2. ábrára utalunk, ahol az ismétlõdéseket kiemeltük. A találmány szerinti, transzpozonalapú DNS-integrációs rendszerben foglalt fordított ismétlõdések tehát, ami az ismétlõdést illeti, legalább 90%¹os azonossági fokot mutatnak a 2. azonosító számú szekvenciában található ismétlõdésekkel (vagy a 2. ábra szerinti 1. pozícióban kezdõdõ és a 214. pozícióban végzõdõ szekvenciával), ami a 3 ismétlõdést illeti, legalább 90%¹os azonossági fokot mutatnak a 2. azonosító számú szekvencia szerinti reverz komplementer szekvenciában található ismétlõdésekkel (vagy a 2. ábra szerinti 18. pozícióban kezdõdõ és az pozícióban végzõdõ szekvenciával), amelyet a 2. ábra 3 ¹régiójában szintén kiemeltünk. A transzpozáz, amely N¹terminális végén olyan DNS-kötõ domént hordoz, amely domén a 3. és/vagy 4. azonosító számú szekvenciát tartalmazza, vagy a 3. és/vagy 4. azonosító számú szekvenciával legalább 90%¹os azonossági fokot mutató szekvenciát tartalmazza kifejezés alatt olyan (poli)peptidet értünk, amely szubsztrátspecificitása és DNS-kötõ/integráló kapacitása tekintetében megfelel az 1. azonosító számú szekvencia szerinti Frog Prince transzpozáznak. A 3. és 4. azonosító számú szekvenciák a DNS-kötõ régióban található, két hélix hurok hélix motívumnak felelnek meg. Megfelelnek továbbá a természetesen elõforduló transzpozázból származtatott fragmenseknek, amelyekbõl hiányoznak aminosavak, elõnyösen a természetben elõforduló transzpozázon belül, és amelyek mégis közvetítik a szubsztrát-dns inszertálását. Más megoldás szerint, a kifejezés utal olyan, természetesen elõforduló transzpozázokra, például a természetben elõforduló transzpozázokat tartalmazó fúziós proteinekre, amelyekben egy vagy több aminosavat kicseréltek, deletáltak, hozzáadtak, vagy kevésbé elõnyösen, amelyekben inverziók vagy duplikálódások történtek. Az ilyen módosításokat elõnyösen rekombináns DNS-technológiával végzik. További módosítások végezhetõk a transzpozáz protein kémiai megváltoztatásával. A protein (valamint fragmensei és származékai) elõállítható rekombináns eljárásokkal, és mégis megtarthatja a természetben elõforduló protein azonos, vagy lényegében azonos tulajdonságait. A (poli)peptid kifejezés alatt egyaránt értünk peptideket és polipeptideket. A peptidek hagyományosan aminosavat tartalmazó aminosavszekvenciát tartalmaznak, míg a polipeptidek (más elnevezéssel proteinek ) legalább 31 aminosavból álló láncot képeznek. A találmány szerint transzponálható elemek új rendszerét fejlesztettük ki Rana pipiens kétéltû faj genomjában található, inaktív elemekbõl. Ez az új rendszer, amelynek a Frog Prince (FP; békakirály ) nevet adtuk, elõnyösen alkalmazható vektorként genetikai anyag gerincesek kromoszómáiba történõ inszertálására. Egy kívánt transzpozonvektor néhány fõbb jellemzõje: könnyû alkalmazhatóság, gazdaszervezetek viszonylag széles köre, hatékony kromoszomális integrálódás és a hû transzgén-expresszálódás stabil fenntartása transzgén sejtek és organizmusok több generációján át. Közelebbrõl, a találmány szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer elõnyei, elsõsorban gerincesekbe történõ géntranszfer céljára, a technika korábbi állásához képest az alábbiak szerint ismertethetõ: A gerincesekbõl származó sejtek széles körét képes transzformálni; továbbá, mivel DNS-alapú transz- 4

5 pozon, nincs szükség a hasznos polinukleotid és elõnyösen a transzgén reverz transzkripciójára, ami mutációkat visz be retrovírus eredetû vektor törzsekbe. Mivel a transzpozonok nem fertõzõek, a transzpozonalapú vektorok nem képesek replikálódni, ezért nem terjednek át más sejtpopulációkra. Ráadásul, a találmány szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer a mobilizáláshoz mindössze körülbelül 2 bázispár (bp) transzpozon fordított ismétlõdõ DNS¹t igényel, amely a hasznos polinukleotidot, például transzgént két oldalról határolja; a transzpozíció indukálható, ahhoz csak a transzpozáz protein szükséges, így az ugrás helye és idõpontja a transzpozáz expresszálódásának a szabályozásával egyszerûen irányítható. Ezen túlmenõen, a találmány szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer gének stabil, egy-kópiás integrációját közvetíti a kromoszómákba, amely hosszú távú expresszálódás alapját teremti meg transzgén sejtek és organizmusok több generációján keresztül. Miután integrálódtak, az elemek várhatóan stabil, domináns genetikai determinánsként viselkednek a transzformált sejtek genomjában, mert 1) a transzpozáz jelenléte a sejtekben átmeneti, és arra az idõpontra korlátozódik, amikor a transzpozíció katalizálódik, és 2) gerincesekben nincs bizonyíték olyan transzpozázforrásra, amely képes volna az integrált elemeket aktiválni és mobilizálni; néhány békafaj kivételével, a gerincesek genomjában nem léteznek olyan, a találmány szerinti, transzpozonalapú DNS-integrációs rendszerrel homológiát mutató endogén szekvenciák, amelyek lehetõvé tennék transzpozicionálisan kompetens (autonóm) elemek rekombinációját és felszabadulását. A találmány szerinti rendszer a technika korábbi állása szerinti számos transzpozonnal szemben további elõnnyel rendelkezik, nevezetesen, hogy kevésbé érzékeny a fokozott expresszálódás gátlásának nevezett jelenséggel szemben. Nevezetesen, még ha a találmány szerinti rendszerben a transzpozáz koncentrációját egy bizonyos határ fölé emeljük is, a transzpozáz akkor sem gátolja a transzpozíciós reakciót. A technika állása szerinti korábbi transzpozonok ilyen tulajdonsága, amely korlátozza a transzpozíciós reakciók bizonyos körét, néhány alkalmazásra, például génterápia bizonyos alkalmazásaira elõnytelen lehet. A találmány szerinti rendszer két nagyságrenddel nagyobb mennyiségû transzpozázzal terhelhetõ túl anélkül, hogy a fokozott expresszálódás jelenségét észlelnénk. Az SB és Frog Prince transzpozázok aminosavszekvenciájának az összehasonlítása céljából utalunk a 7. ábrára. A találmány szerinti transzpozonalapú integrációs rendszer további fontos elõnye az, hogy a transzpozáz elsõdlegesen csak a szubsztráttal lép specifikusan kölcsönhatásba, azaz a találmány fõ megvalósítási módjának (a) pontjában ismertetett fordított ismétlõdésekkel. Ennek az a jelentõsége, hogy a transzpozáz nem képes kölcsönhatásba kerülni olyan transzponálható elemekkel és azokat mobilizálni, amelyek eltérnek a Frog Prince transzpozonoktól és genomokban endogének (például humán vagy zebradánió genomokban). Ugyanígy, fordítva, a Frog Prince transzpozáztól eltérõ, endogén transzpozázok nem képesek Frog Prince transzpozonokat mobilizálni. A transzpozon-transzpozáz kölcsönhatás specificitása biztosítja az integrált transzgén stabilitását és az endogén gének stabilitását. A találmány szerinti, transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer egyik elõnyös megvalósítási módja szerint, a transzpozáz egy két részbõl álló nukleáris lokalizációs szignált tartalmaz, amelyet az. azonosító számú szekvencia képvisel, és/vagy a 6. azonosító számú szekvencia DNS-kötõ doménja és/vagy a 7. azonosító számú szekvencia által képviselt katalitikus domén, DD(34)E azonosítóval ( signature ). Más megoldás szerint, a nukleáris lokalizációs szignál, a katalitikus domén és/vagy a DNS-kötõ domén legalább 90%¹os, elõnyösen legalább 9%¹os és még elõnyösebben legalább 99%¹os régióazonosságot mutatnak az., 6. és/vagy 7. azonosító számú szekvenciákkal. Ami a találmány fõ megvalósítási módját illeti, a vad típusú szekvencia molekuláris módosításai elvégezhetõk a megvalósítási mód szempontjából mindaddig, amíg a fent ismertetett aktivitás megmarad. A találmánynak megfelelõen különösen elõnyös, ha a transzpozonalapú DNS-integrációs rendszerben a fenti transzpozáz aminosavszekvenciája legalább 90%¹os, elõnyösen 9%¹os, elõnyösebben legalább 98%¹os és legelõnyösebben legalább 99%¹os fokú azonosságot mutat az 1. azonosító számú szekvenciával. Egy további, legelõnyösebb megvalósítási mód szerint, a transzpozáz aminosavszekvenciája azonos az 1. azonosító számú szekvencia szekvenciájával. A találmány megvalósítási módja során a 0%¹os azonosság a vad típusú Frog Prince transzpozázra vonatkozik, amint azt a csatolt példákban ismertetjük. A találmány szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer egyik további megvalósítási módja szerint a hasznos polipeptid egy gén. A gén fogalma a technika állása szerint jól ismert, és az vonatkozik átíródott részre, valamint és 3 határoló régiókra egyaránt, ezen belül promoterre [lásd például: Biotechnology, 2. kiadás, szerk: H.¹J. Rehm és G. Reed, VCH, Weinheim, 666. oldaltól (1993)]. A leírásban használt értelemben a gén fogalma magában foglal mesterséges géneket is, ahol például az átíródott szekvencia heterológ promoter szabályozása alatt áll, és adott esetben, további heterológ szabályozóelemekkel, például heterológ enhanszerrel kapcsolt. Az adott gén kódolhat markereket, például a zöld fluoreszcens proteint in vivo monitorozás céljára, és riportereket, például luciferáz- vagy antibiotikumrezisztencia-géneket. A hasznos polinukleotid és elõnyösen gén lehet bármely, a természetben elõforduló vagy mesterséges polinukleotid vagy gén, például baktériumokból, vírusokból, bakteriofágokból vagy állatokból származó gén. A találmány egyik elõnyös megvalósítási módja szerint, a gén emlõsbõl, halból, kétéltûbõl, például békából, hüllõbõl vagy madárból származik. Különösen elõnyösen, az említett emlõs ember.

6 A hasznos polinukleotid különbözõ természetû lehet. Például, lehet nem kódoló természetû, ezáltal alkalmas lehet egy adott gén célzott megszakítására, amelynek fokozott expressziója szerepet játszhat valamely betegség etiológiájában. Egy további példa szerint, a transzpozon tartalmazhat promoterszekvenciákat, amelyek génexpressziót aktiválnak, amennyiben a transzpozon az endogén génhez megfelelõ közelségben inszertálódik. Elõfordulhat továbbá, hogy a transzpozon a transzpozícióhoz szükséges szekvenciákon felül nem tartalmaz egyéb szekvenciákat, amennyiben megfelelõ (például sejtek megváltozott fenotípusán alapuló) szelekciós eljárás rendelkezésre áll inszertek adott célban történõ azonosítására. Egy további lehetõség szerint, a hasznos polinukleotid szolgál szekvenciatoldalékként, amelyet aztán a transzpozon inszert azonosítására lehet alkalmazni. A találmány szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer egy további megvalósítási módja szerint, a fenti hasznos polinukleotid terápiásan aktív (poli)peptidet kódol. E megvalósítási mód szerint, terápiás értékû (poli)peptidek célzottan bevihetõk ilyen (poli)peptidre rászoruló sejtekbe. Amennyiben szövetspecifikus expresszióra van szükség, szövetspecifikus promoterek irányíthatják a fenti (poli)peptidek expresszióját. Terápiásan aktív (poli)peptid lehet bármely peptid vagy protein, amely adott betegség támadását vagy progresszióját elhárítja. A terápiásan aktív (poli)peptid közvetlenül vagy közvetve befolyásolhatja a fenti támadást vagy progressziót. Terápiásan aktív (poli)peptidek közé tartoznak a növekedési faktorok és differenciálódási faktorok családja, például GCSF, GM¹CSF, valamint interleukinok és interferonok, vagy olyan módosított ellenanyag-származékok, például scfvs, amelyek a szervezeten belül káros vegyületekhez kötõdnek. A transzpozonalapú rendszerek vektorként alkalmazhatók olyan monogénes betegségek génterápiájára, mint például a hemofília. A transzponálható vektor elembe VIII¹as vagy IX¹es véralvadási faktorokat kódoló, megfelelõ transzkripciós szabályozószekvenciával ellátott cdns¹ek juttathatók be. A transzpozáz a terápiás gének kromoszómákba történõ stabil integrációját közvetíti, ezáltal biztosítja a hosszú távú génexpressziót és a transzgén termékek szintjének emelkedését a szérumban. A találmány szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer egy további elõnyös megvalósítási módja szerint szükség van arra, hogy a fenti hasznos polinukleotid sirns¹sé íródjon át és szelektálható markert kódoljon. A polinukleotid hajtûkanyar-rns-molekulákká ( hairpin ) írható át, amelyek a kívánt cél expresszióját tekintve RNSi¹t mediálnak; további információért lásd például Elbashir és mtsai.: Nature 411, (01); Bernstein és mtsai.: RNA 7, (01); Boutla és mtsai.: Curr. Biol. 11, (01). A találmány szerinti transzpozonalapú rendszer alkalmazható RNSi expressziós kazetták kromoszómákba történõ stabil inszertálására, gének stabil génkiütésére gerincesek sejtjeiben. A megvalósításhoz szükséges, hogy a transzpozon szelektálható markert, például egy antibiotikum markergént, valamint RNSi expressziós kazettát tartalmazzon. A transzformáns sejtek például antibiotikumrezisztencia alapján szelektálhatók, és ezek a sejtek nagy valószínûséggel hatékonyan expresszálják az RNSi kazettát. Ez az eljárás leegyszerûsíti stabil RNSi klónok transzpozícióval történõ elõállítását és szûrését. A találmány egyik további megvalósítási módja szerint, a transzpozonalapú integrációs rendszerben a fenti hasznos polinukleotid tartalmaz egy intron illesztési akceptorhelyet ( intron splice acceptor site ), valamint egy szelektálható markergént, amely génbõl hiányzik a metionin startkódon és tartalmaz egy polia hozzáadott szignált az mrns stabilizálására. Ez a megvalósítási mód transzpozon vektoron belüli géncsapda expressziós kazettaként alkalmazható, transzpozíciós események expresszált génekben történõ kiváltására és szelektálására. Például, a géncsapda transzpozon hordozhatja az egéreredetû recézett 2 ( engrailed 2 ) intront, amely egy illesztési akceptorhelyet és egy szelektálható markert, például neomicinrezisztencia markergént tartalmaz, amelybõl hiányzik a kezdõ metionon kodon. Ennek megfelelõen, a szelektálható markergén expresszálódása csak úgy érhetõ el, ha egy endogén génnel fúziós protein jön létre. A géncsapda transzpozonkonstrukció transzpozázforrással együtt sejtekbe, például humán HeLa sejtekbe transzfektálható. A géncsapda transzpozonok egy része gének intronjaiba és nem transzlálódó régióiba inszertálódik, amelyek egy töredéke megfelelõ orientációba kerül ahhoz, hogy az endogén gén és a (példa szerinti) neo markergén között fúziós transzkripció jöjjön létre. Számos transzpozon inszerciót klónoztunk G418-rezisztens sejtklónokból. Az inszerciók mindegyike génekben történt. A géncsapda vektor aktívan átírt génekbe történõ integrációja lókusz-specifikus markerként szolgálhat élõ állatokban és címkéket ( tag ) biztosítanak szétdarabolt gének azonosítására. A találmány egyik további megvalósítási módja szerint, a transzpozonalapú DNS-integrációs rendszerrel szemben igény, hogy a fenti transzpozáz fokozott transzpozázaktivitást mutasson. Proteinek pontmutációs változatai, amelyek kódolószekvenciájukban enyhe módosítást hordoznak, gyakran mutatnak magasabb aktivitást, mint az eredeti változatuk. Ez okból, számos proteint módosítottak abból a célból, hogy hiperaktív változatokat kapjanak. Jól ismert példa a GFP ( Green Fluorescence Protein ) versus egfp protein (e jelentése fokozott, enhanced ), amelyet a természetben megtalálható proteinhez képest módosítottak, és laboratóriumi alkalmazásra jobb tulajdonságokat mutat. Hiperaktív transzpozázok jól ismertek továbbá baktériumokban (Tn) és rovarokban (Himar1). Beszámoltak róla, hogy ezek a transzpozázok 1¹2 nagyságrenddel magasabb szinten támogatják a DNS-transzpozíciót, mint az eredeti protein. Tekintettel a gerinces eredetû transzpozonok teljesítménye iránti magas elvárásra, elvégeztük a Frog Prince hiperaktív szûrését ( hyperactive screen vizsgálatát). Ettõl a kísérlettõl azt 6

7 vártuk, hogy az eredetihez viszonyítva 0-szor jobb teljesítményt nyújtó rendszert kapunk. A leíráshoz csatolt példák azt mutatják, hogy hiperaktív transzpozon rendszer elõállítására irányuló próbálkozásunk sikeres megközelítés volt. A találmány szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer egyik további megvalósítási módja szerint, az (a) szerinti transzpozont és/vagy a (c) szerinti polinukleotidot legalább egy vektor tartalmazza, azaz egy vagy több vektor tartalmazza (más megoldás szerint, a transzpozon elõállítható vektorszekvenciák nélkül, például körkörös formában). A találmány szerint, a fent ismertetett bármelyik polinukleotid esetében alkalmazott vektor lehet expressziós, géntranszfer vagy géncélzó ( gene targeting ) vektor. Expressziós vektorok szakember számára jól ismertek és széles körben hozzáférhetõk; lásd Ausubel és mtsai., loc cit. A találmány szerinti vektor ezen elõnyös megvalósítási módja szerint, a polinukleotid operatívan kapcsolódik olyan szabályozó szekvenciákhoz, amelyek lehetõvé teszik prokarióta vagy eukarióta sejtekben, vagy azok izolált frakcióikban való expressziót. A fenti polinukleotid(ok) expressziója tartalmazza a polinukleotid(ok) transzkripcióját, elõnyösen transzlálható mrns¹sé. Ennek megfelelõen, a transzpozon forrás lehet mrns. Más megoldás szerint, transzpozáz mrns¹t viszünk be az adott, hasznos sejtbe. Szabályozóelemek, amelyek biztosítják eukarióta sejtekben, elõnyösen emlõseredetû sejtekben való expressziót, szakember számára jól ismertek. Szokásosan a transzkripció kezdetét biztosító szabályozószekvenciákat és kívánt esetben a transzkripció befejezését és a transzkript stabilizálását biztosító poli¹a szignálokat tartalmaznak. További szabályozóelemek közé tartoznak transzkripciós, valamint transzlációs enhanszerek. Prokarióta gazdasejtekben történõ expressziót lehetõvé tevõ, lehetséges szabályozóelemek közé tartoznak például a lac, trp vagy tac promoterek az E coli-ban, és eukarióta gazdasejtekben történõ expressziót lehetõvé tevõ szabályozóelemekre példák az AOX1 vagy GAL1 promoterek élesztõben, vagy a CMC¹, SV¹, RSV-promoterek ( Rous sarcoma virus promoter ), CMV-enhanszer, SV enhanszer vagy globin intron emlõs- vagy más állati eredetû sejtekben. A transzkripció elindításáért felelõs elemeken kívül, az ilyen szabályozóelemek tartalmazhatnak továbbá transzkripciót leállító szignált, amilyenek például az SVpoli¹A vagy tk¹poli¹a helyek, a polinukleotidtól 3 ¹irányban. Ebben az összefüggésben, szakember számára jól ismertek olyan expressziós vektorok, mint például a pcdv1 (Pharmacia), pcdm8, prc/cmv, pcdna1, pcdna3 (In-vitrogene) és psport1 (GIBCO BRL) Okayama-Berg cdns expressziós vektorok. A génterápia, amely terápiás géneknek sejtekbe ex vivo vagy in vivo eljárásokkal történõ bevitelén alapulnak, a géntranszfer legfontosabb alkalmazása. In vitro vagy in vivo génterápiára alkalmas vektorokat, eljárásokat vagy génbeviteli rendszereket ismertet a szakirodalom, és azok szakember számára jól ismertek; lásd például Giordano: Nature Medicine 2, (1996); Schaper. Circ. Res. 79, (1996); Anderson: Science 26, (1992); Isner: Lancet 348, (1996); Muhlhauser: Circ. Res. 77, (199); Onodua: Blood 91, 36 (1998); Verzeletti: Hum. Gene Ther. 9, (1998); Verma: Nature 389, (1997); Anderson: Nature 391, 2 (Suppl. 1998); Wang: Gene Therapy 4, (1997); Wang: Nature Medicine 2, (1996); a WO 94/29469 és WO 97/0097 számú nemzetközi közzétételi iratokat; az US 80 89, US és US számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat, vagy Schaper: Current Opinion in Biotechnology 7, 63 6 (1996) és a bennük idézett szakirodalmi helyeket. Ezeket a vektorokat és/vagy génátviteli rendszereket ismertetik továbbá génterápiás megközelítésben, például neurológiai szövetben/sejtekben [többek között lásd például Blömer: J. Virology 71, (1997)] vagy a hipotalamuszban [többek között lásd például Geddes: Front Neuroendocrinol., (1999) vagy Geddes: Nat. Med. 3, (1997)]. Neurológiai szövetekben/sejtekben alkalmazható, további megfelelõ génterápiás konstrukciók ismertek szakember számára, lásd például Meier: J. Neuropathol. Exp. Neurol. 8, (1999). A találmány szerint alkalmazott vektorok tervezhetõk közvetlen bevitelre, vagy bevihetõk sejtekbe liposzómák, vírusvektorok (például adenovírus- vagy retrovírus-vektorok), elektroporáció, ballisztika (például génpuska) vagy más beviteli rendszer alkalmazásával. Ezen túlmenõen, a találmány szerinti nukleinsavmolekulák számára eukarióta expressziós rendszerként bakulovírus rendszer alkalmazható. A bevitel és a génterápiás megközelítés funkcionális molekula, elõnyösen terápiásan aktív molekula expressziójához kell vezessen, amely expresszált molekula elõnyösen alkalmas bármely olyan betegség kezelésére, javítására és/vagy megelõzésére, amely betegség génterápiás megközelítéssel kezelhetõ, javítható és/vagy megelõzhetõ. Egy kiemelten elõnyös megvalósítási mód szerint, a fenti vektorok közül legalább egy plazmid. A plazmidok szakember számára jól ismertek, és rekombináns célokra ismertetik például Sambrook és mtsai.: [ Molecular Cloning, A laboratory manual, 2. kiadás, CSH Press, Cold Spring Harbor, (1989); Ausubel és mtsai.: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (01)]. A plazmidok kis, extrakromoszomális, általában körkörös alakú, kettõs szálú DNS-molekulák, amelyek autonóm replikációra képesek. A természetben elõfordulnak prokariótákban és eukariótákban egyaránt, és általában legalább egy replikációs origót (kezdõhelyet) és kisszámú gént tartalmaznak. A plazmidalapú vektor forma különösen elõnyös, mivel elõállításuk egyszerû és költségkímélõ, valamint nagy mennyiségben végezhetõ. A találmány tárgyát képezi továbbá a találmány szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszerrel transzfektált vagy transzformált gazdasejt. A találmány szerinti gazdasejt lehet prokarióta sejt, azonban a gazdasejt elõnyösen eukarióta sejt, például Spodoptera 7

8 frugiperda sejt, élesztõsejt, például Saccharomyces cerevisiae vagy Pichia pastoris sejt, gombasejt, például Aspergillus sejt, vagy gerincesbõl származó sejt. Az utóbbi tekintetében, a gazdasejt elõnyösen emlõseredetû sejt, például humáneredetû sejt. A gazdasejt lehet sejtvonal része. A találmány tárgyát képezi továbbá nem humán transzgenikus állat, amely tartalmazza a leírás (a) pontja szerinti transzpozont vagy a találmány szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszert, amely állat genomjában stabilan integrálva hordozza az összetevõk legalább egyikét vektor, vagy körkörös formában. A transzgenikus állat lehet bármely, manipulálásra alkalmas állat, és ahol a manipulálás eredménye transzgenikus állat. Az állat elõnyösen emlõsállat, például patkány vagy egér. Más megoldás szerint lehet hal, például zebradánió vagy kétéltû, például béka. A fentiekkel összhangban, a találmány tárgyát képezi továbbá a találmány szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer alkalmazása olyan gyógyszer elõállítására, amely alkalmas a hasznos polinukleotid átvitelére gerinces állat sejtjeibe azáltal, hogy a találmány szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszert beviszi a fenti sejtekbe. Elõnyösen az átvitelt in vitro végezzük. A találmány további elõnyös megvalósítási módja szerint a fenti átvitelt in vivo végezzük. A találmány még elõnyösebb megvalósítási módja szerint (a) olyan sejteket szelektálunk, amelyekben a polinukleotid stabilan integrálódott a sejtek kromoszómáiba, és ahol (b) a fenti sejteket vagy azokból származtatott sejteket ugyanazon gerinces fajba visszük be vagy visszük vissza. Az olyan sejtek szelektálása, amelyekben a polinukleotid stabilan integrálódott a kromoszómákba, végezhetõ fizikálisan, a transzpozon és a kromoszomális DNS közötti kovalens kapcsolat kimutatásával (például PCR alkalmazásával, a transzpozonszekvenciát egyedi szekvenciatoldalékként alkalmazva). A technika állása szerint, különbözõ eljárások ismertek ilyen transzfer létrehozására. Következésképp, számos különbözõ eljárás ismert a transzpozon rendszer komponenseinek sejtekbe történõ bejuttatására. Mivel a csupasz plazmid-dns sejtekbe történõ bevitele rendszerint nem elég hatékony, azt elõnyösen más, a sejtmembrán penetrációjára képes molekulákkal társítják vagy kapcsolják. A génpuskák DNS-sel bevont kicsiny részecskéket alkalmaznak, amelyeket a sejtekbe lõnek, ezáltal juttatják oda rakományukat, vagy nagy sebességû oldószerrel juttatnak (DNS-oldatot) élõ sejtekbe. A közös elv DNS fizikai úton történõ bejuttatása sejtekbe, a sejtmembránokon keresztül történõ nagy sebességû penetrációval. Liposzómákat DNS kisméretû, mesterséges membránrészecskékbe történõ becsomagolására használnak, amelyeket a sejtmembránnal fuzionáltatnak, vagy endocitózis révén vétetnek fel a sejtekkel, így juttatva be a DNS-rakományt. Az elektroporáció nagyfeszültségû elektrosokkot alkalmaz DNS sejtmembránokon keresztül történõ bejuttatására. Az adenovírus-polilizin komplexek alkalmazása az adenovírusok azon természetes képességén alapul, hogy képesek sejteket megfertõzni. Ezeknek a módszereknek a leírása megtalálható a következõ szakirodalmi helyen: Current Protocols in Human Genetics (1997). A jelen találmány szerint elõnyösek azok az eljárások, ahol a transzfert génpuska alkalmazásával érik el, vagy liposzómák polietilénimin, adenovírus-polilizin-dnskomplexek, lipfokeció, elektroporáció, transzfekció vagy infekció/transzdukció által közvetített vagy támogatott géntranszferrel érik el. Amennyiben az infekció lehetõségét választjuk, elõnyös, ha az infekció vagy transzdukció rekombináns retrovírus, rekombináns adenovírus, rekombináns herpeszvírus vagy rekombináns adenoasszociált vírus által közvetített vagy támogatott. A találmány szerinti alkalmazás egy elõnyös megvalósítási módjai szerint, az említett sejtek szomatikus sejtek. Szomatikus sejtek manipulációjával kapcsolatosan különösen elõnyös, ha a gerinces emlõs, hal, kétéltû, hüllõ vagy madár. Legelõnyösebben, az emlõs ember. A jelen találmány szerinti alkalmazás egy további elõnyös megvalósítási módja szerint, az említett sejtek nem humán csírasejtek. Csírasejtek manipulációjával kapcsolatosan különösen elõnyös, ha a gerinces nem humán emlõs, hal, kétéltû, hüllõ vagy madár. Nem humán csírasejtek vonatkozásában elõnyös, ha az említett sejtek pluripotens vagy multipotens sejtek. Az említett különbözõ elõnyös megvalósítási módokban történõ megfelelõ alkalmazás magában foglalja továbbá az említett nem humán csírasejtek vagy említett nem humán csírasejtekbõl származó sejt ugyanolyan fajú gerincesbe történõ visszajuttatását követõen a transzgenikus gerinces állat felnevelését, ahol az említett gerinces vagy transzgenikus gerinces nem humán. Transzgenikus állatok létrehozására a fentiekben röviden utaltunk, és az a technika állása szerint jól ismert módszer. Transzgenikus nem humán állat, például transzgenikus egerek létrehozására alkalmas eljárás, a fentiekben említettek szerint polinukleotid- vagy célzóvektor alkalmazásán alapul, amelyet nem humán csírasejtbe, embrionális sejtbe, õssejtbe vagy petesejtbe, vagy azokból származó sejtbe juttatnak. A nem humán állat a leírásban ismertetett szûrõ eljárás szerint alkalmazható. Transzgenikus embriók létrehozása és azok szûrése végezhetõ például a következõ szakirodalmi helyeken ismertetettek szerint: A. L. Joyner szerk., Gene Targeting, A Practical Approach (1993), Oxford University Press. Az embriók embrionális membránjának DNS¹e analizálható például Southern-blotokkal, megfelelõ próba alkalmazásával. Transzgenikus, nem humán állatok létrehozására alkalmas általános eljárás a technika állása szerint jól ismert, lásd például a WO számú nemzetközi közzétételi iratban ismertetetteket. Transzgenikus, nem humán organizmusok (ezen belül célzott homológ rekombinációval elõállított nem humán állatok) elõállítására embrionális 8

9 csírasejtek (ES-sejtek) elõnyösek. Homológ géncélzás ( gén-targeting ) céljára alkalmazhatók egér ES¹sejtek, például mitotikusan inaktív SNL76/7 tápláló sejtrétegen tenyésztett AB 1-vonal [McMahon és Bradley: Cell 62, 73 8 (1990)], lényegében a következõ szakirodalmi helyen leírtak szerint: Robertson, E. J.: Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach. E. J. Robertson, szerk., (Oxford: IRL Press), (1987). További alkalmas ES¹vonalak például, anélkül, hogy igényünket azokra korlátoznánk, az E14- vonal [Hooper és mtsai.: Nature 326, (1987)], a D3¹vonal [Doetschman és mtsai.: J. Embryol. Exp. Morph. 87, 27 4 (198)], a CCE-vonal [Robertson és mtsai.: Nature 323, (1986)], és az AK 7-vonal [Zhuang és mtsai.: Cell 77, (1994)]. ES-sejtekbõl specifikus, célzott mutációt hordozó egér vonal létrehozásának sikere az ES¹sejtek pluripotenciájának függvénye (azaz, azon képességük függvénye, hogy gazdába injektálva embrióvá fejlõdjenek, például blasztocitává vagy morulává, hogy részt vegyenek az embriogenezisben, és hozzájáruljanak a létrejövõ állat csírasejtéihez). Az injektált ES¹sejteket tartalmazó blasztocitákat álvemhes, nem humán nõstények méhében hagyják fejlõdni, és például kiméra egerekként hozzák világra. A kapott transzgenikus egér a rekombinázt vagy riporter lokuszokat tartalmazó sejtekre nézve kiméra, és azt visszakeresztezik, és az utódok farokbiopsziájából nyert DNS¹en, PCR vagy Southernblot-analízissel a helyesen célzott transzgén(ek)re szûrik, hogy rekombinázra vagy riporter lokuszra/lokuszokra transzgenikus egereket azonosítsanak. Transzgenikus muslicák, például Drosophila melanogaster elõállítására szolgáló eljárások leírása a technika állása szerint szintén megtalálható, lásd például a következõket: számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; Brand és Perrimon, Development 118, 1 41 (1993); valamint Phelps és Brand: Methods 14, (April 1998). Transzgenikus férgek, például C. elegans elõállíthatók például az alábbi eljárások szerint: Mello és mtsai.: Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. Embo J., (1991), Plasterk: Reverse genetics: from gene sequence to mutant worm. Methods Cell. Biol. 48, 9 80 (199). Valamennyi, transzgenikus állat vonatkozásában eddig ismertetett bejelentés két, három vagy több transzgént hordozó állatokra is vonatkozik. Kívánt lehet az is, hogy valamely protein expresszióját vagy funkcióját a transzgenikus állat fejlõdésének és/vagy életének bizonyos szakaszában inaktiváljuk. Ez elérhetõ például szövetspecifikus, fejlõdés- és/vagy sejtszabályozás alatt álló és/vagy indukálható promoterek alkalmazásával, amelyek például a kódoló RNS¹t kódoló RNS-transzkript elleni antiszensz vagy ribozim expresszióját irányítják. Alkalmas indukálható rendszer például a tetraciklin-szabályozott génexpresszió, amint azt például a következõ szakirodalmi helyeken leírták: Gossen és Bujard: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 47 1 (1992), valamint Gossen és mtsai.: Trends Biotech. 12, 8 62 (1994). Hasonlóképpen, ilyen szabályozóelemek irányíthatják a mutáns protein expresszióját. Ezen túlmenõen, az így elõállított transzgenikus állatban, amelynek sejtjei (elõnyösen genomjukban stabilan integrálva) tartalmazzák a nukleinsav-molekulának vagy annak részének a transzkripcióját vagy expresszióját[.], a kívánt protein szintézise redukálható. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint, a redukció végezhetõ antiszensz, szensz, ribozim, ko¹szuppresszió és/vagy domináns mutáns hatással. Antiszensz és antiszensz nukleotid kifejezés alatt olyan DNS- vagy RNS-konstrukciókat értünk, amelyek a természetben elõforduló géntermék elõállítását blokkolják. Ennek elérésére alkalmazott eljárások szakember számára jól ismertek. Ide tartoznak például antiszensz-rns, ribozimek és sirns expressziója, valamint olyan molekuláké, amelyek egyesítenek antiszensz és ribozim funkciókat és/vagy olyan molekulák, amelyek ko¹szuppressziós hatást fejtenek ki; lásd fentebb. Amennyiben antiszensz megközelítést alkalmazunk, hogy sejtekben a kívánt proteinek mennyiségét redukáljuk, az antiszensz-rns¹t kódoló nukleinsav elõnyösen homológ eredetû a transzformáláshoz alkalmazott állatfajjal. Lehetséges azonban olyan nukleinsavmolekulák alkalmazása is, amelyek nagyfokú homológiát mutatnak a kívánt proteint kódoló, endogén elõforduló nukleinsavmolekulákkal. Ez esetben a homológia foka elõnyösen 80%-osnál nagyobb, elõnyösebben 90%-osnál nagyobb, még elõnyösebben 9%-osnál nagyobb. Transzgenikus eukarióta sejtekben a kívánt protein szintézisének a redukciója változást idézhet elõ például a kalcium-szignálozásban. Ilyen sejteket tartalmazó transzgenikus állatokban ez különbözõ élettani, fejlõdési és/vagy morfológiai elváltozásokhoz vezethet. Amennyiben nem humán csírasejteket vagy nem humán csírasejtvonalakból származtatott csírasejteket, például blasztociszta stádiumban levõ sejteket manipulálunk, elõnyös, ha a fenti bevitelt vagy visszavitelt spermával[.6], mikroinjektálással vagy génpuskával mediáljuk vagy váltjuk ki. Ezen túlmenõen, a találmány tárgyát képezi RNSi elõállítására alkalmas in vitro eljárás, amely az alábbiakat tartalmazza: (a) a találmány szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer részét képezõ transzpozon sejtbe történõ stabil bevitelét, ahol a fenti hasznos polinukleotid sirns¹sé íródik át és szelektálható markert kódol; (b) a szelektálható markert expresszáló sejtek szelektálását, és (c) annak megállapítását, hogy a kívánt gén transzkripciójára/transzlációjára hatással van¹e az RNSi. A találmány szerinti ezen eljárás alkalmazását a találmány szerinti, fenti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer megfelelõ megvalósítási módjával összefüggésben ismertetjük. Ezek az alkalmazások, valamint a találmány szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszerrel kapcsolatban ismertetett elõnyös 9