Génátvitel magasabb rendű állatokba elméleti megfontolások, gyakorlati eredmények és génterápiás lehetőségek

Átírás

1 MEZÕGAZDASÁGI BIOTECHNOLÓGIÁK Génátvitel magasabb rendű állatokba elméleti megfontolások, gyakorlati eredmények és génterápiás lehetőségek Tárgyszavak: génátvitel; transzfekció; transzgenézis; génterápia; embriósejtek. A génátvitel történetének fő állomásai: az 1970-es években külső DNS-konstrukciók in vitro bevitele magasabb rendű eukarióta (sejtmaggal rendelkező) sejtekbe, az első emlős (egér) csírasejttel, azaz éppen megtermékenyített petesejttel végzett (germline) transzgenezise az 1980-as évek elején, jelenleg az állat- (és növény-) fajok és osztályok hosszú sorának férgek, kétéltűek, rovarok, halak, csirke, patkány, nyúl, macska transzgénikus változatai ismeretesek, terápiás célú génátvitelt emberen 1990 óta alkalmaznak, egyelőre szerény klinikai eredménnyel. A génátvitellel létrehozott transzgénikus állatok felhasználhatók az alap- vagy alkalmazott kutatás modelljeiként és mint gyógyászati hatóanyagok vagy átültetéshez humánkompatibilis szervek új forrásai. Magasabb rendű eukarióták génátvitele a humángyógyászatban közvetlenül alkalmazható mint szomatikus ( testi ) génterápia, vagyis sejtegyüttesek genetikai manipulálása vagy mint csíravonali génterápia, vagyis a genetikai információ módosítása a csírasejtben, amit emberen még nem alkalmaztak (kivéve idegen mitochondrium bevitelét megtermékenyítés közben, egyetlen alkalommal). Sejttípusok Petesejt A frissen megtermékenyített petéből (zigótából) a genetikai beavatkozás nyomán elvben olyan szervezetnek kell fejlődnie, amelynek minden sejtje (azonosan) módosult, ezért a zigóták a transzgenezis ideális célpontjai. Az

2 ovuláció után gyűjtött peték átalakítást követő megtermékenyítése ugyanis csak in vitro eljárással lehetséges, ami a potenciálisan transzgénikus csírasejtet újabb ex vivo műveletnek tenné ki. Marad tehát a már megtermékenyített zigóták manipulálása, mivel az ovuláció előtti genetikai módosítás sem járt sikerrel. A már osztódásnak indult petén egynél több sejt átalakítása technikailag alig oldható meg, így a kifejlődő mozaik szervezet eredeti és transzgénikus sejteket tartalmaz a beavatkozáskor érvényes osztódási stádiumtól függő megoszlásban. A mozaikosodás nem feltétlenül hátrányos, pl. ilyen transzgénikus szervezet termelhet transzgént hordozó gamétákat (hímivarsejteket), ezáltal a következő nemzedék egésze transzgénikus lehet. A peték használatának az a fő korlátja, hogy nehéz a módosításhoz a genom bizonyos befogadó helyeit megcélozni, ugyanis az ezeknek megfelelő transzgénikus változatok aránya a többi, véletlenszerűhöz képest olyan kicsi, hogy nem választhatók ki. Megjegyzendő azonban, hogy vannak nem célzott helyű, mégis hasznos génbevitelek: transzgén-expresszió szabályozása külső hatóanyag beadása útján, hormontermelő szövet kiiktatása toxintermelő transzgén expressziójával, a VIII-as humán véralvadásgátló tényező termelődése transzgénikus birka tejében. Embrionális őssejtek Más tenyésztett sejtvonalakkal ellentétben az embrionális őssejtek (embryonic stem cells, ES-cells) több héten át megtartják eredeti kariotípusukat (magállapotukat) és totipotens voltukat (bármely specializálódásra való alkalmasságukat). Az ES-sejtek in vitro tenyészetben genetikailag módosíthatók, mégpedig speciális hatóanyagok segítségével szelektív módon, így felhasználhatók külső gén expressziójának megszüntetésére (gén- knockout ), ugyancsak célzott génkorrekcióra és -helyettesítésre, valamint génbefogás ( géncsapda ) jelzésére. Az ES-sejtek használatát korlátozza, hogy ezidő szerint kizárólag egér blastocysta belső sejttömegének (inner cell mass, ICM) sejtjeiből tenyészthetők. Lehetséges, hogy egérben e sejttípus belső mutációja szükséges ES-sejtekké való fejlődésükhöz, ez esetben még bizonyára hosszú idő telik el, amíg más állatokban találnak ES-sejtek tenyésztésre alkalmas szövetet vagy sejtképződményt. A sejtmagátvitel lehetőségei Újabb kutatások beszámolnak juhdonor sejtmagjainak sikeres átviteléről és átprogramozódásáról megtermékenyítetlen, magfosztott petesejtbe mint

3 univerzális befogadóba. A testi sejtekből vett sejtmagokat a transzfer előtt minimális tápanyagot tartalmazó közegben, a visszaszorított DNS-replikálódás és génexpresszió állapotában tartották. Néhány esetben embrió fejlődött ki, jelezve, hogy a donor sejtmagja totipotenssé programozódott át. Az embrióból pótanyák utódokat hordtak ki, amelyekben genetikai teszttel kimutatták a donorsejt DNS-ét. Ezt a kísérletet más fajok (macska, kecske, sertés) tenyésztett sejtekből való klónozása követte. A fenti sikeres klónozásnak az a jelentősége, hogy transzgének in vitro bevihetők donorsejtbe, és ilyen módon sejtmagtranszfer útján genetikailag módosított állatok, mégpedig, minthogy a donorsejtekből válogatni lehet, megcélzott génmódosítású egyedek hozhatók létre. A Nature 2000-ben hírt adott a fenti elven létrehozott bárányokról, amelyek genomja gyógyhatású transzgént hordozott az endogén promoter szomszédságában, tehát a kijelölt helyen. Előzőleg G418-rezisztens fibroblasztokat tenyésztettek redukált szérumban, majd beültették őket magfosztott oocitákba. 470 így rekonstruált embrióból 14 élő bárány született, genomjukban a transzgénnel a kívánt helyen. Hasonló sejtmagátvitelt ismertet a Science egyik évi száma: itt a megcélzott hely sertésmagzat fibroblasztjában az α-1,3-galaktoziltranszferázgén mellett volt. Ezúttal 338 embrióból hét malac jött élve a világra, és közülük négyben mutatták ki a módosított DNS-t. További közléseket is figyelembe véve megállapítható, hogy a magátvitellel más fajokon is elvégezhetők az ES-sejtekkel egérre közöltekhez hasonló transzgénikus műveletek, de az élő transzgénikus állatok számával mért hatékonyság csupán 1-3%-os. Problematikus az élve született utódok állapota is: debilisek, rendellenesen fejlettek, az említett 15 bárány közül hét csupán 30 órát, négy 12 hetet élt, a malacok közül is kettő elpusztult röviddel, egy 17 nappal megszületésük után, és csak egy látszott minden abnormitás nélkülinek. Az életképességi gondok azonban nem a célzott génátvitellel, hanem magával a sejtmagtranszferrel függnek össze. A kutatók valószínűsítik, hogy az in vitro tenyésztés által megváltozott génexpresszió okozza a rendellenességeket, amelyek tehát nem örökletesek, azaz epigenetikai jellegűek és a túlélők utódainak egészségi állapotát már nem befolyásolják. Spermiumok Minthogy a spermiumok természetes feladata DNS-t átadni a petesejtnek, elvben felhasználhatók transzgénhordozóként. A gyakorlatban azonban ez nem bizonyult a csíravonali transzgenezis használható megoldásának. Eredményesebb volt a transzgén bevitele spermaőssejtekbe. E célból a transzgénkonstrukciót egérherébe fecskendezve, a spermiumok 60-70%- ában, majd az ezekkel való megtermékenyítés útján született utódok 7,5%- ában találták meg a transzgént.

4 A transzgénbevitel módszerei Retrovírus-fertőzés A retrovírusok genetikai anyaga az RNS, amelynek átírását, fertőzés után a vírus által kódolt, fordított transzkriptáz enzim végzi el. Az így létrejött egyszálas DNS kétszálassá replikálódva képes lineárisan kapcsolódni a gazdaszervezet DNS-éhez. A retrovírusgenom külső DNS hordozója is lehet. A petéket egy ilyen retrovírus-vektor nagy koncentrációjában inkubálva, a túlélő embriók 10 50%- a megfertőződik. Ezek kihordó nőstényben transzgénikus utódokká fejlődnek, és az embriók a transzgént átadják a következő nemzedéknek is. A vírusfertőzés bevihető összetett szövetekbe, tehát kifejlett egyedekbe is, ami szomatikus gyógymódokra ad alkalmat. A retrovírusok előnyei a transzgén könnyű bevitele (mivel a vírusnak természetes eszközei vannak külső genetikai anyagnak endogén DNS-be való beépítéséhez), a beépítés egyedülálló formája: transzgénpozitív sejtekből genomonként egyetlen intakt másolat épül be. Korlátozó tényezők és egyéb probémák A vírust alkotó nagy DNS-fehérje komplexum nem fér át a sejtmag pórusain, ezért csak az osztódás állapotában levő gazdasejtbe tud behatolni, és ott vektorként működni. Ebből következik, hogy a retrovíruson alapuló génterápia nem alkalmazható számos szövetre, ill. szervre (pl. a vesére), a petének az infekció előtt legalább nyolcsejtes fázisban kell lennie, ami a mozaikosodás veszélyével jár. A retrovírus vektor legfeljebb 9-10 kb hosszúságú transzgénszekvenciát vihet magával. A transzgén gazda-dns-be való integrálódásának kromoszómahelye véletlenszerű lévén, expressziója nem állandó és reprodukálhatatlan. Így ugyanazon vektor/transzgén konstrukcióval különféle transzgénikus egyedek jönnek létre, az éppen eltalált kromoszómakörnyezetek más-más hatásai következtében. A beépített retrovírus spontán reaktiválódása, azaz feléledt fertőzőképessége sohasem zárható ki teljesen, mivel ha ellenőrzött laboratóriumi közegben nem is másutt megjelenhet egy segítő retrovírus, amely pótolja a normális életciklushoz szükséges szekvenciákat. A retrovírus-fertőzés a gyenge immunrendszerű személyeket a közvetlen ártalmon kívül, rákkeltéssel is fenyegeti.

5 Mikroinjekció Már 1980-ban kimutatták, hogy külső DNS bevihető a genomba egyszerűen a klónozott DNS oldatának befecskendezésével a zigótába. Ezután a mikroszkóp alatt a petébe fecskendezett mikroinjekció lett a csíravonali transzgenézis leggyakoribb eszköze, bármilyen állatfajjal végzett kísérletekben. A mikropipettával kb. 400 DNS-molekula kerül a megtermékenyített pete pronucleusába. A kihordó anyaméhébe ültetett petékből fejlődött utódok 10 40%-a transzgénikus. Ezzel a módszerrel a transzgént tartalmazó DNS véletlenszerűen és a kromoszóma egyetlen helyén épül be az endogén DNS-be. A transzgén másolatainak száma az integrálódás helyén egytől több ezerig terjed. A kapcsolódás körül előfordulnak kihagyások, kettőződések, a beépülés mechanizmusa alig ismert. Kiderült, hogy a mikroinjekcióval nyert egyedek 85%-át transzgénikus és nem transzgénikus sejtek mozaikja alkotja. Ezek 12 25%-ában a külső DNS az embrionális sejtreplikáció későbbi szakaszában integrálódott, így a kifejlett példány (egér) kisebb arányban tartalmazza a transzgént. A mikroinjekció nem kíván méretkorlátozást, így a petébe bejuttathatók génből és promoterből, esetleg további hasznos szekvenciákból álló konstrukciók: A strukturális génekkel kombinált szervező promoterek β-aktin, hiszton H4 irányítják sok sejttípusban és fejlődési szakaszban az átírás magas fokát. Szabályozó promoterrel a műveletet csíravonali génterápiákra vetítve a kezelés egy speciális szövetre vagy szervre lokalizálható. Más alkalmazásban egy új típusú idegen gén expresszióját a test olyan részére lehet irányítani, ahol a génterméknek nincs negatív hatása és könnyen kinyerhető. Így lehetett kitermelni transzgénikus állatok tejéből olyan gyógyászati értékű termékeket, mint a IX-es humán faktor és az ugyancsak humán α-1-antitripszin. A bevitt konstrukció mindkét esetben a hatóanyag génjét és juh β-globulin promoterét tartalmazta. A génexpresszió külső, pl. kísérleti célú szabályozására felhasználhatók az ún. késztetéses, indukálható promoterek (inducible promoters), amelyek bizonyos környezeti, pl. hőmérsékleti jelekre vagy étrendi tényezőkre, leginkább cink megjelenésére reagálnak, és amelyekkel a strukturális gén tetszés szerint ki- és bekapcsolható. Így a metallotionein (MT) promoter egy növekedési hormon (NH) génjéhez kötve kiváltja a hormon termelését, ha a transzgénikus egyednek cinket adagolva, az MT működésbe lép. Bizonyos működések időszakos felfüggesztése provokálható (indukálható) promoter segítségével, ami a gyógyászatban is hasznos lehet.

6 Jelenleg fejlesztés alatt állnak a transzgén expresszióját szabályozó különféle promoterrendszerek. A legígéretesebbek közülük azok, amelyek az aromás szénhidrogénnel vagy szteroid hormonnal késztethető természetes promoterrel működnek. A befogadó genomba véletlenszerűen integrálódó transzgénszekvenciák expressziója gyakran alacsony szintű, máskor időbeli vagy térbeli értelemben rendellenes ( ektopikus ). Ennek fő oka az ún. pozícióeffektus, vagyis a genetikai környezet befolyása a transzgén expressziójára. Ezt kedvezőtlen esetben ellensúlyozni lehet a beépíthető egységben fokozó (enhancer) szekvenciával, vagy ki lehet küszöbölni a transzgén beágyazásával egy elszigetelő mátrixba, amely a gén mindkét oldalához csatlakozik, és vele önálló kromoszómatartományt képez, a pozícióeffektus elkerülésének legbiztosabb módja a transzgén célba juttatása az ES-sejtek alkalmazásának és a sejtmag átvitelének ismertetett módszerével, de ehhez a mikroinjekció még technikai fejlesztést igényel. Knockout -alkalmazások Géntranszferrel nemcsak szaporítani lehet a szervezetek génfunkcióit, meg is lehet szüntetni nemkívánatos funkciókat. Bizonyos génfunkcióktól megfosztott modellállatok jó szolgálatot tehetnek a tudományos orvosi kutatómunkában. Amennyiben a kijelölt helyű génbeültetés (még módszertani javításra szoruló) technikái tökéletesednek és ideális esetben a transzgén elroncsolja a nem kívánt funkciójú endogén DNS-t, teljesen megszüntetve expresszióját, akkor ilyen funkciók kiiktatására több eljárás kínálkozik. Egy toxingén (pl. az A-diftériatoxiné) speciális promoterrel való fúziója nyomán azok a sejtpopulációk, amelyekben ez a promoter aktív, a sejten belüli toxintemelés következtében elhalnak vagy nem növekednek. Egy másfajta megközelítés egy vírusgént, a timidinkináz-(tk) gént használ fel a transzgén expressziós részeként. Eszerint a transzgénikus állatnak (majdan a génterápiával kezelendő betegnek) rendszeresen adagolnak gancyclovirt (GCV) egy mérgező timidin-analogont. A GCV nem mérgező, amíg nem foszforilálja a virális tk-gén. A foszforilált GCV DNS-replikálódás közben épül be a sejtben levő genomba, elpusztítva a sejtet, tehát csak a transzgént tartalmazó és kifejező osztódó sejtek halnak el. A promotor kiválasztásával itt is meghatározható, hogy mely (transzgénhordozó) sejtek fejezzék ki a tk-gént. A tk/gcv-eljárás feltehetően alkalmazható lesz a rák génterápiájában, különösen két előnyénél fogva:

7 a transzgénikus aktivitást GCV-adagolással be lehet kapcsolni akkor és csak akkor, amikor szükséges, csak osztódó sejtek esnek ki. Antiszensz DNS módszere akkor alkalmazható, ha pontosan ismert a gén kiiktatandó szekvenciája. Az ellenirányú DNS a saját gén át nem írt szálának szekvenciáját képviseli. A transzgén-konstrukció elkészítéséhez az izolált szerkezeti gént megfordítva csatolják promoteréhez. Ennek a beépített transzgénnek az expressziója nyomán antiszensz RNS-transzkriptum keletkezik, amely hibridizálódik az (elkülönített kromoszómahelyen levő) saját gén által létrehozott helyes irányúakkal. Az így képződő kettős RNS-ek nem tudnak részt venni a normális transzlációs mechanizmusban, ami nem engedi meg a gén expresszióját. Terápiás felhasználásban a fenti típusú transzgén-konstrukció, integrálódva a beteg genomjába, antiszensz RNS termelésével megakadályozhatja a vírusszaporodást. Ilyen konstrukciók a rákterápiában is kipróbálhatók. Mikroinjekció használatának korlátai A pete-pronukleuszba juttatott injekció fő használati akadálya a költség. Bármilyen egyszerű az elv, magához a művelethez a kiváló minőségű mikroszkópon, a különleges kivitelű mikromanipulátorokon, inkubátoron, mikropipetta-kezelő szerkezeteken kívül bonyolult egyéb felszerelés szükséges. A mikroinjekciós technika elsajátítása több évet, a teljes végrehajtás pedig olyan koncentrációt igényel, hogy hetenként csak egy napon lehet a feladattal foglalkozni. Egérpeték kezelése mikroinjekcióval megszakítatlan hat órai munka, amit a megtermékenyítés és a pronukleáris fúzió közötti biológiai időablak szab meg. A költségeket tetézi a transzgénikus egyedek előállításának igen gyenge hozama. A laboratóriumokban alkalmanként mintegy 200 egérpetét fecskendeznek be, az ebből származó utódok közül 2 8 a transzgénikus példány. A hatásfok tehát 4%, más emlősökön pedig az 1%-ot sem éri el. Ennek az egerekkel szerzett sokkal nagyobb gyakorlat mellett az az oka, hogy a tehén-, sertés- és juhpete pronukleusza az egérénél kisebb, emellett opálos, így nehéz eltalálni és a petekárosodást felismerni. A költségnél alapvetőbb korlátozó mozzanat a transzgén véletlenszerű beépülése a kromoszómába, többek között a bizonytalan pozícióeffektussal súlyosbítva. Ennek következtében szinte minden mikroinjekcióval nyert transzgénikus példányt egyedülinek kell tekinteni. A külső DNS elroncsolhat, tehát inaktiválhat egy saját gént, tehát ismeretlen számban mutánsok is képződnek.

8 A génátvitel egyéb eljárásai Fertőzés vírussal Génátvitelre magasabb rendű állatokban főként az ismertetett retrovírus-fertőzés (szomatikus sejt felhasználásával) és a mikroinjekció (éppen megtermékenyített petesejtbe, ún. csírasejtbe adva) szolgál, de számos más módszert is alkalmaznak vagy javasolnak. A vírusok, a csupán osztódó sejteket fertőző retrovírusokkal ellentétben, vektorként esetleg szélesebb skálán alkalmazhatók a szomatikus sejtekkel végzett génterápiában. Kísérletek folynak adenovírusokkal (Ad), hepatitisz δ-vírussal (HDV) és herpeszvírusokkal (HSV). Az adenovírusok nagyméretű (38 kb-ig) transzgént is elbírnak, emellett nagyfokú a gazdasejt-/fajspecifkusságuk, tehát számos szövet és szerv kezelhetőségére adnak reményt. A transzgén expressziója egyetlen kezelés után 1 éven át tart. Mivel a kezelés általi vírusos megbetegedés és a vírusgenom beépülése a gazda kromoszómáiba egyaránt igen ritkán fordul elő, az adenovírusos génterápia a retrovírusosnál nagyobb biztonságot ígér. A HDV mint önreplikálódó vírus sejtenként másolat termelésére is képes, ami nagy génterápiás előny, de magában rejti a csírasejtfertőzés veszélyét. Emellett potenciális sejtméreg, hatását azonban genomjának módosításával mérsékelni lehet. A HDV igazi korlátja a mérete: 1,7 kb, amely alkalmatlanná teszi nagyobb exogének transzferjére. A herpeszvírusok előnye, méretükön ( kb) kívül, hogy a gazdaszervezetben állandó latens fertőzést (egyben terápiás állapotot) tartanak fenn, ezért elsősorban az ideg- és elmegyógyászati génterápia vonatkozásában érdemelnek figyelmet. Megoldandó azonban a biztonság kérdése, mivel a HSV-fertőzés patológiája kevéssé ismert. Génátvitel liposzómák közvetítésével A liposzómák mesterséges üregek, amelyek exogén anyagok szállítói, beleértve a transzgéneket is. Természetes celluláris megfelelőikhez hasonlóan, kis mennyiségű vizes oldatot körülvevő foszfolipidek és koleszterin alkotta kettős lipidrétegből állnak. A liposzómák különböző (100 nm-től több µm-ig) és szerkezetben tömör vagy lamellás hagymás rétegekkel előállított, részben már kereskedelmi forgalomban levő készítmények, töltésük pozitív vagy negatív. A génátvitel céljára készült liposzómákban a vizes DNS-oldatot körülvevő kettősrétegben a foszfolipid-molekulák hidrofil feje behatol az oldat vizébe, a

9 farokrészek egymással érintkezve folytonos víztaszító gátat képeznek. Az így felépített liposzóma, a megcélzott sejt membránjával reagálva, kedvező esetben lehetővé teszi a sejttel való fúziót, és a DNS közvetlen bejutását a sejtfolyadékba. A fúzió azonban ritka és lassú folyamat, ezért a génterápiás alkalmazást elősegítendő a legújabb kationos liposzómákba pozitív töltésű lipideket építenek be, amelyek közvetlenül kötődnek a sejthártyához. Ezek a már szintén kereskedelmi liposzóma-készítmények a génátvitelben kellően hatékonynak bizonyultak. A fúziók gyakoriságát meg lehet növelni azáltal is, hogy a liposzóma lipidrétegei közé vírus-glükoproteineket is helyeznek, amelyek erőteljes sejtfúziót váltanak ki. E célra parainfluenza-, korona- és retrovírusok glükoproteinjei egyaránt használhatók. A liposzómák a génterápiában a vírusvektorok fő versenytársai mint DNS-átvivők. Amennyiben csak biológiai lipideket tartalmaznak, toxicitásuk jelentéktelen, vizsgálati eredmények alapján a lipidanyagcserét sem befolyásolják és antigén-reakcióra sem kell számítani. Fúziót indukáló glükoproteint tartalmazó liposzómákat in vivo génátvitelre számos állatkísérletben kipróbáltak. A gén expressziójáról számoltak be a liposzómák injekció formájában való beadása után vese-, máj-, tüdőszövetbe, vázizomzatba és herébe. Bár az új liposzóma-konstrukciók elég jó hatásfokkal jutnak be a megcélzott sejt citoplazmájába, a szállított transzgén ritkán éri el a sejtmagot, és még ezen belül is kevés a gazdasejt kromoszómájába való beépülés. Ezért a transzgén expressziója csupán átmeneti: 10 naptól néhány hónapig, átlagosan kb. 20 napig tart. Ez gyógyászati használatban ismételt adagolást igényel, esetleg a beteg egész életén át, ami toxicitás és antigénhatás szempontjából nem aggályos, de injekcióról lévén szó, nem is ideális. Viszont az integrálódás elmaradása, amely az időleges expressziót okozza, a tekintetben előnyös, hogy nem sérül a beteg ivarsejtjeinek genetikai integritása. A liposzómás géntranszfer csírasejt-transzgenézisre és ES-sejtek átvitelére is alkalmazható, de a genomba való beépülés itt is ritka. Sikeresnek bizonyult viszont a közvetett út, vagyis liposzómák segítségével transzgén bevitele spermiumba. A külső DNS irányításának sajátos segítői a sejtmagban való lokalizálás fehérjéi, amelyeket szintén a liposzóma-komplexumba építenek be. Ezzel az eljárással megnövelhető mind a génexpresszió mértéke, mind a kromoszóma általi befogadás gyakorisága. Elektroporáció Elektroporációnak nevezik a sejthártya átmeneti destabilizálását nagy intenzitással pulzáló elektromos térben. A destabilizálódás időtartama alatt a

10 környező közegekben levő DNS-molekulák a sejt belső és külső membránjain áthatolva jutnak a citoplazmába és a nukleoplazmába. Az elektroporáció a külső DNS tenyésztett emlős sejtekbe való bevitelének gyors és olcsó módszere. Az integrált transzgének genomonkénti másolatainak száma 1 és 20 között szabályozható. Az átvihető transzgén nagysága elérheti a 150 kb-t. A transzfer a jövőben kiterjedhet mesterséges emlős kromoszómákra is. Az utóbbiak előnye, hogy nem hat rájuk a nukleáz enzim és a gazdasejttel egy ütemben replikálódnak, tehát tartós transzgén-expresszióról gondoskodnak. Az elektroporáció az emlős transzgenezis területén külső DNS őssejtekbe való bevitelének annyiban jelentős módszere, hogy a mikroinjekcióval szemben, sejtek tömeges kezelését teszi lehetővé. Erre viszont szükség is van, akkor, amikor egyetlen túlélő transzgénikus állatra 300 egérből vagy sertésből és 1000 szarvasmarhából vagy juhból van kilátás. Ez az átlagosan 0,01%-os hozam, tekintettel a nagy mennyiségű emlős pete viszonylag könnyű kinyerésére, mégis használatra érdemessé teszi az elektroporációt. A génterápia területén is van lehetőség az elektroporáció in vivo alkalmazására, azaz transzgének bejuttatására egy-egy szövetbe, esetleg daganatba. Eleve semmilyen szövet sem tekinthető elektroporációra alkalmatlannak, tehát nagy a gyógyászati kipróbálás terepe. Ex vivo kísérletként fejlesztés alatt áll gének célbajuttatása elektroporáció segítségével. Japán kutatók a módszert egy enzimgén hiányának pótlására próbálták ki vérképző sejtekben. Az eljárás szelekció alkalmazásában hasonlít az ES-sejtek és a sejtmagtranszfer ugyanilyen rendeltetésű használatához. Megfelelő őssejtek célzott bejuttatásával a beteg testébe, a repopuláció által különféle öröklött rendellenességek gyógyíthatók. Bombázás részecskékkel A génátvitelre alkalmazott és még csak kezdeti eredmények alapján javasolt technikák széles palettájának egyik érdekessége a részecskékkel való bombázás. A bombák 4 µm átmérőjű volfram- vagy aranyszemcsék rájuk adszorbeáltatott DNS-sel, amelyeket belelőnek a sejttömegbe. Ezután szolubilizálják a DNS-t, így bekövetkezhet annak expressziója. Ezt a biolisztikaként is emlegetett módszert először a növényi transzgenezisben alkalmazták, de bevált a transzgén in vivo bevitelére is emlős sejtbe. Az eddigi néhány kísérlet a biolisztikát nagyobb hatásfokúnak mutatja be a liposzómákat és retrovírusokat alkalmazó eljárásoknál, és ugyancsak a szomatikus génterápia számára ígéretes. A tömegtermeléses jelleg a megtermékenyített petesejtekre vonatkoztatva, az elektroporációval és a liposzóma alapú technikákkal helyezi egy szintre a részecskékkel való bombázást: a sejtek nehezen kezelhető sokaságára van szükség egy sikeres transzgénikus eseményhez.

11 Összegzés és kitekintés Az állati transzgenézisben és a humán génterápiában való előbbre jutásnak nélkülözhetetlen feltétele a megbízható génátvitel magasabb rendű állatok sejtjeibe. Sürgős szükség van tehát javításra a génátviteli technika területén, főként a génterápiás remények valóra váltásához. Kiemelt figyelmet kell szentelni a megcélzott sejt megválasztásának, a transzgének hatékonyabb befogadásának, a transzgén sejtmagban való lokalizálásának, transzgének megbízhatóbb beépülésének a genom kijelölt helyére. (Dr. Boros Tiborné) Smith, K. G.: Gene transfer in higher animals: theoretical considerations and key concepts. = Journal of Biotechnology, 99. k. 1. sz okt. 9. p Utomo, A. R. U.; Nikotin, A. Y.; Lee, W. H.: Temporal, spatial, and cell type-specific control of Cre-mediated DNA recombination in transgenic mice. = Nature Biotechnology, 17. k. 11. sz p