Molekuláris diagnosztika örökletes betegségekben. gekben. Tordai Attila OVSZ Molekuláris Diagnosztikai Labor

Átírás

1 Molekuláris diagnosztika örökletes betegségekben gekben Tordai Attila OVSZ Molekuláris Diagnosztikai Labor Bp., április 21. Labordiagnosztikai szinten tartó tanf.

2 Molekuláris Diagnosztika Az orvosi laboratóriumi riumi diagnosztika legfiatalabb ( ( 15 év), sokak szerint a legdinamikusabban fejlődő szakága, amelyen elsősorban sorban nukleinsav (DNS, RNS) alapú teszteket értenek. Tágabb T értelmezés s szerint ide tartoznak a proteomika és s a tömegspektrometria diagnosztikai alkalmazásai is. Lehetséges csoportosítás s alkalmazási terület szerint: - Egyén-azonos azonosítás, s, szöveti tipizálás s (igazságügy, gy, apaság, transzplantáci ció) - Nem saját t nukleinsav (mikrobiológia) - Szerzett nukleinsav-elt eltérések (onkológia) - Örökletes eltérések Határter rterület: citogenetika Alternatív v csoportosítás: egyedi/kis számú eltérések kimutatása - hagyományosabb nagy számú gén, SNP, mrns kimutatása array-k (térben rendezett makromolekula-sorozatok) / nagy kapacitású (high throughput,, HT) tesztek

3 Örökletes eltérések kimutatásának jelentősége Konkrét t betegellátás: A diagnózis pontos megállap llapítása sa (monogénesnes betegségek gek pl. Wilson kór, k izomdystrophiák) Kockázati/prognosztikai tényezt nyezők k azonosítása sa (multifaktoriálislis betegségek gek pl. mélyvm lyvénás s trombózis) Szelektív v populáci ciós érintettség/ g/predispozíció Megelőzés: Hordozó (carrier) és prenatális diagnosztika (súlyos, kevéss ssé kezelhető betegségek gek pl. haemophilia, cisztikus fibrózis zis, Duchenne-izomdystrophia izomdystrophia,, Huntington chorea) Klinikai kutatás: Betegpopuláci ció feltérk rképezése Struktúra ra-funkció megért rtése

4 Vérzékenység

5 Haemophilia A és B (HA és HB) VIII. (HA) ill. IX. (HB) alvadási faktor deficiencia (csökkent szint vagy csökkent aktivitás) X kromoszómához kötött k tt recesszív öröklésmenet (Xq( Xq) Spontán n vérzv rzések (izületek, izmok, koponyaűr) Gyakoriság: 1:5000 (HA) 1:30000 (HB) férfi. f

6 A vvérzékenység g ((haemophilia) ) klinikai jelei (a)vérzés a könyöktájon. (b)retina-vérzés. (c)ismételt ízületi vérzések: súlyos arthritis. Osztályozás (FVIII/FIX FIX aktivitás): súlyos (<1%) spontán vérzések, középsúlyos (1-5%) enyhe trauma után után elhúzódó vérzések. enyhe (6-30%) súlyos trauma, műtét után után elhúzódó vérzések.

7 X-kromoszómához kötött k tt recesszív öröklődés

8 A VIII. alvadási faktor gén g n szerkezete X kromoszóma VIII. faktor (FVIII) gén 26. exon 22. intron cdns: >7kb 186 kb Xq28 1. exon

9 Molekuláris genetikai diagnosztikai algoritmus haemophilia A-ban szenvedő betegek és s családok Súlyos haemophilia A Géninverzió vizsgálat Southern blot/hosszú PCR Informatív? NEM Középsúlyos haemophilia A (FVIII aktivitás: <1 %) (FVIII aktivitás: 1-5 %) IGEN IGEN BclI PCR-RFLP Informatív? NEM IVS 13 CA repeat Informatív? Carrier - és prenatális diagnosztika ajánlható IGEN IGEN NEM p39 CA repeat Informatív? NEM Egyéb kapcsolt marker elemzése

10 A fviii gén n kapcsolt markerei X kromoszóma q (hosszú kar) telomerikus régió 1.exon telomer centromer 26.exon 13. intron IVS 13 CA repeat 18. intron BclI hasítási hely p39 CA repeat

11 Családvizsgálat lat BclI marker segítségével (PCR- RFLP) II/1 I/1 I/2 II/2 II/3 144bp I/1 I/2 99bp II /1 II /2 II /3

12 Microsatellita-analízis analízis fluoreszcens jelöléssel Eljárás: Az p39 (CA)n repeat régiójának amplifikációja PCR-rel és fluorescens jelölésű primerekkel, majd méret szerinti elválasztás kapilláris elektroforézissel (ABI 310) I/1 p39 CA Repeat II/1 I/1 I/2 II/1

13 Szekvencia analízis (Sanger): FVIII gén g n (HA) 9. exon: 11. exon: beteg mutáns szekvencia egészséges személy normál szekvencia Kodon 415: TGG>TGC c.1300delg Kodon 552: CTC>CCC Leu552Pro

14 HA családvizsgálat lat A számozott családtagoktól áll rendelkezésre DNS ? 1 Indirekt módszer nem informatív Azonosított mutáció: 68. kodon: TGG>TAG Trp68Stop? Nonsense mutáció azonosítható heterozigóta formában a 2, 3, 4, 5 családtagok esetében. 5

15 Hemophilia genetikai diagnosztikai program HA Vizsgált hordozók száma (196 család): 284 Obligát: 122 Potenciális hordozó: 162 Diagnosztizált: Nem hordozó: HB Vizsgált hordozók száma (35 család): 51 Obligát: 19 Potenciális hordozó : 32 Diagnosztizált: Nem hordozó: Prenatális diagnosztika (HA és HB együtt): 40 fiú magzat: 27 (68%) egészs szséges, 13 (32%) érintett

16 Mélyvénás thrombosis (MVT)

17 A trombózis kialakulás s főf patomechanizmusa A véralvadv ralvadást előseg segítő, illetve gátlg tló folyamatok egyensúly lyának megbomlása általában a gátló rendszer csökkent működésem következtében.

18 A mélyvénás trombózis örökletes és ésszerzett tényezői Örökletes Gyakori: a FV gén G1691A (Leiden) mutációja a FII (protrombin) gén promoter szakasza G20210A mutációja a metiléntetrahidrofolát-reduktáz (MTHFR) gén C677T mutációja homozigóta formában Ritka: Igen ritka: antitrombin III deficiencia protein C deficiencia protein S deficiencia disfibrinogenémia, homozigóta homocisztinuria Valószínűleg örökletes: Szerzett: emelkedett FVIII, FIX, FXI ill. fibrinogén szintek műtét vagy sérülés hosszantartó mozgáshiány idősebb életkor malignus betegségek myeloproliferatív kórképek korábbi trombózis terhesség, fogamzásgátlók és hormonpótló kezelés antifoszfolipid antitestek jelenléte enyhe/súlyos hiperhomocisztinémia nem a FV mutációjával összefüggő protein C rezisztencia

19 Az örökletes trombophilia klinikai jellemzői Visszatérő illetve különleges k súlyosss lyosságú/atípusos lokalizáci ciójú mélyvénás s trombózis (MVT) Pozitív v családi anamnézis MVT-re 45 évnél l fiatalabb életkor az első jelentkezéskor Nem mutatható ki szerzett kockázati tényezt nyező Többszörös s vetélés és/vagy halvaszülés s az anamnézisben

20 Örökletes trombophilia-tényezők összesített előfordulási gyakorisága ga kontroll és betegcsoportokban Örökletes trombophilia-tényező Egészséges populáció Vizsgált egyének (fő) Érintettség (%) Vizsgált egyének (fő) MVT Érintettség (%) Trombophilia Vizsgált Érintettség egyének (fő) (%) Protein C deficiencia ,2-0, , ,8 Protein S deficiencia , ,3 I. típusú antitrombin III deficiencia , , ,3 FV Leiden mutáció , , FII G20210A mutáció , , MVT: mélyvénás trombózisos betegek Trombophilia: szelektált betegek, életkor 50 év alatt, családi halmozódás, korábbi trombózis Seligsohn 2001, NEJM 344:1222.

21 Néhány gyakori MVT kockázati ttényező relatív kockázati értéke FV Leiden FII G20210A Eltérés/kock s/kockázati tényezt nyező FV Leiden heteroz. + FII G20210A heteroz. Orális fogamzásgátló (OC) FV Leiden heterozigóta + OC G20210A heterozigóta + OC heterozigóta homozigóta heterozigóta homozigóta Relatív v kockk ockázat* 4,9 80 3,8 nincs adat 20 2,3 10,2 7,1 *Relatív kockázat (relative risk) MVT szempontjából

22 A trombophilia laboratóriumi riumi kivizsgálásának elemei három h fontossági csoportban Elsődleges csoport Vizsgálat APCrezisztencia FV Leiden FII G20210A Homocisztein szint VIII. f. szint Lupus antikoaguláns Genetikai háttér FV Leiden, HR exon, R506Q Promoter mutáció CBS, MTHFR mutáció nem ismert szerzett Seligsohn 2001, NEJM 344:1222. Másodlagos csoport Vizsgálat Protein C aktivitás Protein S szint és aktivitás Antitrombin III Antikardiolipin antitest Genetikai háttér 161 különb. mutáció 131 különb. mutáció 127 különb. mutáció szerzett Harmadlagos csoport Vizsgálat Dysfibrinogen aemia Fibrinogén szint IX. f. szint és aktivitás XI. f. szint és aktivitás MTHFR C677T Genetikai háttér 20 különb. mutáció nem ismert nem ismert nem ismert 4. exon, A226V

23 Örökletes vasfelhalmozódás

24 Mi a probléma? Túl l sok vas szívódik fel a szervezetbe. + A szervezet nem képes vasat leadni. A vasfelesleg által okozott közvetlen k szerv/szövetk vetkárosodás: s: májcirrhosis diabetes mellitus, hypophysis hipofunkció, cardiomyopathia, arthropathia, bronzszínű bőrpigmentáció Előfordul fordulási gyakoriság g (prevalencia( prevalencia): 30/10000 kaukázusi férfi, f 5/10000 nőn

25 A vasfelhalmozódás s progressziója öröklődő hemokromatózisban az életkor ffüggvényében Preszimptómás stádium Szimptomatikus stádium szérum ferritin (ng/ml) Megnövekedett vasraktárak Emelkedett májvas koncentráció Emelkedett transzferrin szaturáció Megnövekedett vasfelszívódás Cirrhosis és a szervek funkciózavarai Progresszív szövetkárosodás év (Powel et al.:gut nyomán)

26 Az öröklődő haemochromatosis klinikai képe Aspecifikus korai tünetek Hepatomegalia Ízületi fájdalom Fáradtság, gyengeség Késői specifikus tünetek Májcirrhosis Diabetes mellitus Bronzszínű bőrpigmentáció Átlagos túlélés (%) Átlag populáció HH betegek év a diagnózistól számítva

27 Örökletes vasfelhalmozódással ssal járó kórformák Robson et al. 2004; J.Med.Genet.

28 A haemochromatosis genetikai háttere 1. típus: HFE C282Y aut.rec Betegek % 2. típus: hepcidin/hemojuvelin aut.rec 3. típus: TFR2 aut.rec 4. típus: ferroportin 1 aut.dom Szórványos esetismertetések HFE fehérje szerkezete HFE C282Y allélfrekvencia Európában 9-11 % 6-9 % 3-6 % 1,5-3 % 0,5-1,5 % 0-0,5 % Feder JN et al.: Nat. Genet. 1996; 13:399 nincs adat

29 A HFE gén g eltérése DNS- és fehérje szinten

30 Kivizsgálási si algoritmus Algorithm for screening for HFEassociated haemochromatosis. (LFT - liver function test; TS - transferrin saturation.) Clin Biochem Rev February;31(1):3-8.

31 A HFE gén C282Y mutációjának kimutatása PCR-RFLP RFLP módszerrel 1. hasítatlan PCR termék 2. normál 3. heterozigóta 4. homozigóta restrikciós enzim: Rsa I

32 Mutáció (SNP) kimutatás s valós s idejű PCR-rel (alléldiszkrimináció) Homozigóta Normál Heterozigóta Negatív kontroll MÓDSZER ELVE: PCR + fluoriméter (pl. LC480), minták gyors hőátadású kapilláris-ban amplifikálódnak, szekvencia specifikus hibridizációs próbák alkalmazása, specifikus PCR termék keletkezése-kor FRET jelenség PCR után olvadáspont analízis ALLÉL-DISZKRIMINÁCIÓ

33