Az alvadási rendszer fehérjéi. Kappelmayer János DE OEC, KBMPI

Átírás

1 Az alvadási rendszer fehérjéi Kappelmayer János DE OEC, KBMPI Fehérje diagnosztika, Pécs, 2006

2 1. Az alvadási rendszer fehérjéinek áttekintése 2. Alvadási fehérje abnormalitások 3. Az alvadási rendszer fehérjéinek vizsgálata

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13 Az alvadási rendszer fehérjéivel kapcsolatos kórképek

14 Thrombocyta funkciós zavarok - thrombocyta túlmûködés - thrombocytopathia - glikoprotein hiány - denz-test hiány - alfa granulum hiány - jelátviteli zavar

15

16

17 A von Willebrand megbetegedés tipizálása Teszt I típus IIA típus IIB típus Thr-vWd III típus vwf:ag R:Co RIPA RIPA-LD Gyakoriság vwf multimerek: ± ± ± normál ± ± normál ø ø aggregál aggregál ø 70-80% 10-12% 3-5% 0-1% 1-3% ø ø ø ø Normál

18 Coagulopathiák 1./ Alvadási tényezôk, fibrinolízis inhibitorok hiánya vagy csökkent szintje 2./ Kóros alvadási faktorok, fibrinolízis inhibitorok szintézise 3./ Inhibitorok

19 Alvadási tényezôk, hiánya vagy csökkent szintje A/ Öröklött B/ Szerzett a. csökkent szintézis (májelégtelenség) b. consumptio C/ Terápiás (thrombolysis)

20

21

22 Öröklésmenet Prevalencia 1 millió lakosra Haemophilia A XR 100 Haemophilia B XR 20 vonwillebrand bet AD >100 AR 1 XI-es faktor hiány AR ritka

23 Abnormális alvadási faktorok szintézise A/ Congenitalis B/ Szerzett (dysfibrinogenaemia májbetegségekben, K vitamin hiány) C/ Terápiás (syncumar) D/ Iatrogén (cephalosporin)

24 Inhibitorok A/ Faktor ellenes neutralizáló vagy nem neutralizáló antitestek a. öröklött faktor hiánnyal b. öröklött faktor hiány nélkül B/ Globális inhibitorok (terápiás: heparin)

25 Az alvadási rendszer fehérjéinek vizsgálómódszerei

26 A véralvadás szûrôtesztjei Vérzési idô Aktivált parciális tromboplasztin idô (APTI): az intrinsic út vizsgálatára, FXII fibrin aktivátor, foszfolipid, kalcium Protrombin idô (PI): az extrinsic út vizsgálatára szöveti faktor fibrin szöveti faktor, kalcium Trombin idô (TI): fibrinogén-fibrin átalakulás, trombin fibrin

27 Platelet Function Analyser

28 GpIIb/IIIa complex Patient Control Cell count Negativ control M1 M2 M3 M4 Fluorescence intensity Cell count Control Control + TRAP Vitronectin receptor Patient Patient + TRAP a- KONTROLL (100/thr) b- KONTROLL TRAP (100/thr) c- BETEG (470/thr) d- BETEG TRAP (720/thr) Fluorescence intensity

29 Intrinsic út APTI XIIa XII PI Extrinsic út XIa Ca 2+ XI VII + TF, Ca 2+ VIIa Ca 2+ TF IXa Ca 2+ VIII PL IX Közös út X Xa Ca 2+ V PL Protrombin TI Trombin XIII Ca 2+ Fibrinogén Fibrin XIIIa Ca 2+ Fibrin (keresztkötött)

30 APTI normál megnyúlt nincs teendô citráthiba (1) igen az eredmény nem értékelhetô nem kumarin heparin PI meghatározás (2) TI meghatározás (3) nem APTI keverék korrigál (4a) nem korrigál (4b) Faktormeghatározá s FXII, XI, IX, VIII PK, HK lupus antikoaguláns faktor ellenes gátlótest

31 Coagulopathiák- Speciális vizsgálatok A: Alvadási tényezô t hiány nyának nak kimutatása sa: -Extrinsic-Intrinsic út faktorok aktivitásának meghatároz rozása - alvadási teszt (egyfázisú, kétfázisú) - kromogén n teszt -FXIII, Alfa-2 plazmin inhibitor B: Kóros alvadási faktorok kimutatása sa: -Extrinsic-Intrinsic út faktorainak antigén meghat. (immunológiai módszerrelm dszerrel:irma, ELISA) -Aktivitás s meghatároz rozása, Reptiláz z idô C: Gátlótestek testek meghatároz rozása

32 Gátlótestek testek alvadási faktorok ellen 1. Specifikus alvadási faktorok elleni Ig-k Gyenge- erôs típusú gátlótestektestek 2. Gyakorisága ga: : FVIII, FIX elleni gátlg tlótesttest a leggyakoribb (FXI, FXII, FV, FX, FXIII, fibrinogén elleni gátlg tlótest test igen ritka 3. Elôfordulás: Haemophilia, autoimmun betegségek gek, gyógyszerek gyszerek (INH, Streptomycin)

33 FVIII elleni gátlg tlótesttest FVIII:C ellen (vwf-ra nem hat) Kialakulása sa: Haemophiliás s betegek Post partum RA, SLE Malignitás Gyenge-erôs erôs típus Mennyiségét Bethesda-egys egységben gben fejezzük k ki.

34 Bethesda egység g meghatároz rozás 1. A betegplazmából l hígítások h készk szítése. 2. A betegplazma hígításainak h kontroll plazmával történô 1:1 arány nyú keverékeinek keinek készk szítése. 3. A kontroll plazma és s a keverékek kek 2 h-h 37 C inkubálása sa. 4. FVIII aktivitás s meghatároz rozása. 5. Reziduális FVIII aktivitás s megadása sa BE az aktivitása annak a gátlótest test mennyiségnek gnek, ami a keverék FVIII aktivitását 50%-ra csökkenti kkenti.

35

36 TI normál megnyúlt nincs teendô polibrénes TI(1) normál heparin megnyúlt TI keverék + RI (2) korrigál nem korrigál alacsony fibrinogén vagy dysfibrinogenemia fibrinogén/fibrin degradációs termék

37 Haemophilia A vonwillebrand betegség Thrombocyta szám N N Vérzési idô N FVIII N, vwf-ag N RIPA N,

38 Alvadási faktor meghatároz rozás egyfázis zisú alvadási teszttel Ismeretlen Faktor aktivitású minta Hiányplazma nyplazma: a vizsgált Faktort nem,, de minden Más faktort feleslegben tartalmaz PI: extrinsic út faktorai APTI: intrinsic út faktorai Alvadási idôt standard plazmával nyert kalibráci cióról l leolvasni

39 Faktor meghatároz rozás s kromogén n teszttel I. Direkt teszt (kallikrein, Xa, XIa, trombin) mérendô inaktív v faktor aktivált faktor R-pNA aktiválás R-COOH + pna aktivált faktor II. Indirekt teszt (XIIa kallikrein, IXa Xa VIIa Xa, VIIIa Xa) TF FVII FVIIa FVIIa+Ca FX FXa R-pNA FXa R-COOH + pna

40 Faktor meghatároz rozás s kromogén n teszttel Kromogén n szubsztrátok tok: olyan szintetikus rövid r peptidek (általában 3-4 tagú), melyeket az alvadási faktorok (proteolitikus enzimek) elhasítanak és ez a reakció színk nképzôdéshez vezet.. A peptidek specifikusak a vizsgálni kivánt alvadási faktorra,, a természetes szubsztrátot tot utánozz nozzák.. A színk nképzôdés s arányos az enzim aktivitásával val. Ile-Glu Glu-Gly-Arg-pNA FXa A FXa protrombin hasítási si helyét t utánozza nozza.

41 Faktor meghatároz rozás s kromogén n teszttel I. Direkt teszt: Faktor X meghatároz rozás kromogén n szubsztrát: Arg-Gly Gly-Arg-pNA reakció: FX RVV, Ca2 + FXa FXa Arg-Gly Gly-Arg-pNA+ + H 2 O Arg-Gly Gly-Arg-OH+ pna Fotometrálás 405 nm-en A FX aktivitás s leolvasása sa kalibráci ciós s görbe g alapján

42 Faktor meghatároz rozás s kromogén n teszttel II. Indirekt teszt: : FVIII meghatároz rozás kromogén n szubsztrát: Arg-Gly Gly-Arg-pNA reakció: FX Arg-Gly Gly-Arg-pNA+H 2 O FIXa,, Ca 2+, PL FVIII FXa FXa Arg-Gly Gly-Arg-OH+ OH+pNA Fotometrálás 405 nm-en A FVIII aktivitás s leolvasása sa kalibráci ciós s görbe g alapján

43 Kromogén n teszttel végzett v alvadási faktor meghatároz rozás Elônyei: 1. Nagyobb pontosság 2. Általában nem igényel hiányplazm nyplazmát, ilyenkor olcsóbb Hátránya: Hemolízis zis, lipémia zavar, ilyenkor minta vakot kell készk szíteni. A direkt teszt kóros k faktor jelenlétére nem elég érzékeny.