A VÉRALVADÁS VIZSGÁLATA

Átírás

1 A VÉRALVADÁS VIZSGÁLATA A Véralvadás vizsgálata című gyakorlat tartalmazza 1) a teljes vér megalvasztása rekalcifikálással, 2) a fehérjeméréshez szükséges referenciasor készítése, 3) a fibrinogén jelenlétének tesztelése és 4) a trombin-idő meghatározása és a XIII-as faktor hatásának tanulmányozása feladatokat. A gyakorlatok elméleti háttere Az emberi vért különböző vérsejtek (vörösvértestek, vérlemezkék és fehérvérsejtek), valamint a folyékony vérplazma alkotják. A vérsejtek a fehérjéket oldott állapotban tartalmazó plazmától centrifugálással különíthetőek el. Az alvadás a vérsejteket is tartalmazó alvadék kialakulásához vezet, az alvadéktól elkülönülő tiszta folyadék a sejtmentes szérum, mely nem tartalmaz véralvadási faktorokat, és az alvadékképzéshez szükséges fibrinogént sem. A levett vérminta kezelése a klinikai vizsgálatok céljától függ (pl. teljes vér, szérum, plazma vagy különböző vérsejtek vizsgálata). Az egyes vérvételi csövek különböző adalékokat tartalmaznak a minták stabilizálása céljából. A könnyebb azonosíthatóság érdekében a különböző módon kezelt csövek kupakjainak színezése a nemzetközileg ajánlott kódolás szerint történik. Szérum vizsgálata esetén a vért kezeletlen csőbe gyűjtik és a vért megalvasztják. A frissen levett vér alvadásának megakadályozására (pl. teljes vér, plazma vagy vérsejtek vizsgálata esetén) különböző alvadásgátlók alkalmazhatóak (pl. heparin, EDTA). Hagyományosan a véralvadási kaszkádot két útvonalra bontják: az intrinsic és az extrinsic útvonalra. A véralvadási kaszkád in vivo aktiválása kizárólag az extrinsic útvonalon történik, a FVIIa enzim szöveti faktorhoz történő hozzákapcsolódása indítja el. Ha a vért kémcsőbe gyűjtjük, a véralvadási kaszkádot az üveg negatív felületével való kölcsönhatás aktiválja. Az in vitro aktivált kontakt rendszer az FXI aktiválását váltja ki és beindítja a vér alvadását. Az extrinsic és az intrinsic tenáz komplexek is képesek aktiválni a FX-et. A keletkező FXa részt vesz a protrombináz komplex kialakításában és a trombin inaktív prekurzorát, a protrombint alakítja át aktív trombinná. A véralvadás során a trombin legfőbb feladata az oldékony fibrinogén fibrinné alakítása, az így kialakuló fibrin polimerek nélkülözhetetlenek az oldhatatlan fehérje hálózat kialakításához. A trombus stabilizálása a fibrin polimerek enzimatikus keresztkötésével valósul mely, melyet a FXIIIa katalizál. A FXIII-t (protranszglutamináz vagy Laki-Lórand faktor) a trombin alakítja át FXIIIa-vá, az enzim ezen aktív formája katalizálja a keresztkötések kialakulásáért felelős transzglutaminálási reakciókat. Az 1. ábra a véralvadási kaszkád áttekintését, a 2. ábra a XIII-as faktor által katalizált reakció vázlatát mutatja be. A véralvadás elméleti hátterének részletes bemutatását lásd a Hemosztázis előadások anyagában! Véralvadásgátlóként alkalmazhatóak olyan szerek, melyek megkötik a vérben található kalcium ionokat. Ilyenek például az oxalát, a citrát vagy az etiléndiamin-tetraacetát (EDTA). Vércukorvizsgálatokhoz oxalátot használnak, általában fluoriddal kombinálva. A fluorid enzim inhibitorként hatva megakadályozza, hogy a vérben kis mennyiségben jelenlévő glikolitikus enzimek (enoláz) lebontsák a glükózt.

2 1. ábra. A véralvadási kaszkád áttekintése. Az aktivált FXa protrombináz komplexet képez a FVa faktorral az aktivált trombociták negatív töltésű foszfolipid felszínén, melyhez Ca 2+ is szükséges. A protrombináz a protrombint alakítja aktív trombinná. A trombin az oldékony fibrinogén molekulákat proteolitikusan hasításja, mely fibrin molekulák polimerizálódva polimereket hoznak létre. A trombin a FXIII-as faktor átalakítását is elvégzi, az aktív FXIIIa faktor a fibrin polimerek keresztkötésével stabilizálja az alvadékot. 2. ábra. A XIII-as faktor által katalizált reakció vázlata. A FXIIIa izopeptid kötést hoz létre, kialakulása során az egyik fibrin molekula glutamin oldalláncának δ-amid csoportja a másik fibrin lánc lizin oldalláncának ε- amino csoportjával helyettesítődik, a reakcióban ammónia szabadul fel. A fibrin molekulák aggregációja hozza létre a lágy alvadékot. A kemény alvadékot a transzglutamináz által létrehozott kovalens keresztkötések stabilizálják. Az alvadási zavarok (koagulopátiák) kimutatására használt módszerek a következő csoportokba sorolhatók: - Globális tesztek (pl. Teljes vér megalvasztás rekalcifikálással). - Faktor tesztek (pl. Fibrinogén jelenlétének tesztelése). - Fázistesztek (pl. Trombin-idő meghatározása). 1) Teljes vér megalvasztása rekalcifikálással A teljes vér megalvasztás rekalcifikálással gyakorlati feladat során alkalmazott módszer az alvadási zavarok (koagulopátiák) kimutatására használt eljlárásoknak az ún. globális teszt csoportjába tartozik. A globális teszteket a teljes véralvadási kaszkád általános vizsgálatára használják, így alkalmasak lehetnek a hemosztatikus egyensúly patológiás eltolódásának, vérzékenység vagy trombotikus rendellenességek megállapítására.

3 2) Referenciasor készítése fehérjeméréshez Biokémia gyakorlat A gyakorlaton a fehérjék koncentrációjának mérése Biuret módszerrel történik. A peptidkötések nitrogénje és a rézion (Cu 2+ ) között kialakuló komplex (3. ábra) lila színű, a színes termék fotometriásan 540 nm-en mérhető. A keletkezett komplex mennyisége arányos a peptidkötések számával. A mintákban lévő fehérje mennyiségének meghatározását kalibrációs görbe alapján végezzük, melyet ismert mennyiségű fehérjét tartalmazó oldatok segítségével készítünk el. 3) Fibrinogén jelenlétének tesztelése 3. ábra. A Cu 2+ és a fehérje reakciója. A gyakorlaton végzett kísérlet során a szérum, plazma és fibrinogén mintákhoz CaCl 2 oldatot adunk, majd inkubáljuk a mintákat 37 C-on. Protrombin-időnek nevezzük a vizsgálati reakció kezdete (kalcium és tromboplasztin hozzáadása) után a fibrin megjelenéséhez szükséges időt. A hagyományos eljárás során a plazmában mozgatott üvegbot segítségével vizsgálják az első kihúzható fibrinszál megjelenéséig eltelő időt. A gyakorlaton végzett kísérletben várhatóan a kihúzható fibrinszál megjelenése helyett az oldat gélesedését tapasztaljuk, ugyanis a véralvadási kaszkád előrehaladott fázisa a pozitív visszacsatolási reakciók miatt gyors lefolyású. Nagyszámú minták vizsgálatát a gyakorlatban a laboratóriumok koagulométerek segítségével végzik, a plazma viszkozitásának vagy optikai tulajdonságainak mérésével. Az oldathoz adott ionok és az oldatban lévő fehérjék vetélkednek a szolvatációért, ezért nagy ionerősségnél a fehérjék oldhatósága csökken. Ez a folyamat a kisózás. A kisózáson alapul az egyik leggyakrabban alkalmazott fehérjetisztítási módszer. A gyakorlaton a plazmából Na 2 SO 4 -oldatot használva, kisózással távolítható el a fibrinogén. 4) Trombin-idő meghatározása és a XIII-as faktor hatásának tanulmányozása A fibrinmolekulák aggregációja csak egy úgynevezett lágy alvadék kialakulásához vezet. A fibrinmolekulák közötti kovalens keresztkötések kialakításáért a XIII-as faktor felelős. Az alvadékot a XIII-as faktor transzglutamináz aktivitása révén kialakuló keresztkötések stabilizálják, így létre a végleges kemény alvadék. A XIII-as faktor aktív centrumában szulfhidril (SH) csoportot tartalmazó, kalcium ion-függő enzim. Aktiválásához trombin is szükséges.

4 A trombin-idő (thrombin time, TT) mérése a koagulációs teszteket végző laboratóriumok alapvető vizsgálata. A TT meghatározására irányuló vizsgálattal a fibrinogén fibrin átalakulás rendellenességére következtethetünk. A trombin-idő meghatározása során a plazmához adott trombin hatására fibrinogén fibrin átalakulás megy végbe. A trombin-idő a fibrinogén fibrin átalakulás sebességére vonatkozó érték, a trombin hozzáadása és annak hatására a vizsgálandó plazmában keletkező fibrinalvadék megjelenése között eltelt idő másodpercekben kifejezve. A trombin-idő (TI) meghatározása koagulométerrel és manuális módszerrel egyaránt elvégezhető. A TI normál értékét legalább 5 egészséges egyén kevert (kontroll) plazmájából végzett mérésével adják meg. A diagnosztikai eljáráskor végzett meghatározásnál a módszertől függően a normál érték másodperc. A normál kontroll értéknél 4-5 másodperccel hosszabb TI már kórosnak tekinthető, alacsony plazma fibrinogénszint esetén a trombin-idő értéke megnő. A fibrinogén alvadásának idejét a hipofibrinogenémia, diszfibrinogenémia és a fibrinogén fibrin átalakulás gátlószerei (heparin, hirudin, fibrinogén degradációs termékek és paraproteinek) befolyásolják. Az urea-oldékonysági teszt során Ca 2+ vagy trombin hozzáadásával megalvasztott vérmintából származó alvadékot használnak. Az alvadékhoz koncentrált urea oldatot adnak és inkubálást követően megvizsgálják. Normális transzglutamináz aktivitás esetén a kovalens kötésekkel stabilizált alvadék urea jelenlétében is stabil marad ( kemény alvadék). A XIII-as faktor-hiányos állapot esetén keletkező alvadék azonban ureával beoldható ( lágy alvadék), mert az urea (kovalens keresztkötések hiányában) a fibrin-monomereket összetartó hidrogénhidakat megszünteti. A teszt alkalmas az örökletes vagy szerzett XIII-as faktor hiányos állapot kimutatására. Gyakorlat Az alkalmazott módszertől függően a trombin-idő normál értéke másodperc, a gyakorlaton azonban más koncentrációban használjuk a trombint, ezért ettől eltérő eredményt kaphatunk. A jódacetamid az SH-enzimek (így a XIII-as faktor) általánosan használható irreverzibilis gátlószere. Hozzáadásakor a 4. ábrán bemutatott folyamat játszódik le az enzim (E) aktív centrumában. 4. ábra. Transzglutamináz enzim (FXIII) inaktiválás jódacetamiddal.

5 Hivatkozások 1. Biokémiai gyakorlatok évi változatlan utánnyomás. Szerkesztette: Teichmann Farkas. Debreceni Egyetem, Orvos- és Egészségtudományi Centrum, Biokémiai és Molekuláris biológiai Intézet. Debreceni Egyetemi Kiadó, Klinikai kémia: A plazmatikus fázis (alvadási kaszkád) zavarai (koagulopátiák) és kimutatásuk. Szarka András, Keszler Gergely. Typotex Kiadó, (Tankönyvtár: URL: (Utolsó elérés dátuma: ) 3. Textbook of Biochemistry with clinical correlations. Ötödik kiadás. Szerkesztette: Thomas M. Devlin, Wiley-Liss, Biokémia II. kurzus Hemosztázis I-III. előadásanyagok (Dr. Tőzsér József). Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet, Általános Orvostudományi Kar, Debreceni Egyetem, Debrecen, 2015 Önellenőrző kérdések: Válaszolja meg az alábbi kérdéseket! 1. Hogyan történik a trombin-idő normál értékének meghatározása? Mekkora a normál érték? 2. Az urea-oldékonysági teszt alkalmas az örökletes vagy szerzett XIII-as faktor hiányos állapot kimutatására. Miért? 3. Mi a különbség a kísérlet várható eredményében, ha a Teljes vér megalvasztása rekalcifikálással gyakorlati feladatot üvegcsőben vagy műanyag csőben végzi? Miért? 4. A véralvadás gátolt az EDTA-t tartalmazó vérvételi csőben. Miért? 5. A globális tesztek alkalmasak a hemosztatikus egyensúly patológiás eltolódásának megállapítására. Hogyan állapítható meg vérzékenység vagy trombotikus rendellenesség a teljes vér megalvasztása által?