A PATHOGÉN AUTOANTITESTEK SZEREPE ÉS KIMUTATÁSA SZISZTÉMÁS LUPUS ERYTHEMATOSUSBAN

Átírás

1 A PATHOGÉN AUTOANTITESTEK SZEREPE ÉS KIMUTATÁSA SZISZTÉMÁS LUPUS ERYTHEMATOSUSBAN PH.D. ÉRTEKEZÉS SALLAI KRISZTINA KATALIN TÉMAVEZETŐ: PROF. GERGELY PÉTER SZIGORLATI BIZOTTSÁG TAGJAI: PROF. FEKETE BÉLA DR. PRECHL JÓZSEF DR. BARTHA KATALIN HIVATALOS BÍRÁLÓK: DR. KISS EMESE DR. KOLEV KRASZIMIR 2006 BUDAPEST SEMMELWEIS EGYETEM, DOKTORI ISKOLA MOLEKULÁRIS ORVOSTUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA

2 ÖSSZEFOGLALÓ A szisztémás lupus erythematosus (SLE) autoimmun betegség, fontos jellemzője - az egész szervezetre kiterjedő gyulladásos állapot mellett - számos patogén autoantitest termelődése. Kutatómunkám során kiemelkedő figyelmet fordítottam az autoantitestek kimutatásával összefüggő laboratóriumi vizsgálatokra, mivel ezen ellenanyagok megjelenésének és a kórfolyamatokban betöltött szerepének hátterében álló folyamatok még nem teljesen tisztázottak. Munkám részeként olyan teszteket is elemeztem és értékeltem, amelyektől várható volt, hogy eredményesen alkalmazhatóak lesznek az SLE rutin diagnosztikájában. Megvizsgáltam: 1) a DNáz enzim aktivitását SLE-s betegek plazmájában, ennek jelentőségét a betegség kialakulásában, és szervi manifesztációinak elsősorban a lupus nephritis megjelenésében 2) az összefüggést a betegek DNáz aktivitása és a szérum antinukleoszóma antitest szintje között 3) az antifoszfolipid antitestek megjelenését az SLE-s populációban és ezek összefüggését a tromboembóliás epizódok bekövetkeztével. 4) az SLE-s csoportban előforduló trombózisok gyakoriságát, és az ezek hátterében álló, az SLE-től független tromboembóliás kockázati tényezőket 5) annak lehetőségét, a sejtfelszíni Fc receptorok blokkolásával gátolhatóak-e az antitestek és immunkomplexeik által közvetített effektor funkciók az autoimmun betegségek, elsősorban az SLE kezelésében. Eredményeim szerint, bár az SLE-s betegek szérumában szignifikánsan csökkent a DNáz enzim aktivitása, ez nem áll összefüggésben a betegség aktivitásával, vagy a betegség során kialakuló vesekárosodással, viszont negatív korrelációt mutat a betegek antinukleoszóma antitest szintjével. A vizsgált SLE-s betegcsoportban mintegy tízszer gyakoribbnak találtam a trombózis incidenciáját az áltagnépességhez viszonyítva. Kimutattam, hogy SLE-ben az öröklött tényezők mérsékelt befolyása mellett - elsősorban a betegek több mint harmadának plazmájában kimutatható antifoszfolipid antitestek okozzák a kiemelkedő tromboembóliás rizikót. Az Fc receptorokra vonatkozó, szintetikus peptidekkel végzett vizsgálataink szerint peptidkonjugátumokkal kiválthatók monocita effektor funkciók, azonban konjugálatlan, szabad formában a peptidek nem gátolták sem az immunkomplexek FcR-okhoz való kötődését, sem a sejtek FcR közvetítette IL-6 termelését, viszont gátló hatással voltak a TNFα termelésre. 2

3 SUMMARY Systemic lupus erythematosus is an autoimmune disorder characterized by a systemic inflammatory state and the presence of a wide range of pathogenic autoantibodies. My research focused on the detection and characterization of these autoantibodies, since many details about their development and their pathogenic effects are still unclear. My work also included the evaluation of laboratory tests which might help the diagnosis, disease activity or prediction about the outcome of the SLE. The aims of my work were: 1) to measure serum DNase activity in the SLE population with the aim of evaluating the significance of DNase activity in the development of SLE, especially in lupus nephritis; 2) to study the association between the DNase activity and the production of antinucleosome antibodies; 3) to examine the presence of antiphospholipid antibodies in SLE, and their role in the development of thromboembolic episodes; 4) to examine the role of other, SLE independent thromboembolic risk factors, and evaluate the clinical value of thrombophilia screen in SLE; 5) to analyze the inhibitory effect of synthetic peptides from the Fc region of the antibodies on the Fcγ receptor mediated effector functions of human monocytes, and evaluate the possible use of these in the treatment of SLE. My results confirm that patients with SLE have reduced serum DNase activity, but the enzyme activity doesn t show association with disease activity or organ involvements such as lupus glomerulonephritis, but it negatively correlates with serum antinucleosome antibody concentration. According my results, the incidence of thromboembolism is about 10-fold higher in SLE that that of the normal population, and the antiphospholipid antibodies play the primary role in the development of thromboses in SLE. Other, inherited risk factors seem to be of lesser importance. The IgG Fc peptides, although in conjugates they could trigger macrophage effector functions via the FcRs, were unable to inhibit the binding of immuncomplex-bound antibodies to the receptors, nor could inhibit the IL-6 cytokine production induced by the antibodies. 3

4 TARTALOMJEGYZÉK RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK 6 BEVEZETÉS ÉS IRODALMI ÁTTEKINTÉS 8 AZ SLE KLINIKAI HÁTTERE 8 AZ SLE KIALAKULÁSÁNAK MOLEKULÁRIS HÁTTERE 11 AZ ANTI-DNS ÉS ANTINUKLEOSZÓMA ANTITESTEK JELENŐSÉGE 11 DNÁZ SZEREPE AZ ANTITESTEK KIALAKULÁSÁBAN 12 GENETIKAI HAJLAMOSÍTÓ TÉNYEZŐK 13 MBL ÉS POLIMORFIZMUSAI 14 FC RECEPTOROK 15 FOKOZOTT TROMBÓZISKÉSZSÉG SLE-BEN 16 AZ ALVADÁSI RENDSZER ÁTTEKINTÉSE 16 FŐBB TROMBOEMBÓLIÁS RIZIKÓFAKTOROK 18 Antitrombin deficiencia 19 A protein C protein S rendszer defektusai 19 APC rezisztencia és a Leiden-mutáció 20 A protrombin G20210A mutáció 20 Emelkedett VIII-as faktor szint 21 Emelkedett homocisztein szint 22 SZERZETT TROMBOFÍLIÁS TÉNYEZŐK, AVAGY A TROMBÓZIS KIALAKULÁSÁT SEGÍTŐ ÁLLAPOTOK 23 A gyulladás szerepe a trombózis kialakulásában 23 Az APA-k szerepe a trombózis kialakulásában 23 CÉLKITŰZÉSEK 26 MÓDSZEREK 27 A VIZSGÁLT BETEGCSOPORT 27 A MINTÁK ELŐKÉSZÍTÉSE A VIZSGÁLATOKHOZ 27 AZ ANTINUKLEOSZÓMA ÉS ANTI-DNS ANTITESTEK SZINTJÉNEK A MÉRÉSE 27 DNÁZ AKTIVITÁS MÉRÉS 28 AZ ANTIFOSZFOLIPID ANTITESTEK SZINTJÉNEK MÉRÉSE ELISA MÓDSZERREL 28 A FOSZFOLIPID-SPECIFIKUS LA MÉRÉSE KOAGULÁCIÓS MÓDSZERREL 29 A TERMÉSZETES ANTICOAGULÁNS FEHÉRJÉK SZINTJEINEK MÉRÉSE 29 AZ APCR MEGHATÁROZÁSA 30 A LEIDEN MUTÁCIÓ ÉS A PROTROMBIN MUTÁCIÓ DETEKTÁLÁSA 30 AZ V-ÖS FAKTOR VIZSGÁLATA DNS SZEKVENÁLÁSSAL 31 A VIII-AS FAKTOR SZINTJÉNEK MÉRÉSE 31 A VON WILLEBRAND FAKTOR SZINTJÉNEK A MÉRÉSE 32 HOMOCISZTEIN SZINT MÉRÉS 32 A SZINTETIKUS PEPTIDEK ÉS PEPTIDKONJUGÁTUMOK CITOKINTERMELÉSRE GYAKOROLT HATÁSÁNAK VIZSGÁLATA 32 FCR-OK ÉS A PEPTIDEK KÖZTI KÖTŐDÉS VIZSGÁLATA 33 STATISZTIKAI ANALÍZIS 34 4

5 EREDMÉNYEK 35 A NUKLEOSZÓMA ELLENI ANTITESTEK ÉS A DNÁZ AKTIVITÁS SLE-BEN 35 DNÁZ ENZIMAKTIVITÁS AZ SLE-S BETEGCSOPORTBAN 35 ANTINUKLEOSZÓMA ANTITESTEK (ANCSA) SLE-BEN 37 AZ ANTINUKLEOSZÓMA ANTITESTEK KAPCSOLATA AZ ANTI-DSDNS ANTITESTEKKEL ÉS A DNÁZ ENZIMAKTIVITÁSSAL 39 A DNÁZ AKTIVITÁS SZEREPE AZ SLE KÖVETÉSÉBEN 41 KÖVETÉSES VIZSGÁLATOK 42 A TROMBOEMBÓLIÁS ESEMÉNYEK BEKÖVETKEZTÉNEK ÉS A TROMBOEMBÓLIÁS RIZIKÓFAKTOROK JELENLÉTÉNEK A KAPCSOLATA SLE-S BETEGKNÉL 45 A TROMBÓZIS INCIDENCIÁJA SLE-BEN 45 AZ ANTIFOSZFOLIPID ANTITESTEK ELŐFORDULÁSA A VIZSGÁLT POPULÁCIÓBAN 46 AZ ANTIFOSZFOLIPID ANTITESTEK ÉS A TROMBÓZIS KOCKÁZATÁNAK ÖSSZEFÜGGÉSE 47 EGYÉB, ÖRÖKLÖTT TROMBOEMBÓLIÁS RIZIKÓFAKTOROK ELŐFORDULÁSA A VIZSGÁLT POPULÁCIÓBAN 50 FV Leiden és FII G20210A mutációk 50 Szerzett APCR vizsgálata 51 Természetes antikoaguláns fehérjék (AT, PC és PS) 53 FVIII és vwf szintek 53 Homocisztein szint 53 AZ ÖRÖKLÖTT RIZIKÓFAKTOROK JELENLÉTÉNEK KAPCSOLATA A TROMBOEMBÓLIÁS ESEMÉNYEK KIALAKULÁSÁVAL 54 FV Leiden és FII G20210A mutációk 54 Természetes anticoaguláns fehérjék 54 FVIII és vwf 54 Homocisztein szint 56 AZ APAK ÉS AZ ÖRÖKLÖTT TROMBOEMBÓLIÁS KOCKÁZATI TÉNYEZŐK EGYÜTTES HATÁSA 56 AZ FCR-OK GÁTLÁSÁNAK VIZSGÁLATA 58 A PEPTIDEK KÖTŐDÉSE AZ FC RECEPTOROKHOZ 59 IC-KÖTÉS GÁTLÁSA 59 PEPTIDKONJUGÁTUMOK CITOKINTERMELÉST INDUKÁLÓ HATÁSA 60 MONOMER PEPTIDEK GÁTLÓ HATÁSA 61 MEGBESZÉLÉS ÉS KÖVETKEZTETÉSEK 62 ÖSSZEFOGLALÁS 69 IRODALOMJEGYZÉK 71 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS 82 5

6 RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK ACR ADCC ANCSA APA APC apti (=aptt) AT ß2-GPI C4BP Cal CBA CBS CI DNáz DNS dntp ECLAM EKG ELISA Fc FcR FITC FPIA FII FX FXa GN HLA ICAM IgG American College of Reumatology antitest-függő sejtes citotoxicitás antinukleoszóma-antitest antifoszfolipid antitest aktivált protein C aktivált parciális tromboplasztin idő antitrombin ß-2-glikoprotein I C4 kötő fehérje cardiolipin kollagén kötő aktivitás cisztationin-ß-szintetáz konfidencia intervallum dezoxi-ribonukleáz dezoxi-ribonukleinsav dezoxi-nukleotid European Consensus Lupus Activity Measurement elektro-kardiogram enzimkötött immunszorbens technika fragment crystallizable Fc receptor fluoreszcein-izo-tiocianát fluoreszcens polarizációs immuntechnika II-es alvadási faktor (protrombin) X-es alvadási faktor aktivált FX glomerulonefritis humán leukocita antigén intercellular cell adhesion molecule immunglobulin G 6

7 IL IU LA MBL MHC MTHFR MTT NK OR PAI PC PCR PhL Ph-Ser PS PT RR rpm SAH SLAM SLE SLEDAI TF TFPI TNFα t-pa u-pa UCTD VCAM vwf interleukin nemzetközi egység lupus antikoaguláns mannóz-kötő lektin fő hisztokompatibilitási komplex metil-tetrahidrofolát-reduktáz 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazolium-bromid natural killer cell odds ratio plazminogén aktivátor inhibitor protein C polimeráz láncreakció foszfolipid foszfatidil-szerin protein S protrombin idő relative risk percenkénti fordulatszám S-adenozil-homocisztein Systemic Lupus Activity Measure szisztémás lupus erythematosus SLE disease activity index szöveti faktor TF pathway inhibitor tumor nekrózis faktor α szöveti-típusú plazminogén aktivátor urokináz-típusú plazminogén aktivátor nem differenciált kötőszöveti betegség vascular cell adhesion molecule von Willebrand faktor 7

8 BEVEZETÉS ÉS IRODALMI ÁTTEKINTÉS Az SLE klinikai háttere A szisztémás lupus erythematosus (SLE) autoimmun betegség. Az immunrendszer szabályozásában több ponton fellépő zavar miatt a szervezet egyes saját struktúrái elleni antitestképződés indul, amelyet szisztémás gyulladás kísér. Nevének eredete a betegség jellegzetes bőrtüneteire vezethető vissza. Lupus vulgarisnak nevezték korábban a tuberkulózis egyik változatát, mivel farkasmarásra emlékeztető nyomokat hagyott az arcon. Ettől különböztették meg 1851-ben az erythemákat kiváltó lupus erythematosust, amelynek szisztémás tüneteit később Kaposi Mór írta le. Az SLE prevalenciája Európában főre vetítve 40-70, éves incidenciája pedig 1-5/ fő [1-4]. Ezekből az adatokból is kitűnik, hogy a betegség mortalitása nem magas, a betegek 5 éves túlélése 90 % felett van. A betegségre jellemző, hogy a férfi-nő arány a megbetegedettek közt 1:8-10-hez, valamint, hogy a színesbőrű népesség körében magasabb az előfordulása [5, 6]. Szintén érdemes megemlíteni, hogy a betegség kezdete leggyakrabban a fiatal felnőttkorra tehető, ritkább a pubertáskor előtti és az 55 év felett jelentkező lupus. A betegség kialakulásához sok tényező együttes hatása vezethet. Azonosítottak olyan géneket (pl. HLA izotípusok, IgG-Fc- valamint komplementreceptorok), amelyek egyes genetikai prediszpozíció környezeti tényezők HLA izotípus komplement citokin és Fc receptor- MBLgének SLE hormonok fertőzések antibiotikumok gyógyszerek UV-sugárzás stressz 1. ábra: Az SLE kialakulásában szerepet játszó tényezők. A genetikai háttér mellett környezeti hatások is hozzájárulnak a betegség megjelenéséhez. 8

9 variánsai hajlamosítanak autoimmun betegségekre, vagy éppen az SLE-re. A genetikai prediszponáltság azonban önmagában nem elég. A környezeti tényezők közül az UVsugárzás, egyes gyógyszerek (pl. hidralazin, prokainamid, α-metil-dopa) [7, 8], és fertőzések (pl. Eppstein-Barr vírus) [9-13] is lehetnek a betegség közvetlen kiváltói. Hozzájárul a fentiekhez egyfajta hormonális hatás is: nem véletlen a betegek közti női dominancia, vagy az sem, hogy a lupuszosoknál gyakran tapasztalható állapotromlás a terhesség alatt, ösztrogéntartalmú gyógyszerek szedésekor, vagy éppen a premenstruális időszakban [14-18]. Sokszínűsége miatt az SLE diagnózisa a legtöbb esetben nem egyszerű. Az általános tünetek láz, fáradékonyság, nyirokcsomó-duzzanat, gyorsult süllyedés mellett gyakran jelentkezik leukopénia, artritis, bőrtünetek (1. táblázat). (A betegség egyik jelképe világszerte a pillangó, amely a betegek kis hányadának orrán és orcáján jelentkező, valóban pillangóra emlékeztető vöröses bőrjelenségre utal.) Kisebb 1. táblázat: Az SLE manifesztációinak gyakorisága a betegek körében. Szervi manifesztáció Érintettek aránya arthralgia vagy arthritis 95 % bőrérintettség 80 % hematológiai tünetek (anémia, leukopénia) % lázas állapotok % veseérintettség % idegrendszeri tünetek % fényérzékenység 30 % mellkasi fájdalom % hajhullás % szekunder antifoszfolipid szindróma 20 % százalékban már a diagnózis idejére kialakult a betegnél vesekárosodás, idegrendszeri tünet, trombózis. Néhány laboratóriumi paraméter megváltozása is alátámaszthatja a lupus diagnózisát. A gyakorlatban az American College of Rheumatology (ACR) által 9

10 kialakított kritériumrendszer 11 pontja közül legalább négy együttes teljesülése esetén mondható ki az SLE fennállása [19](2. táblázat). 2. táblázat: A szisztémás lupus erythematosus (SLE) diagnosztikai kritériumai [19]. A fenti 11 közül négy igazolódása esetén mondható ki a betegség diagnózisa. 1. Vespertilio (pillangó-erythema): lapos vagy kiemelkedő bőrpír az orron és az orcákon, ami nem terjed rá a nasolabiális redőre. 2. Discoid bőrjelenség: kiemelkedő erythemás foltok, tapadó keratotikus hámlással és follikuláris dugókkal, a régebbi léziókban atrófiás hegesedéssel 3. Fényérzékenység: a napfényre adott szokatlan bőrreació 4. Orális fekélyek: többnyire fájdalmatlan orális vagy nazofaringeális fekélyképződés 5. Arthritis: nem destruáló arthritis két vagy több perifériális izületben, fájdalom, duzzanat és izületi folyadék jelenléte jellemzi 6. Serositis: pleuritis és/vagy pericarditis dörzszörejjel, folyadékkal vagy EKG-val alátámasztva 7. Vesebetegség: napi 0,5 g-ot meghaladó állandó proteinuria és/vagy szemcsés cylinderek a vizeletben 8. Neurológiai tünetek: nem gyógyszer vagy anyagcserezavar indukálta görcsök és/vagy psychosis 9. Hematológiai tünetek (a következők bármelyike): hemolitikus anémia reticulocytosissal, leukopénia, limfopénia, vagy trombocitopénia 10. Immunológiai eltérések (bármelyik): kóros anti-dns antitest szint, anti-sm pozitivitás vagy cardiolipin pozitivitás 11. ANA pozitivitás A betegség aktivitása időben váltakozó. Hosszú tünetmentes periódusok után is újra jelentkezhet exacerbáció. A betegség aktivitásának megítélésekor a beteg klinikai állapota a döntő. Emellett laboratóriumi leletek is segítenek az immunrendszer aktiváltsági állapotának megítélésében. Mivel a betegség többféle formában jelentkezik, és lefolyása egyénenként változó, nincs olyan paraméter, amely minden beteg esetében egyértelműen segítené a betegségaktivitás megítélését. Éppen ezért dolgozták ki az SLE 10

11 aktivitását objektíven jellemezni célzó indexeket, amelyek közül mi az egyik legelterjedtebbet, a SLEDAI (Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity Index) pontrendszert [20] használtuk vizsgálataink során. Eszerint különböző pontértékeket számítunk az egyes tünetekre, majd ezek összessége adja meg a betegség aktivitásának mértékét. 8 pontot számítunk az alábbi tünetekre: akut görcsök, pszichózis, vasculitis, retinavasculitis okozta látászavar, agyidegtünetek, lupus fejfájás, cerebrovasculáris léziók, organic brain szindróma. 4 pontot számítunk a következőkre: arthritis legalább két izületben, myositis, haematuria, pyuria, napi 0,5 g-ot meghaladó proteinuria, szemcsés vagy vörös vértestes cylinduria. 2 pontot számítunk az alábbiakra: Pleuritis, pericarditis, nyálkahártyafekély, alopecia, friss exanthema, alacsony komplement szint, magas anti-dns szint. Végül 1 pontot jelentenek: láz, trombocitopenia, leukopenia. Mivel a kezelés elsősorban a beteg pillanatnyi állapotától függ, remisszióban teljesen elhagyható, míg az aktív lupus ellen esetenként csak igen agresszív terápiával lehet hatásos. Az exacerbációk közeledtének, valamint a későbbi szervi manifesztációk kialakulásának az előrejelzése fontos, megoldás előtt álló feladat a kutatók számára. Az SLE kialakulásának molekuláris háttere A betegség tüneteinek többségét a nagy mennyiségben képződő autoantitestek antigénekkel képzett komplexei okozta károsodások váltják ki. Az antitestek közül a kromatin elemeit, a kettősszálú DNS-t, a hisztonfehérjéket, vagy az ezekből kialakuló összetett struktúrákat, a nukleoszómákat felismerő antitestek kiemelkedő jelentősséggel bírnak a betegség kialakulását illetően [21-23]. Az anti-dns és antinukleoszóma antitestek jelenősége Az anti-dns antitestek jelenlétének vizsgálata a betegség diagnózisának felállításakor és a betegségaktivitás követésekor is elengedhetetlen [21, 24, 25]. Újabb tanulmányok 11

12 emellett felhívják a kutatók és klinikusok figyelmét az antinukleoszóma antitestek (ANCSA) diagnosztikai jelentőségére is [26-28]. Ezek az antitestek antigénjüket felismerve vele immunkomplexet képeznek, majd a veseglomerulusokban lerakódva a szervben szöveti károsodást okozhatnak [29, 30]. Az immunkomplexek által kiváltott glomerulonephritis (GN) az SLE-s betegek %-át érinti [31-33]. Leírták, hogy kísérleti állatokban a T-sejtes válasz gátlása nemcsak az anti-dns szintet csökkenti, hanem a lupus nephritis kialakulását is gátolja. Azt is kimutatták, hogy az SLE-ben megjelenő anti-dns antitestek többnyire nagy affinitású, IgG izotípusú ellenanyagok, amelyek termelődése T-sejt függő. Ezzel bizonyították, hogy az autoantitestek képzése antigén által indukált, T-sejt dependens úton indul [34-37]. DNáz szerepe az antitestek kialakulásában Az apoptotizált sejtek eltávolításának defektusa az elhalt sejtekből felszabaduló nagymennyiségű sejttörmelék, köztük kromatin komponensek keringésben való felgyülemlése révén előidézheti az autoantitestek termelését, és az SLE kialakulását [38, 39]. A hasnyálmirigy által termelt DNáz I, és a lép által termelt DNáz II enzimek elhasítják a nukleoszómák kettősszálú DNS láncait, ezzel elősegítik a keringő kromatinállomány lebontását, eltávolítását. A DNáz I egy 30,4 kda molekulatömegű glikoprotein, amely kation-kötő szekretoros endonukleázként hasítja a DNS-t, szekvencia-specifikusan [40]. A DNáz II szintén glikoprotein, molekulatömege 45kDa [41]. Savas ph-optimumának megfelelően a sejtmagon kívül a lizoszómákban és néhány szekrétumban jelenik meg. Régóta ismert az elgondolás, amely szerint a DNáz I enzim csökkent működése szerepet játszhat az SLE és az SLE-ben jelentkező lupus nephritis kialakulásában [42, 43]. Ezt a feltevést több kísérlet is alátámasztja. DNáz I deficiens egerek vizsgálata azt mutatta, hogy a kísérleti állatokban SLE-hez hasonló betegség alakult ki: antinukleáris antitest pozitivitással, magas anti-dns szinttel, illetve a veseglomerulusokban megfigyelhető immunkomplex-lerakódással [44]. Ezek a hatások eltérő mértékben, a DNáz I szinttől függően jelentkeztek az egereken. Egy másik kutatócsoport eredményei szerint, az SLE-s egereknek adott intravénás DNáz injekciót követően csökkent az állatokban az autoimmun válasz erőssége [45]. 12

13 Egy közel 40 éve tett megfigyelés szerint a borjú DNáz I enzimmel történő kezelés emberekben is visszaszorítja a DNS és rokon struktúrák antigén jellegét; valamint, hogy a kezelés hatására a betegek egy részének anti-dns szintje csökkent, illetve klinikai állapota javult [46]. A borjú DNáz immunogén hatása miatt rekombináns humán enzimmel folytatódtak a kísérletek. Azonban a bíztató egérkísérletek [45] ellenére sem sikerült a rekombináns humán DNázzal hatásosan visszaszorítani az autoimmun folyamatokat [47]. Japán kutatók két betegben is azonosították az A172G báziscserével járó mutációt a DNASE I gén 2. exonjában [48]. A betegek, akiknek genomjában ez a mutáció heterozigóta formában jelen volt, alacsony DNáz I enzimaktivitással és az SLE-s csoportban mértnél is szignifikánsan magasabb anti-dns szinttel rendelkeztek, de nem mutatták semmilyen, a mutációval összefüggésbe hozható egyedi manifesztációját a betegségnek. Genetikai hajlamosító tényezők A családfa és ikervizsgálatok, valamint a közelmúlt genetikai vizsgálatainak tapasztalata szerint az SLE kialakulásának hátterében nem állhat kizárólag egy gén, hanem több gén is rendelkezik olyan variánssal, amelyek együttállása a betegségre hajlamosító genotípust alakíthat ki [49-52]. Egyes becslések szerint legalább négy genetikai defektus, vagy hajlamosító allél szükséges ahhoz, hogy a betegség fenotípusosan is megjelenjen [53]. Igaz azonban az is, hogy egyes ritka mutációk (például a komplementrendszer korai elemeinek deficienciájához vezetők) homozigóta formában önmagukban is a lupuszhoz hasonló tünetegyüttes megjelenéséhez vezethetnek [54, 55]. Az SLE-re hajlamosító genetikai eltéréseket az érintett fehérjék funkciója szerint három fő csoportba oszthatjuk: Az első csoportban olyan genetikai polimorfizmusok vagy mutációk szerepelnek, amelyek hatásaként sérül a szervezet fiziológiás sejttörmelékeltávolító rendszere. Példaként említhetjük az MBL, a C1q és más komplementfehérjék, valamint egyes enzimek génjének defektusait. A második halmazba kerülnek azok a gének, amelyek eltérései - termékeik immunreguláló szerepénél fogva hozzájárulnak az immunológiai tolerancia áttöréséhez. Ilyen genetikai eltérések a Fas, Fas-ligand mutációi. A harmadik csoportban azokat a géneket találjuk, amelyek változatai a betegség lefolyására, szervi manifesztációira vannak hatással. 13

14 Többen is vizsgálták az SLE összefüggését az MHC géncsalád polimorf elemeivel [56, 57]. Az MHC II DR2 és DR3 allélek 2-5-szörös relatív kockázatot hordoznak az SLE kialakulására, ezen felül kimutattak bizonyos összefüggést a fenti allélek és egyes SLEre jellemző - ribonukleoproteinek és kromatinelemek ellen irányuló - autoantitestek megjelenése között is [58]. Az MHC III géncsalád egyes - a korai komplementfehérjéket kódoló - elemeinek deficienciája súlyos autoimmun folyamatok beindulását eredményezheti. Ennek az lehet az oka, hogy a komplementrendszer fontos szerepet tölt be az immunkomplexek eltávolításában, amely funkció kiesése esetén a felszaporodó komplexek gyulladásos, hiperszenzitivitási reakciókat okozhatnak. MBL és polimorfizmusai Az MBL (mannose binding lectin) molekula szerkezetileg a komplement rendszer C1q komponenséhez hasonlítható. A két fehérje funkciójában is találunk azonosságokat. Az MBL képes felismerni a különböző mikroorganizmusok baktériumok, gombák - felszínén található mannóztartalmú membránmotívumokat. A kórokozókhoz való kötődéssel aktiválják a komplementrendszer lektin-dependens útvonalát, ezzel elősegítik a patogén komplement általi lízisét vagy azt, hogy a makrofágok - opszonizált fagócitózis útján hatékonyan elpusztítsák a mannózmotívumokkal rendelkező kórokozót. Az MBL fehérje szintje egyénenként változó, alakulását nagyban befolyásolja az MBL gén 1-es exonjában található három ismert polimorfizmus valamelyikének jelenléte, vagy a gén promóter régiójában leírt három polimorfizmus megjelenése [59]. Ezek mindegyike a plazmában a vad genotípusú egyénekénél alacsonyabb MBL koncentrációt eredményez. Leírták, hogy az alacsonyabb MBL koncentráció hajlamosíthat az SLE-re [60]. Ennek hátterében több folyamat is állhat. Egyrészt, az MBL megfelelő mennyiségének hiányában lassabban megy végbe az apoptotikus sejttörmelék eltávolítása, a felhalmozódó sejtalkotók pedig az arra hajlamos egyének szervezetében antigénként beindítják a különféle autoantitestek képződését. Másrészt, csökkent MBL szint mellett a szervezet hajlamosabb a bakteriális és virális fertőzésekre, amelyek szintén az SLE-re prediszponált egyének esetében - közvetlen kiváltói lehetnek a betegségnek. Újabb tanulmányok vizsgálják a csökkent termelést 14

15 eredményező polimorfikus MBL allélek összefüggéseit az anti-c1q, illetve az antifoszfolipid antitestek termelődésével [61, 62]. Fc receptorok Az ellenanyag molekulák Fc alegységének megkötésére képes receptorok (FcR [63]) a legtöbb hemopoetikus eredetű sejten megtalálhatóak. Osztályozásuk Ig izotípuspreferenciájuk szerint történik; szerkezetük, és ezzel összefüggésben funkciójuk alapján pedig aktiváló vagy gátló Fc receptorokat különböztetünk meg [64, 65]. A legtöbb esetben a sejtek felszínén egyidejűleg gátló és aktiváló receptorok is megjelennek. Az IgG izotípusú ellenanyagokat felismerő FcγR-ok a nagy affinitású FcγRI kivételével gyengén kötik az IgG-t, ezért a szabad antitest nem, kizárólag az immunkomplexben szereplő, ezáltal megváltozott térszerkezetű ellenanyag molekulák kötődnek a receptorhoz, és váltanak ki végrehajtó funkciót. Az FcR-ok által közvetített effektor funkciók a receptortól, és az azt kifejező sejttípustól függően sokfélék lehetnek [65]. Aktiváló FcR-on keresztül kiváltható az NK sejtek antitest-függő citotoxikus reakciója (ADCC), serkenthető a makrofág sejtek fagocitáló képessége, és indukálható gyulladásoscitokin-termelésük. A gátló jellegű FcγRII fontos szerepet tölt be B-sejtek antigéntermelésének szabályozásában. Az FcγRIIa génjében leírt polimorfizmus a molekula 131-es pozíciójában egy aminosav cseréjéhez vezet. Ismert, hogy a kizárólag H131 FcγRIIa molekulákat hordozó sejtek sokkal hatékonyabban képesek az IgG2 megkötésére, míg az R131 FcγRIIa-val rendelkezők kevésbé. Hasonlóan, az FcγRIIIa gén polimorfizmusának köszönhető F158 FcγR-ok az IgG 1-es, 3-as, és 4-es alosztályába tartozó molekulákat kötik kisebb affinitással, mint a V158 FcγR-ok. Az MBL molekulához hasonlóan az FcγR-ok Ig-kötést befolyásoló polimorfizmusairól is leírták, hogy hozzájárulnak az autoimmun folyamatok kialakulásához [66-68]. Ezeknek a megfigyeléseknek a magyarázata az lehet, hogy a csökkent ellenanyag kötés az immunkomplexek eltávolításának defektusát okozhatja, ezzel hozzájárulhat hiperszenzitivitási reakciók kialakulásához. Az FcR-ok gyulladásos folyamatok közvetítésében betöltött szerepének tárgyalásakor ki kell hangsúlyoznunk az eltérő funkciójú receptorok egyensúlyának fontosságát. Az 15

16 aktiváló FcγRIII receptor bizonyítottan részt vesz az immunkomplex-mediált gyulladásos, szövetkárosító folyamatokban [69]. Az FcγRIIb, az egyetlen ismert gátló receptor viszont intracelluláris jelátviteli utakon képes gátolni az FcγRIII aktivációját [70]. Leírták, hogy míg az FcγRIIb konstitutív módon kifejeződik a veseglomerulusokban, az FcγRI és FcγRIII fiziológiás körülmények között nem. Vannak azonban olyan mediátorok (pl. IFNγ), amelyek hatására az aktiváló receptorok megjelennek a sejtfelszínen, a gátló FcγRIIb mennyisége viszont lecsökken. Ez a folyamat végül heves gyulladásos reakcióhoz, ezzel pedig vesekárosodáshoz vezet. Egy másik példa szerint azok a transzgenikus egerek, amelyek a humán FcγRIIa-t a humán sejtekre fiziológiásan jellemző mennyiságben kifejezték, trombocitaaktivációt előidéző ellenanyag beadására trombocitopéniával reagáltak, míg a vad típusú - FcγRIIa-t nem expresszáló - egerek csak kis mértékben, a jelátvitel gátoltsága miatt nem aktiválható FcγRI és FcγRIII receptorokkal sem rendelkező egerek pedig egyáltalán nem mutattak trombocitopéniára utaló tüneteket. Azok az FcγRIIa transzgenikus egerek pedig, amelyek működőképes FcγRI és FcγRIII fehérjékkel is rendelkeztek, trombocitaaktivációt követően néhány órával trombózis és sokkreakció következtében elpusztultak [71]. Fokozott trombóziskészség SLE-ben Az alvadási rendszer áttekintése A véralvadási és fibrinolitikus rendszerek helyes működése segít fenntartani a létfontosságú keringést ereinkben. Amennyiben a rendszer valamelyik eleme nem megfelelően működik, a fennálló kényes egyensúly eltolódik, felléphet egyrészt vérzékenység, amely vérveszteségen és szöveti károsodáson keresztül vezethet életveszélyes állapotokhoz, vagy felléphet fokozott alvadékonyság, amely az érpályák elzárása révén fontos területek, szervek funkciójának kiesését okozhatja. Az alvadás megindulása in vivo az intravasálisan fiziológiás körülmények között nem, vagy csak nyomokban jelenlévő szöveti faktor (TF) megjelenésével kezdődik. A TF transzmembrán glikoprotein, amely megtalálható a nagyobb ereket körülvevő adventitia réteg sejtjein, epitélsejteken illetve egy esetleges érsérülést követő károsodásnak fokozottan kitett helyeken (pl. agy, veseglomerulusok), de nyugalmi állapotban 16

17 hiányzik a plazmával érintkező endotélium és a vér alakos elemeinek felszínéről. Az érfal sérülése, vagy a monocita sejtek aktivációja következtében TF kerül kapcsolatba a plazmával, megköti és aktiválja az ott keringő VII-es alvadási faktort. A VII-es faktor aktivált enzimalakja (FVIIa) foszfolipid membránfelszín jelenlétében, a TF-hez kötötten képes hasítani, és ezzel aktiválni a IX-es és X-es alvadási faktorokat, azok pedig kis mennyiségben egymást. Az FXa foszfolipid felszín és Ca 2+ -ionok jelenléte mellett képes a protrombin (II-es faktor) kis mennyiségének aktiválására. Az így keletkezett trombin (FIIa) beindít egy másik utat: hasítással aktiválja a XI-es faktort, amely autokatalízise mellett a IX-es faktort aktiválja nagy mennyiségben. Emellett a trombin és az FXa is aktiválni képes a VIII-as faktort, amely így kofaktorként a FIXa-hoz kötődve, a foszfolipid felszínnel és a Ca 2+ -ionokkal kialakítja a X-es faktor aktiválásának leghatákonyabb komplexét, az angolból átvett szóval tenase -komplexet. Az így nagy mennyiségben keletkezett FXa, az előzőekhez hasonlóan foszfolipidekkel, Ca 2+ -ionokkal, és kofaktorával, az FVa-val a protrombint nagy mennyiségben trombinná hasító protrombináz komplexet képzi. Az eddigi folyamatok mind oda vezetnek, hogy a keletkező trombin a plazmában keringő fibrinogént (I-es faktort) hasítva, fibrin keletkezéséhez, annak H-hidakkal történő összekapcsolódásához, így egy laza fibrinháló kialakulásához vezet, amit végül az aktivált XIII-as faktor stabilizál. FVII FIX Ca 2+ + PhL FIXa -FVIIIa FII FI FIIa fibrin + FXIIIa TF-FVIIa FXIIa FXII FX FXa -FVa Ca 2+ + PhL FXIa FXI 2. ábra: A véralvadási rendszer főbb folyamatainak áttekintése 17

18 Az alvadási kaszkád beindulásával egyidőben megkezdődik az antikoaguláns hatású fehérjék aktiválódása is. A TFPI (tissue factor pathway inhibitor) FXa-val képzett komplexe a TF és FVIIa komplexéhez köt, és azok működését, a IX-es és X-es faktorok aktivációját gátolja. Az FXa-nak és a trombinnak több inhibitora is ismert, így az α 1 - antitripszin, az α 2 -makroglobulin, vagy a heparin-kofaktor II. A leghatékonyabb gátlást azonban az antitrombin (AT) fejti ki a statikus, vagyis a keletkező trombin mennyiségétől függetlenül jelenlévő inhibitorok közül. Az antitrombin, amely önmaga is szerin-proteáz, igen hatékony szerin-proteáz inhibitor ( serpin ); kofaktoraival, a heparán-szulfát-proteoglikánokkal illetve az antikoaguláns kezelés során is alkalmazott heparinszármazékokkal, a trombin, az FXa és az FIXa enzimek inaktiválásáért felelős. Mennyiségi vagy minőségi elégtelensége fokozott alvadékonysághoz vezet. Hasonlóan jelentős természetes antikoaguláns fehérje az aktivált protein C (APC) és kofaktora a protein S (PS). A protein C (PC) az endotél sejtek felszínén található EPCR-hez (endoteliális PC receptorhoz) kötődve kerül kapcsolatba az őt aktiváló, sejtfelszíni trombomodulinhoz kötődő trombinnal. Aktivációja után, kofaktorának a PS-nek segítségével a tenáz és protrombináz komplexekben szereplő FVIIIa-t és FVa-t hasítja, ezzel több nagyságrenddel csökkenti a trombinképződés sebességét. A PC, vagy a PS hiánya erősen hozzájárul a trombózis kialakulásához. Ezen felül, a fibrinképződés mellett azonnal megjelenik annak plazmin által történő bontása is. A plazmin a plazminogénből keletkezik a szöveti- valamint az urokináz típusú plazminogén aktivátorok (t-pa és u-pa) segítségével; feladata a fibrin hasításán felül az extracelluláris mátrix bontásáért felelős mátrix metalloproteázok (pl. kollegenáz, zselatináz) aktiválása is. A plazminogén, más néven fibrinolitikus rendszerben részletes ismertetése e dolgozatnak nem célja, illő azonban megjegyeznünk, hogy a működésében részt vesz több inhibitor is, amelyeknek defektusa különböző mértékű vérzékenységet okoz. Főbb tromboembóliás rizikófaktorok Az alvadási és fibrinolitikus rendszer komplex és igen jól szabályozott. Ennek következménye, hogy csak kivételesen ritka esetekben vezet egyetlen, a rendszert érintő defektus trombózis kialakulásához. Számos örökletes, és szerzett állapotot írtak le, 18

19 amelyekről bebizonyosodott, hogy kisebb-nagyobb mértékben hozzájárulnak a tromboembóliás események bekövetkeztéhez. Antitrombin deficiencia Az elsőként, az 1960-as évek közepén felismert örökletes trombózisra hajlamosító tényező az antitrombin (AT) deficienciája volt [72]. Az AT képzésének mennyiségi zavarai, vagy a funkciót érintő mutációk ma is a trombofíliás állapotok ismert kiváltói közül a legsúlyosabbak közé tartoznak. Ma úgy tudjuk, hogy az AT teljes hiánya, amely homozigóta AT mutációk következményeként állhat elő, a legtöbb esetben az élettel összeegyeztethetetlen, viszont leírtak már homozigóta mutációt az AT heparin-kötő helyén [73, 74], amely az AT funkciójának részleges elvesztésével jár. Heterozigóta formában számos AT mutáció ismert, ezek a lakosság 0,02-0,20 %-át érintik [75, 76], a trombofíliás eseteknek pedig mintegy 5 %-ában megtalálhatók [77, 78]. Az AT, amely maga is a szerin-proteáz emzimcsaládba tartozik, egyben szerin-proteáz inhibitor ( szerpin ) is, vagyis a szerin-proteáz aktivitású alvadási faktorokat, legelső sorban a trombint, az aktivált X-es és IX-es faktorokat hasítja. Ebben természetes kofaktorai a heparán-szulfát-proteoglikánok, illetve farmakológiai kofaktorai, a heparin és ennek származékai segítik. Mutációk ismertek az AT aktív centrumában, valamint a heparin-kötő helyen, ezek heterozigóta formában is fokozott trombóziskészséget okoznak [79, 80]. A protein C protein S rendszer defektusai Az 1980-as években írták le először egy másik természetes antikoaguláns fehérjének, a protein C-nek (PC) és kofaktorának, a protein S-nek (PS) az örökletes zavarát, mint trombózisra erősen hajlamosító tényezőket [81-84]. Azóta mindkét fehérjének több mint száz polimorf változatát megismertük [85-89]; ezek a teljes népesség mintegy 0,1-0,3 %-ában megtalálhatók [90, 91]. Súlyosabb esetekben, homozigóta vagy kettős heterozigóta formában a PC vagy a PS hiánya vagy funkcionális deficienciája már újszülöttkorban tromboembóliás események bekövetkeztéhez vezethet [92]. Az aktivált PC (APC) az aktivált V-ös és VIII-as faktorok inaktiválását végzi. Az FVa-t a 306-os, 506-os, és a 679-es pozícióban lévő argininek mellett hasítja el. Az R679 melletti hasítás nem járul hozzá az FVa funkcióvesztéséhez, az R506 melletti hasítás 19

20 részleges inaktivációt eredményez, míg az R306 melletti hasítás az FVa aktivitásának teljes elvesztéséhez vezet [93]. APC rezisztencia és a Leiden-mutáció Az 1990-es évek elején derült fény az aktivált V-ös faktor APC elleni rezisztenciájának hátterében álló eltérésre, vagyis az FV génben bekövetkezett G1691A báziscserének köszönhetően a fehérje 506-os pozíciójában a vad típusú arginin helyett egy glutamin megjelenésére [94]. Ezzel az eltéréssel - amelyet felfedezésének helyéről Leidenmutáció -nak neveznek - az FVa APC általi hasítása, vagyis inaktiválása jelentősen, ám nem teljes mértékben lecsökken, vagyis egy igen fontos reguláló lépés marad ki a folyamatból. Ez fokozott alvadékképződéshez, így visszatérő, elsősorban a mélyvénákat érintő trombózisok kialakulásához vezet [95-97]. A Leiden-mutációt hordozó allél a teljes európai népesség 3-7 %-ában [97-99], Magyarországon a lakosság 6-10 %-ában megtalálható [ ]; érdekesség, hogy az ázsiai népesség körében a Leiden-allél előfordulása rendkívül ritka [ ]. Az FVIIIa-t az APC az R336-os és R562-es pozíciókban hasítja. Érdekes megjegyezni, hogy a vad típusú FV jelenléte szignifikáns mértékben segíti az FVIIIa APC általi hasítását, azonban a Leiden-mutációt hordozó gén termékeként keletkező FV ezt a funkciót nem képes betölteni, vagyis egy második úton is elősegíti az alvadékképződést. APC rezisztenciát, és így fokozott alvadékonyságot okoz - az FV R506Q változatához hasonlóan - az FV Cambridge-mutáció [93], amely a 306-os pozícióban bekövetkező arginin treonin aminosavcserét eredményezi. Ez azonban, ellentétben a Leidenmutációval, igen ritka [106]. Ismertté vált, hogy az APC kofaktora, a PS elsősorban az FVa R306-os hasításához szükséges; konformációs változást eredményez az APC-n, így segíti annak aktív centrumát a szubsztráthoz közelebb kerülni. Emellett, a PS az FXa-hoz, az aktivált V-ös és a VIII-as faktorokhoz kötve gátolja a protrombin-trombin átalakulást, ezzel is kifejtve antikoaguláns hatását. A protrombin G20210A mutáció Az enzimatikusan aktív trombin mennyiségét szabályozzák fent említett inhibitorai, de azt, hogy alapvetően mennyi keletkezik, döntően befolyásolja a protrombin gén promóter régiója is. A promóter régióban található, 1996-ban leírt G20210A mutáció 20

21 hatására, a mutáns allélt heterozigóta formában hordozók plazmájában kb. 30%-kal magasabb lesz a protrombin szintje [107]. Ez több trombin keletkezését eredményezheti, és ezzel fokozott alvadékonysághoz vezethet. Ez a mutáció a magyarországi népesség 2,5-5 %-ában mutatható ki [100]; az eddig ismertetett defektusokénál mérsékeltebb heterozigóta formában mintegy 2-3 szoros - kockázatot hordoz [107, 108]. Önmagában jellemzően még homozigóta formában sem vezet trombózis kialakulásához, azonban megemeli mind a vénás, mind az artériás trombózisok bekövetkezésének valószínűségét. A protrombin gén más változatairól is leírták, hogy hozzájárulnak a protrombin szint megemeléséhez. Például, a 13-as intronban található A19911G polimorfizmus esetében megfigyelték, hogy a homozigóta G allélt hordozók plazmájában 7 %-kal magasabb a protrombin szintje, mint a homozigóta A alléllal rendelkezőkében [109]. Bár összefüggést találtak a trombózis megnövekedett kockázata és a GG genotípus között, ennek jelentősége elmarad a korábban említett kockázati tényezőkétől. Emelkedett VIII-as faktor szint Hasonlóan a protrombin, azaz a II-es faktor fokozott termelődéshez, más alvadási faktorok emelkedett szintjéről is megállapították, hogy hozzájárulnak a koagulációs rendszer egyensúlyának az alvadékonyság irányába történő eltolódásához. Leggyakrabban a VIII-as faktor szerepét említi az irodalom [108, 110, 111], de születtek eredmények, amelyek a IX-es, XI-es, valamint az I-es faktorok magas szintje és a trombózis mérsékelten (1,5-3-szorosan) emelkedett rizikója közötti kapcsolatot támasztják alá [108]. Vizsgálatok során kiderült, hogy az emelkedett FVIII szint határozottam, 3-5-szörösre megemeli elsősorban a vénás trombózis kialakulásának relatív kockázatát. Ismert, hogy a VIII-as faktor a plazmában a von Willebrand faktorhoz (vwf-hez) kötötten kering, valamint az is, hogy az AB0 vércsoportrendszer szerinti 0-ás vércsoportú személyek plazmájában mind a vwf, mind az FVIII szintje szignifikánsan alacsonyabb a többi vércsoportba tartozókénál. Mind a magas vwf szint, mind a nem 0-ás vércsoport trombózis kialakulásának relatív kockázatával tapasztalt összefüggése a magasabb FVIII szint hatásának tulajdonítható. Az emelkedett FVIII szint és a fokozott alvadékonyság közti kapcsolat hátterében több mechanizmus állhat: a nagyobb mennyiségű FVIII erősebb kofaktor aktivitásával fokozza az FIXa, ezzel a tenáz- 21

22 komplex X-es faktort aktiváló működését. Mivel az FVIII és az FV mindketten az APC szubsztrátjai, az FVIII szint emelkedése egyben az FV csökkent inaktivációját is eredményezi. Az alvadási rendszer kaszkádszerű felépítésének köszönhetően azonban a tenáz- és protrombináz-komplexek funkciójának lineáris emelkedése exponenciális fibrinképződést, illetve alvadékonyságot eredményez. Emelkedett homocisztein szint A homocisztein (Hcy) szint megemelkedése is állhat trombofíliás állapot hátterében [112, 113]. A magas Hcy koncentrációt kezdetben az arteriosclerosis és az artériás trombózisok kialakulásának megnövekedett kockázatával hozták összefüggésbe [114, 115], de mára egyre több adat támasztja alá szerepét a vénás trombózisok kialakulásában [116, 117]. A Hcy szint emelkedését okozhatja a Hcy-anyagcsere valamely enzimének öröklött defektusa. Erre ismert példa a metil-tetrahidrofolátreduktáz (MTHFR) génjének gyakori C677T polimorfizmusa [ ], amely az MTHFR enzim hőre labilis változatának expresszióját, ezzel homozigóta formában az enzimaktivitás 50 %-os csökkenését eredményezi. Az MTHFR feladata metionin előállítása a Hcy metilációjával (a reakcióhoz a metilcsoportot az enzim a metiltetrahidro-folsav, az MTHF demetilációjával nyeri), így az enzim csökkent működése Hcy szint enyhe emelkedésével jár. Egy másik enzim, a cisztationin-ß-szintáz (CBS), a cisztein Hcy-ből történő képzéséért felelős. Az enzim génjének számos mutációja ismert, amelyek homozigóta formában a CBS teljes hiányát okozhatják, de heterozigóta genotípus esetén is vezethet akár már fiatal korban artheriosclerosishoz és vénás trombózisok kialakulásához [ ]. A mutáció homozigóta formájának előfordulása azonban igen ritka (1: ). A Hcy-szint megemelkedését többnyire mégis a fent említett enzimek kofaktorainak, a B 6 és B 12 vitaminnak, valamint az MTHF szintéziséhez szükséges folsavnak a hiánya okozza. A hiperhomociszteinémiának a trombózis és a kardiovaszkuláris betegségek kialakulására gyakorolt hatása több folyamat révén érvényesül [113, 124]. Egyrészt, a Hcy autooxidációja során reaktív oxigéngyökök keletkeznek, amelyek az endotélt károsítják, egyben a keringő trombocitákat és monocitákat aktiválják. Másrészt, a Hcy gátolja egyes anticoaguláns fehérjék működését: blokkolja az AT kötését a membrán heparán-szulfát-proteoglikánokhoz; a trombomodulin redukálása révén gátolja a 22

23 trombin-trombomodulin kapcsolat kialakulását, ezzel a PC aktivációját; módosítja a t- PA-receptor t-pa kötőhelyét, így gátolva a fiblinolízist. Szerzett trombofíliás tényezők, avagy a trombózis kialakulását segítő állapotok A trombózis kockázatát emeli néhány állapot, például terhesség, poszt-menopauzális hormonpótló vagy orális fogamzásgátló kezelés, infekciók, malignus megbetegedések, sebészeti beavatkozások, obesitas, amelyeket szerzett rizikófaktoroknak nevezünk. Ezek közé tartozik a keringő antifoszfolipid antitestek megjelenése is, amely lehet spontán, de társulhat infekciókhoz, autoimmun betegségekhez is. Az SLE-re jellemző gyulladás és az antifoszfolipid antitestek protrombotikus hatásának vélt mechanizmusait érdemes röviden összefoglalni. A gyulladás szerepe a trombózis kialakulásában A gyulladás a véralvadás több fázisára is hat, a kezdeti lépésektől egészen a regulációig [125, 126]. A gyulladásos citokinek mint a TNFa, IL-1, IL-6 beindítják a szöveti faktor expresszióját és fokozzák a keringő, úgynevezett blood-born TF mennyiségét [ ]. Ezen kívül, a gyulladásos mediátorok a komplementrendszer aktivációján vagy fokozott apoptózis előidézésén keresztül hozzájárulnak negatív töltésű foszfolipidek felszínre kerüléséhez, ami kedvez az alvadási folyamatok beindulásának. A gyulladásos reakciók során gátlódik a természetes antikoaguláns fehérje, a PC aktivációja. A C4BP fehérje fokozott expressziója következtében pedig lecsökken a szabad, funkcionálisan aktív PS mennyisége, hiszen a PS többsége a plazmában a C4BP szabályozó komplementfehérjéhez kötve kering [131]. Az APA-k szerepe a trombózis kialakulásában A megfigyelés magyarázatául, miszerint az antifoszfolipid antitestek (APA-k) jelenléte in vivo hozzájárul a trombózisok kialakulásához, több elmélet is született az elmúlt években. Többségüket máig sem cáfolták meg, a legvalószínűbb tehát az, hogy az APAk kisebb-nagyobb mértékben számos úton hatnak a koagulációs rendszerre, mind az alvadást elősegítő, mind az azt gátló folyamatok révén, ám összességben az egyensúlyt az alvadékonyság irányába tolják el [ ]. Két fő csoportra oszthatjuk az APA-k koagulációt érintő hatásmechanizmusait: a molekuláris eseményekre ható és a sejtközvetített hatások csoportjaira. 23

24 A molekuláris szintű hatások megértéséhez fontos tudni, hogy nyugalmi állapotban a sejtmembrán kettősrétegének belső rétegében olyan negatív töltésű foszfolipidek (például foszfatidil-szerin) találhatók, amelyek a sejtek aktiválódásakor a külső felszínre kerülnek. Ezekhez Ca 2+ ionokon keresztül képesek hozzákapcsolódni a Gla-doménnel rendelkező alvadási faktorok (FVII, FIX, FX, FII) és antikoaguláns fehérjék (PC, PS); ez a kötés szükséges a felsorolt enzimek működéséhez. Így a véralvadási rendszer több folyamata - a TF-FVIIa komplex általi FIX és FX aktiváció, az FX tenáz-komplex általi aktivációja, a protrombináz-komplex által végrehajtott protrombin-trombin átalakítás, valamint a gátló folyamatok közül a PC aktivációja, majd az APC FVa-t és FVIIIa-t inaktiváló működése - során elengedhetetlen a foszfolipid felszín jelenléte. Azonban az antifoszfolipid antitestek is ezeket az anionos felszíneket és a hozzájuk kötődő fehérjéket ismerik fel, és támadják meg; ezzel pedig gátolják a foszfolipidfüggő reakcióutakat az alvadási rendszerben. Kimutatták, hogy a ß-2-glikoprotein I (ß2-GPI) membránfehérje, valamint a hozzá kötődő APA-k versengenek a szabad foszfolipid felszínért a fent felsorolt enzimkomplexekkel, ezzek gátolva működésüket [136, 137]. Azt is megfigyelték, hogy a tisztított ß2-GPI ezen a módon hatékonyabban gátolja a PC aktiválódását és működését, mint a trombin keletkezéséhez vezető folyamatokat, vagyis a rendszert az alvadékonyság irányába tolja el. Az utóbbi évek tanulmányai kiemelik az APA-k és az annexin V kompetíciójának szerepét a tromboembóliás események pathogenezisében [138]. Az annexin V fehérje molekulák amelyeket a placentából és a véredényekből is izoláltak - nagy affinitással kötnek az anionos foszfolipid felszínhez, azon összekapcsolódnak, és mintegy kétdimenziós kristályrácsot képezve pajzsként védik az alvadási komplexektől. Így meggátolják, hogy a különböző folyamatok révén kis mennyiségben felszínre kerülő anionos foszfolipidek közreműködésével beinduljon az alvadási kaszkád. Az APA-k foszfolipidekhez való kötődése megbontja az annexin V kristályrácsát, és lecsökkenti annak alvadásgátló hatását. APA-pozitív betegek placentájából származó sejteken, trophoblaszt-sejtkultúrákon és mesterséges foszfolipidfelszínen végzett kísérletek igazolják ezt a működést. Az annexin V-tel való kölcsönhatás megmagyarázza azt is, miért okoz trombózist az APA-k jelenléte in vivo, és miért gátolja az alvadást in vitro. In vitro ugyanis - az annexinek távollétében - az APA-k a szabad foszfolipidfelszínt 24

25 blokkolják az alvadási komplexek elől, viszont nem zavarják meg az annexin antikoaguláns hatását. A sejtközvetített folyamatok lényege, hogy a monociták és trombociták membránjához kötve az antifoszfolipid antitestek képesek beindítani vagy felerősíteni az intravaszkuláris sejtek aktivációjához vezető jelátviteli útvonalakat. Aktiválódásuk során a sejtek szöveti faktort (TF) expresszálnak [139]. A TF egy része az azt termelő sejtek membránján marad, egy másik hányad azonban kis membránpartikulumokkal, ún. micropartikulumokkal együtt lefűződik a trombocitáról vagy monocitáról, míg újabb vizsgálatok szerint kis mennyiségben szolubilis formában is található TF a plazmában. A TF jelenléte a plazmában keringő FVII aktiválásával beindítja az alvadási kaszkádot, a trombusképződéshez vezető folyamatokat. Több tanulmány eredményei is alátámasztják, hogy az antifoszfolipid antitestek jelenlétében emelkedik a TF expresszió [140, 141], illetve, hogy a magasabb plazma TF szint korrelál az APA-k jelenlétével, és a pozitív tromboembóliás kórtörténettel [142, 143]. A korábban trombózist már elszenvedett SLE-s betegek tisztított IgG antitest frakciója ezt a hatást erősebben mutatja, mint a trombózisos kórelőzmény nélküli SLE-s betegek antitestei. Az endotélsejtek APA-kal történő inkubációja során megfigyelték, hogy a sejtek aktiválódnak, fokozódik a membránjukon a trombociták és leukociták adhézióját segítő molekulák, például a szelektinek (P- és E-szelektin), ICAM-1 (intercellular cell adhesion molecule), VCAM-1 (vascular cell adhezion molecule) expresszója. A TF mellett emelkedik még a t-pa, vwf és a PAI-1 termelés és szekréció, valamint a proinflammatórikus citokonek, az IL-1 és IL-6 termelődése is [144]. A trombociták APA általi aktivációja közvetlenül beindítja azokat a jelátviteli folyamatokat, amelyek következményeként anionos foszfolipidek kerülnek a vérlemezkék membránjának felszínére, illetve megjelennek a trombocitaaggregációt közvetítő membránstruktúrák [132], amelyek közül a legfontosabb a GPIIb-IIIa membránkomplex. Az APA-k köthetnek a trombocitamembrán foszfolipidjeihez és az ahhoz asszociált fehérjékhez, elsősorban a ß2-GPI-hez az antigénfelismerő Fabfragmentumukkal, vagy az Fc fragmentumukkal a vérlemezkék membránján megtalálható FcγRII receptorhoz. Fontos megjegyezni, hogy így akár fiziológiás vagy éppen kóros körülmények közt már a trombociták kismértékű aktivációja is további aktivációhoz és aggregációhoz vezet. 25

26 CÉLKITŰZÉSEK Munkám célja az volt, hogy megvizsgáljam az autoantitestek és immunkomplexeik által okozott szervi károsodások és szisztémás jelenségek hátterét SLE-ben; valamint, hogy olyan laboratóriumi módszereket keressek, amelyekkel jól jelezhető vagy követhető a betegség alakulása. Közelebbi céljaim voltak: Megvizsgálni a DNáz enzim aktivitását SLE-s betegek plazmájában, felmérni a DNáz aktivitás jelentőségét a betegség kialakulásában, és szervi manifesztációinak elsősorban a lupus nephritis - megjelenésében. Kiértékelni, mennyire hasznosítható paraméter a DNáz enzimaktivitás a betegek laboratóriumi követése során. Megvizsgálni, milyen összefüggés van a betegek DNáz aktivitása és a szérum antinukleoszóma antitest szintje között, valamint meghatározni az antinukleoszóma antitest szint mérésének klinikai jelentőségét. Meghatározni az antifoszfolipid antitestek megjelenését az SLE-s populációban és megvizsgálni ezek összefüggését a tromboembóliás epizódok bekövetkeztével. Meghatározni az SLE-s csoportban előforduló trombózisok gyakoriságát, és kimutatni az ezek hátterében álló, az SLE-től független, többnyire öröklődő tromboembóliás kockázati tényezőket, illetve megvizsgálni a trombofília-szűrés indokoltságát SLE-ben. Megvizsgálni annak a lehetőségét, hogy szintetikus peptidkonjugátumokkal előidézhető-e az immunkomplexek hatása, illetve a receptorok blokkolásával gátolhatóak-e az antitestek és immunkomplexeik által közvetített effektor funkciók az autoimmun betegségek, elsősorban az SLE kezelésében. 26