ÖSSZEFOGLALÁS BEVEZETÉS

Átírás

1 3. ÉVFOLYAM, 3. SZÁM 7. JÚNIUS JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY EREDETI KÖZLEMÉNY National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project (NSABP) Operations and Biostatistical Centers; Mayo Clinic, Jacksonville, FL; Genetics Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, Bethesda, MD; Allegheny General Hospital, Pittsburgh, PA; Network for Medical Communication and Research, North Potomac, MD. Elhunyt. Közlésre benyújtva: 6. április 18-án; elfogadva: 6. szeptember 11-én; az internetes változat a nyomtatott verziót megelôzôen, 7. január 16-án jelent meg a honlapon. A közlemény megjelenéséhez a National Cancer Institute, Department of Health and Human Services (Bethesda, MD) Public Health Service U1CA-127, P-U1CA-37377, U1CA és U1CA számú ösztöndíja nyújtott anyagi támogatást. A közleményben ismertetett adatok kivonat formájában bemutatásra kerültek a 2nd Annual Gastrointestinal Cancers Symposiumon (5. január Miami, FL). Nyilatkozat: Az esetleges anyagi támogatással kapcsolatos szerzôi nyilatkozat a közlemény végén található. Levelezési cím: George P. Kim, MD, Mayo Clinic Jacksonville, Davis Bldg 8-E, 45 San Pablo Rd, Jacksonville, FL 32224; kim.george@mayo.edu. 7 American Society of Clinical Oncology X/7/ /$. DOI: 1.1/JCO A nagyfokú mikroszatellita-instabilitás prognosztikai és prediktív szerepe vastagbélrákban: A National Cancer Institute és a National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project közös vizsgálata George P. Kim, Linda H. Colangelo, H. Samuel Wieand, Soonmyung Paik, Ilan R. Kirsch, Norman Wolmark és Carmen J. Allegra ÖSSZEFOGLALÁS Célkitûzés Ma sem tisztázott, hogy a nagyfokú mikroszatellita-instabilitás (MSI-H, high-degree microsatellite instability) milyen szerepet játszik markerként az adjuváns kemoterápia hatásának elôrejelzésében. Betegek és módszerek A hatás felméréséhez a National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project (NSABP) résztvevôinek adatait elemeztük, akiket véletlenszerûen két csoportba soroltak be: az egyik csoport betegei csak mûtéti kezelésben részesültek (nem kezelt kohorsz), a másik csoportban adjuváns fluorouracil- (FU) kezelést is alkalmaztunk (kezelt kohorsz). Az MSI-H mellett egyéb potenciális markereket (TGF-βRII, p53, timidilát-szintáz és Ki67) is megvizsgáltunk. Eredmények Az 542 beteg közül összesen 98-nál (18,1%) észleltünk MSI-H-t. Az MSI-H és a mutáns p53- státus között szoros fordított összefüggés mutatkozott (p <,1). A prognosztikai elemzések alapján az MSI-H betegek recidívamentes túlélése (RFS, recurrence-free survival) hoszszabbnak bizonyult, mint az MSS/MSI-L betegeké (p =,1), azonban a teljes túlélés (OS, overall survival) vonatkozásában nem volt különbség (p =,67). Az MSI-H és a mutáns p53 között potenciális kölcsönhatást jeleztek az adatok az RFS javulásával összefüggésben (p =,3). A prediktív markerek elemzése során nem tapasztaltunk kölcsönhatást sem az MSI-státus és a kezelés között, sem pedig az RFS (p =,68) vagy az OS (p =,62) tekintetében. Az MSI-H- és az MSS/MSI-L-betegeket összehasonlítva, az RFS kockázati aránya (HR, hazard ratio) a nem kezelt betegcsoportban,77-nak (95% CI,, 1,48), a kezelt csoportban pedig,-nak adódott (95% CI,,3 1,19). A teljes túlélés kockázati hányadosa,82 (95% CI,,44 1,51), illetve 1,2 (95% CI,,56 1,85) volt. Az MSI-H-t és mutáns p53-t hordozó betegek körében az RFS általában kedvezôbbnek mutatkozott. Következtetések Eredményeink nem támogatják az MSI-H prediktív markerként történô használatát a kemoterápia hatásának elôrejelzésében. J Clin Oncol 25: American Society of Clinical Oncology BEVEZETÉS Az Egyesült Államokban a vastagbél- és végbélrák a második helyet foglalja el a daganatos halálokok sorában; 6-ban új esetre derült fény, és a betegség hozzávetôleg áldozatot követelt. 1 A mûtétet követô fluoropirimidin alapú adjuváns kemoterápia meghosszabbítja a túlélést nagy kockázatú, II. stádiumú, valamint a nyirokcsomóáttétekkel kísért, III. stádiumú kórfolyamatban. Az oxaliplatin 127

2 Kim és mtsai bevezetése elôtt a fluorouracil (FU) + leucovorin kombinációt tekintették standard kezelésnek a Mayo Clinic (Rochester, MN) vagy a Roswell Park (Buffalo, NY) protokollja szerint. 2,3 Köztudott, hogy az adjuváns kemoterápia nem minden esetben javítja a kiújuló daganat miatt kezelt betegek túlélését. Az FU-kezelés klinikai kimenetelét potenciálisan elôre jelzô molekuláris markerekkel remélhetôleg pontosabban azonosíthatók az adjuváns kemoterápia megfelelô jelöltjei. A genominstabilitás egyik formája a mikroszatellita-instabilitás (MSI, microsatellite instability), amelynek jellemzôje, hogy a nukleotidhibák felismerése és kijavítása (DNS-MMR, mismatch repair) hibásan mûködik. 4,5 Az MSI kapcsolatba hozható a teljes túlélés (OS, overall survival) javulásával, és a sporadikus vastagbélrák és a herediter non-polyposis colorectalis rák egyes eseteiben is kimutatható Az MSI hátterében fontos komponensek (általában az MLH1 és az MSH2 protein) hiánya áll. 15,16 E fehérjék egymással együttmûködve javítják ki a DNS-szálak közötti nukleotidhibákat, valamint a komplementer nukleotidok hibás párosodása miatt kialakuló DNS-hurkokat. A DNS-spirál torzulásainak felismerése a kemoterápiás szerek hatására képzôdô DNS-adduktumok felismerését is szolgálja. A DNS-károsodás érzékelésének híján az apoptózis megindításához szükséges jelzések is elmaradnak, 17,18 és rezisztencia alakul ki bizonyos kemoterápiás szerekkel szemben Lényeges eredmény, hogy a hibás MMR-t hordozó sejtekben FU-rezisztenciát igazoltak. 22,23 Annak ellenére, hogy a nem örökletes rákban szenvedô, MSI-t hordozó betegek hosszabb túlélésre számíthatnak, a klinikailag fontos szerekkel szembeni relatív rezisztencia befolyásolhatja az MSI-státus alapján várható terápiás választ. A lehetséges FU-rezisztenciával kapcsolatos preklinikai megfigyelések felvetik azt a dilemmát, hogy az FU alapú adjuváns kezelés hasznos vagy káros-e az MSI-t hordozó 1. táblázat. Az MSI elemzésébe bevont NSABP-vizsgálatok Vizsgálat Jellemzôk C , Dukes B vagy C stádiumú vastagbélrákban szenvedô beteg, akik 1977 és 1983 között véletlenszerû besorolás alapján posztoperatív immunterápiát (BCG) vagy szisztémás kemoterápiát (MOF) vagy csak mûtéti kezelést kaptak, valamint 156, Dukes B vagy C stádiumú vastagbélrákban szenvedô beteg, akiket 1983-ban és 1984-ben csak mûtéttel kezeltek C , Dukes B vagy C stádiumú vastagbélrákban szenvedô beteg, akik 1984 és 1988 között véletlenszerû besorolás alapján posztoperatív vena portae FU-infúziót vagy csak mûtéti kezelést kaptak C-3 Adjuváns kemoterápiás protokollok (FU + leucovorin, illetve MOF) összehasonlítása 181, Dukes B vagy C stádiumú vastagbélrákban szenvedô beteg kezelése kapcsán, akik 1987 és 1989 között véletlenszerû besorolás alapján adjuváns kemoterápiát kaptak C-4 Az FU+leucovorin, az FU+levamisol, illetve az FU+leucovorin+ levamisol kombinációk hatásosságának összehasonlítása 2151, Dukes B vagy C stádiumú vastagbélrákban szenvedô beteg kezelése kapcsán, akik 1989 és 199 között véletlenszerû besorolás alapján kemoterápiát kaptak Rövidítések: BCG, Bacillus Calmette-Guérin; MOF, semustin/vincristin/fluorouracil; FU, fluorouracil. betegek számára. Két munkacsoport az FU-kezelés vonatkozásában értékelte az MSI prediktív szerepét, és egymásnak ellentmondó eredményekrôl számoltak be Ahhoz, hogy az MSI mint valódi prediktív marker potenciális értéke tisztázódjon, közvetlenül össze kellene vetni a csak mûtéttel kezelt MSI-betegeket és a posztoperatív fluoropirimidin alapú kemoterápiával kezelt betegeket, bár egy ilyen elemzés bizonytalan. Célkitûzésünk az MSI mint prognosztikai faktor szerepének vizsgálata, valamint az MSI lehetséges prediktív szerepének meghatározása volt a kemoterápiás hatás elôrejelzésében. A National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project (NSABP) négy adjuváns kemoterápiás vizsgálatából származó, archivált szövetmintákon elemeztük az MSI-státust A kizárólag mûtéttel kezelt betegek bevonásával lefolytatott elsô két tanulmány (NSABP C-1 és C-2) az egyik utolsó lehetôséget képviseli a mikroszatellita-instabilitást hordozó daganatok természetes viselkedésének megfigyelésére. Az archivált szövetminták másik része az NSABP C-3 és C-4 vizsgálatokból származott, ahol a betegek adjuváns FU- és leucovorin-kezelést is kaptak. A National Cancer Institute (NCI; Bethesda, MD) és az NSABP közös vizsgálatának célja a klinikai kimenetel összehasonlítása volt a csak mûtéttel, illetve a mûtét mellett kemoterápiával kezelt MSI-betegek körében. BETEGEK ÉS MÓDSZEREK A betegek kiválasztása A betegek négy véletlen besorolásos, a vastagbélrák terápiájával kapcsolatos NSABP-tanulmányból származtak (1. táblázat). A formalinnal fixált, paraffinba ágyazott szövetblokkokat véletlenszerûen kiválogattuk, és az NSABP szövettárolójában feldolgoztuk. Mindegyik mintából több különálló 7 mikronos metszetet készítettünk, amelyeket tárgylemezre helyeztünk. Mindegyik tárgylemezt a klinikai adatbázishoz kapcsolódó, egyedi azonosítószámmal láttunk el, az MSI-t vizsgáló szakemberek azonban nem ismerték a klinikai adatokat. A statisztikai elemzést külön munkacsoport végezte (H.S.W., L.H.C.). A vizsgálatot az Allegheny General Hospital (Pittsburg, PA) felügyelô bizottsága hagyta jóvá a 45CFR (d) jelzés alatt. Az Allegheny General Hospital e bizottsága felügyeli az NSABP szövetbankját. MSI-módszerek Elsô lépésben egy patológus (S.P.) vizsgálta meg a hematoxilin-eozinnal festett tárgylemezeket, hogy ellenôrizze a diagnózist, meghatározza a daganat százalékos arányát, illetve elkülönítse a tumoros és az egészséges szövetet. A minták legalább 5%-át kellett kitennie a daganatnak. A DNS kivonására festetlen tárgylemezt, a DNS tisztítására kereskedelmi forgalomban kapható készletet (QIAamp DNA Mini Kit, 128 JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY

3 A nagyfokú mikroszatellita-instabilitás prognosztikai és prediktív szerepe vastagbélrákban Qiagen Inc, Valencia, CA) használtunk. Ezután polimeráz láncreakcióval (PCR) amplifikáltuk a Bethesda-irányelveknek megfelelô panel öt lókuszát (Bat25, Bat26, Mfd15, D2S123 és D5S346) és a TGFβRII lókuszt. A Cawkwell és munkatársai által leírt eljárással fluoreszcens primereket szintetizáltunk. 9 A National Cancer Institute által jóváhagyott referenciapanel szolgált standardként az MSI-betegek azonosítására, mely alapján nagyfokú mikroszatellita-instabilitásként (MSI-H) értékeltük, ha a vizsgált markerek legalább 3%-ában instabilitás volt észlelhetô. A tumorban, illetve az egészséges szövetben a szekvenciákon belüli ismétlôdô nukleotidegységek addícióját vagy delécióját automata kapilláris-elektroforézis eszköz (ABI 31 Genetic Analyzer; Applied BioSystems, Foster City, CA) segítségével vizsgáltuk. A teljes kohorsz 542 betege közül 98-nál találtunk nagyfokú mikroszatellita-instabilitást (MSI-H). A Bethesda-irányelveknek megfelelô panel markerei közül a Bat25 és a Bat26 marker önmagában 82,6%-ban, illetve 78,3%-ban azonosította az MSI-H-betegeket a C-1/C-2 kohorszban. A C- 3/C-4 csoportban a Bat25 és a Bat26 marker alapján 93,4%-ban, illetve 96,7%-ban voltak azonosíthatók az MSI- H-betegek. Ez utóbbi kezelt csoportban az egyik vagy mindkét marker az esetek 95,3%-ában azonosította az MSI-Hbetegeket. Immunhisztokémiai módszerek A szövetmintákat elôször 1%-os xilénben deparaffináltuk, majd hígított alkoholos oldatokban rehidráltuk. Ezt követôen gátoltuk az endogén peroxidázaktivitást. A timidilát-szintáz (TS, thymidilate synthase), p53 és Ki67 vizsgálatát az Allegra és munkatársai által leírt módszerek szerint végeztük. 31 Statisztikai elemzés Az elemzés során a recidívamentes túlélést (RFS) és a teljes túlélést (OS) választottuk a klinikai kimenetel változóinak. Az RFS esetében az esemény definíciója az elsô tumorrecidíva volt. Az OS esetében a bármilyen okból bekövetkezô halált tekintettük kimenetelnek. A követési idôt a mûtét napjától számítottuk, és a követést öt év után minden betegnél cenzoráltuk. A markerpontszámokat a következô módon osztályoztuk az elemzés elôtt: a p53 esetében pozitív (mutáns), illetve negatív (vad típus); az MSI esetében MSI-H, illetve mikroszatellita-stabilitás (MSS)/MSI-L; a Ki-67 esetében 41 1%, illetve %; a TS-intenzitás esetében határozott, fényes és/vagy nagy intenzitású festôdés (3), illetve gyengébb vagy világosközepes intenzitású festôdés ( 3). A markerpárok közötti kapcsolatot a χ 2 -próbával elemeztük. Az MSI és egyéb változók, például más markerek vagy a betegek jellemzôi közötti összefüggéseket logisztikus regresszióval vizsgáltuk. Minden beteg esetében (C-1 C-4 tanulmányok) és minden kezelt csoport esetében (C-1/C-2, illetve C-3/C- 4) megvizsgáltuk az egyes markerek és a kimenetel közötti Recidívamentes túlélés (%) 1 8 MSS/MSI-L 444 beteg, 131 recidíva MSI-H 98 beteg, recidíva 1. ábra. Az összes beteg recidívamentes túlélése. MSS/MSI-L, mikroszatellitastabilitás vagy kisfokú mikroszatellita-instabilitás; MSI-H, nagyfokú mikroszatellita-instabilitás. kapcsolatot. Az OS és az RFS marker kategóriák közötti összehasonlítására, valamint a kockázati hányadosok kiszámítására a Cox-féle arányos kockázati modellt használtuk (stádiumok szerinti csoportosításban). A kombinált kezelésben részesülô csoportok elemzésében a modelleket a kezelés és a stádium szerint osztályoztuk. A megadott p-értékek kétoldalúak. A kimenetel elôrejelzése céljából az MSI és más kovariánsok kapcsolatát valószínûségi hányados teszttel vizsgáltuk. EREDMÉNYEK Betegek jellemzôi A vizsgálat Dukes B és C stádiumú betegek adatait (és utánkövetését) foglalja magába, akiket a C-1 és C-2 tanulmányban, véletlenszerû besorolás alapján csak mûtéttel kezeltek (nem kezelt csoport), valamint a C-3 és C-4 vizsgálatban fluorouracil és leucovorin kombinációjával kezeltek (FU + LV; kezelt csoport). A nem kezelt betegek %-ánál (C-1: 131/526; C-2: 42/344), a kezelt betegek 31%-ánál (C- 3: 159/518; C-4: 21/691) álltak rendelkezésre elemzésre alkalmas paraffinblokkok. A vizsgálatba bevont és az abból kizárt betegek jellemzôi nem sokban tértek el egymástól. Fontos, hogy a két kohorsz a betegek életkorát és nemét, valamint a betegség stádiumát és a tumor helyét tekintve hasonló volt (nem közölt adatok). A vizsgálatba besorolt és kihagyott betegek közötti hasonlóságokat tovább elemezve, logaritmikus rangsorpróbával összehasonlítottuk a vizsgálatba bevont 542 beteg, illetve a teljes C-1 C-4 kohorsz elemzésbôl kihagyott 1537 betegének ötéves RFS (,71, illetve,68) és OS értékét (,72, illetve,68). A p-érték,52, illetve,49 volt, ami arra utal, hogy az elemzésbe bevont betegek megfelelôen reprezentálják a négy randomizált protokoll összes betegét

4 Kim és mtsai 1 1 Túlélés (%) 8 MSS/MSI-L 444 beteg, 124 halálozás MSI-H 98 beteg, 26 halálozás Recidívamentes túlélés (%) 8 MSS/MSI-L 136 beteg, 49 recidíva MSI-H 37 beteg, 11 recidíva 2. ábra. Az összes beteg teljes túlélése. MSS/MSI-L, mikroszatellita-stabilitás vagy kisfokú mikroszatellita-instabilitás; MSI-H, nagyfokú mikroszatellita-instabilitás. 3. ábra. A csak mûtéttel kezelt betegek recidívamentes túlélése. MSS/MSI-L, mikroszatellita-stabilitás vagy kisfokú mikroszatellita-instabilitás; MSI-H, nagyfokú mikroszatellita-instabilitás. MSI elemzése A nem kezelt csoportban a 173 tumormintából 37-ben ( 21,4%) mutatkozott MSI-H. A kemoterápiával kezelt kohorsz 369 betege közül 61-nél (16,5%) igazolódott MSI- H-pozitív tumor. A teljes (kezelt és nem kezelt) kohorsz elemzése arra utalt, hogy az MSI-H-betegek esetében az RFS hosszabb, mint az MSS/MSI-L-betegek körében (p =,1; 1. ábra). Az MSI-Hbetegek esetében a relapszus becsült relatív kockázata (RR, relative risk) az MSS/MSI-L-betegekhez képest,68-nak adódott (95% CI,,42 1,9). Az MSI és az OS kapcsolata alig bizonyított (p =,67), mivel az MSI-H-betegek esetében a halálozás relatív kockázata,91 volt (95% CI,,59 1,4; 2. ábra), az MSS/MSI-L-betegekhez képest. Amikor a Cox-féle arányos kockázati modellben (2. táblázat) a kezelési és MSI-státushoz interaktív tagot illesztettünk, az MSI-státus és a kezelés között nem találtunk kapcsolatot sem az RFS (p =,68) sem az OS (p =,62) tekintetében. Az MSI-H-betegek recidívamentes túlélésének kockázati aránya (HR, hazard ratio) az MSS/MSI-L-betegekhez képest a nem kezelt C-1/C-2 csoportban,77-nak (95% CI,, 1,48; 2. táblázat. A kovariánsként a kezelést, az MSI-státust és az interakciót alkalmazó Cox-modell eredményei Kovariáns b Relatív kockázat 95% CI p-érték Recidívamentes túlélés Kemoterápia v csak mûtét,64,53,37,76,6 MSI-H v MSS/MSI-L,3,74,38 1,43,37 Interakció,,82,31 2,12,68 Túlélés Kemoterápia v csak mûtét,78,46,32,66 <,1 MSI-H v MSS/MSI-L,,82,44 1,5,51 Interakció,22 1,24,53 2,91,62 Rövidítések: MSI-H, nagyfokú mikroszatellita-instabilitás; MSS, mikroszatellita-stabilitás; MSI-L, kisfokú mikroszatellita-instabilitás. 3. ábra), a kezelt C-3/C-4 kohorszban,-nak adódott (95% CI,,3 1,19; 4. ábra). Az MSI-H-betegek teljes túlélése vonatkozásában a HR az MSS/MSI-L betegekhez képest,82 volt (95% CI,,44 1,51; 5. ábra) a C-1/C-2 betegcsoportban, illetve 1,2 (95% CI,,56 1,85; 6. ábra) a C- 3/C-4 betegcsoportban. Az MSI és a betegjellemzôk kapcsolata Az MSI és a betegek jellemzôi, azaz a Dukes-stádium, a tumor helye, az életkor és a nem közötti összefüggések logisztikus regressziója alapján,1-nél kisebb globális p- értéket kaptunk. Az adatok arra utaltak, hogy a tumor helye és az MSI szorosan összefügg egymással. Az MSI-negatív betegek 37%-ánál, az MSI-pozitív betegek 61%-ánál lokali- Recidívamentes túlélés (%) 1 8 MSS/MSI-L 38 beteg, 82 recidíva MSI-H 61 beteg, 9 recidíva 4. ábra. A fluorouracil + leucovorin kombinációval kezelt betegek recidívamentes túlélése. MSS/MSI-L, mikroszatellita-stabilitás vagy kisfokú mikroszatellitainstabilitás; MSI-H, nagyfokú mikroszatellita-instabilitás. 13 JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY

5 A nagyfokú mikroszatellita-instabilitás prognosztikai és prediktív szerepe vastagbélrákban 3. táblázat. A betegek jellemzôinek és a molekuláris markereknek összehasonlítása az MSI-H és az MSS/MSI-L csoportok között MSI-H (%) MSS/MSI-L (%) p-érték MSI és a betegek jellemzôi Dukes B 49, 41,,15 Dukes C 51, 59, Vastagbél jobb oldalán 61,2 36,7 <,1 elhelyezkedô daganat Egyéb lokalizációjú daganat 38,8 63,3 Életkor < év 54,1 43,9,7 Életkor év 45,9 56,1 Férfi 54,1 53,8,96 Nô 45,9 46,2 MSI és molekuláris markerek p53-negatív 68,4 39,9 <,1 p53-pozitív 31,6,1 Ki67 % 35,7 47,5,3 Ki % 64,3 52,5 TS-intenzitás 2 63,5,8,62 TS-intenzitás 3 36,5 39,2 Rövidítések: MSI, mikroszatellita-instabilitás; MSI-H, nagyfokú MSI, MSS, mikroszatellita-stabilitás; MSI-L, kisfokú MSS; TS, timidilát-szintáz. zálódott a daganat a vastagbél jobb felére (p <,1). Más statisztikailag szignifikáns kapcsolatot nem észleltünk (3. táblázat). A Cox-féle modell nem jelzett statisztikailag szignifikáns kapcsolatot az MSI és a betegek jellemzôi (életkor, nem, betegség stádiuma, tumor helye) között, ami a kimenetel elôrejelzését segítené (recidíva esetében p =,43, az OS vonatkozásában p =,92). TGFβRII-mutáció MSI-H-betegek esetében A 98 MSI-H-beteg közül 54-nél (55,1%) találtunk mutációt a TGFβRII génben (a csak mûtéttel kezelt 37 beteg közül -nál, a 61 FU/LV-beteg közül 34-nél). A TGFβRIImutációt hordozó betegek esetében a relatív kockázat a RFS tekintetében 1,12-nak (95% CI,,46 2,76), a teljes túlélés vonatkozásában 1,26-nak (95% CI,,57 2,8) bizonyult azokhoz a betegekhez képest, akiknél nem állt fenn TGFβRII-mutáció. A csak mûtéttel kezelt betegek körében az RFS relatív kockázata 1,85 (95% CI,,53 6,47) míg az összegzett túlélésé 2,35 volt (95% CI,,71 7,81). Az FU/LVkezelésben részesült betegek között a fenti értékek rendre,62-nak (95% CI,,16 2,35), illetve,7-nak (95% CI,,23 2,14) adódtak. Túlélés (%) 1 8 MSS/MSI-L 136 beteg, 52 halálozás 37 MSI-H beteg, 13 halálozás 5. ábra. A csak mûtéttel kezelt betegek teljes túlélése. MSS/MSI-L, mikroszatellita-stabilitás vagy kisfokú mikroszatellita-instabilitás; MSI-H, nagyfokú mikroszatellita-instabilitás. Az MSI és egyéb markerek kapcsolata Az MSI és másik három marker (Ki67, p53 és TS-intenzitás) összefüggésének logisztikus regresszióvizsgálata során,1 alatti globális p-értéket kaptunk. Más szerzôk 11,12 szoros fordított korrelációt figyeltek meg az MSI-H és a mutáns p53-státus között (pozitív immunhisztokémiai [IHC] lelet DO-7 antitesttel; Vector Laboratories, Burlingame, CA; p <,1). Az MSI-negatív kohorszban a betegek,1%-ánál észlelték mutáns p53 expresszióját, míg az MSI-H-csoportban ennek aránya 31,6% volt. Adataink az MSI-H és a Ki67 pozitív kapcsolatára utaltak (IHC Mib-1 antitesttel; Immunotech, Wildwood, MO; p =,3), de az MSI és a TS-festôdés intenzitása között nem mutatkozott kapcsolat (IHC TS 16 antitesttel; Allegra és munkatársai 31 ). Az MSI és a többi marker (TS, Ki-67 és p53) összefüggéseit vizsgáló, hasonló globális elemzések nem találtak statisztikailag szignifikáns összefüggéseket (recidíva szempontjából p =,24, túlélés vonatkozásában p =,82). Az adatok egyedül az MSI és a p53 lehetséges kapcsolatára utaltak, ha a recidívamentes idôszakot tekintettük kimenetelnek. Amikor az adatokat nem korrigáltuk többszörös összehasonlításra, a p- érték,3 volt. Amennyiben figyelembe vesszük a három marker és a két kimenetel hatféle kapcsolatát, akkor p =,17. Az MSS/MSI-L-betegek esetében a mutáns p53-pozitív (festôdô) tumorok HR-értéke 1,99 volt a mutáns p53-negatív Túlélés (%) 1 8 MSS/MSI-L 38 beteg, 72 halálozás MSI-H 61 beteg, 13 halálozás 6. ábra. A fluorouracil + leucovorin kombinációval kezelt betegek teljes túlélése. MSS/MSI-L, mikroszatellita-stabilitás vagy kisfokú mikroszatellita-instabilitás; MSI-H, nagyfokú mikroszatellita-instabilitás

6 Kim és mtsai tumorokhoz képest. Másrészt az MSI-H-betegek körében a p53-pozitív szövetek becsült HR-értéke,41 volt a p53-negatív betegekhez képest. Mindazonáltal csak 31 p53- és MSIpozitív beteg volt, és közülük 5-nél alakult ki recidíva. Az MSI és a p53 kapcsolata ha az OS a végpont nem érte el a statisztikai szignifikancia határát (p =,24). MEGBESZÉLÉS A közös (NCI NSABP) vizsgálatban az MSI prognosztikai és prediktív szerepét elemeztük az NSABP C-1 C-4 vizsgálatainak colorectalis rákban szenvedô résztvevôinek adatai alapján. Az eredmények arra utalnak, hogy az MSI-H-betegek recidívamentes túlélése hosszabb volt a teljes C-1 C-4 kohorszban, a nem kezelt C-1/C-2 alcsoportban és az FUval kezelt C-3/C-4 alcsoportban, bár a különbségek egyik esetben sem voltak statisztikailag szignifikánsak. Lényegében egyetlen adat sem utalt a túlélés javulására. Más vizsgálatoktól eltérô elemzésünkben egységes módszereket alkalmaztunk az MSI-H kimutatására, mivel csak az NCI által támogatott, öt lókuszból álló referenciapanelt használtuk. 32 Mind az öt NCI-markert amplifikálni kellett ahhoz, hogy egy adott minta MSI-H minôsítést kapjon, és e szigorú kritériumot az egész tanulmány során betartottuk. A vizsgált betegek összesen 18,1%-ánál találtunk nagyfokú mikroszatellita-instabilitást (MSI-H), ami az általánosan elfogadott tartományban (15 21%) van. Az NCI-NSABP vizsgálatban az MSI-H és más molekuláris markerek közötti kapcsolatokat is elemeztük, és a korábbi laboratóriumi vizsgálatok leleteivel egybehangzó eredményeket kaptunk. Vizsgálatunk különösen a mutáns p53 és az MSI-H közötti fordított korrelációt erôsíti meg, melyet már a mikroszatellita-instabilitást mutató tumorok korai vizsgálataiban is leírtak. 5 Ami az MSI-H státus és a mutáns p53, illetve az RFS potenciális kapcsolatát illeti, nem világos, hogy megfigyelésünk statisztikai mûtermék vagy valódi kapcsolatról van-e szó. A vizsgált alcsoportok száma torzíthatta megfigyelésünket ezt a késôbbi vizsgálatoknak kell alátámasztaniuk vagy megcáfolniuk. A kevéssé differenciált, sok S-fázisú frakciót tartalmazó MSI tumorok korai patológiai leírásai is elôre jelezhették volna az MSI-H és a Ki67 közötti pozitív korrelációt. 33,34 Elemzésünk az MSI-H és a Ki67 pozitív kapcsolatára utal (p =,3). A TGFβRII-vel kapcsolatos elemzéseket elsôsorban a Hamilton és munkatársai által közölt eredmények megerôsítése céljából végeztük el. 35 A TGFβRII-vel kapcsolatban nem észleltünk kedvezô hatást (az MSI-H-betegek egyik csoportjában sem); mindazonáltal meg kell jegyezni, hogy a tág megbízhatósági intervallumok átfedték egymást. Ennél is érdekesebb az MSI és a TS kapcsolata, különösen a fluoropirimidin alapú kemoterápia kimenetelének elôrejelzése tekintetében. Általánosságban számos kutató megállapította, hogy az emelkedett TS-szint rosszabb klinikai kimenetelt vetít elôre. 31,36 38 Érdekes módon, a hibás MMR-t hordozó HCT116 sejtvonalban kétszer akkora TS-szint mérhetô, mint a jól mûködô MMR-t tartalmazó HT29 sejtvonalban. 39 A HCT116 sejtek jellemzôje, hogy fluoropirimidin-rezisztenciájuk 17-szer nagyobb, mint a genetikailag azonos, ép MLH1-et tartalmazó párjaiké. 22, Hibás vagy mûködô MMR-t tartalmazó sejtekbôl álló xenograft-modellekben FU-kezelés után a hibás MMR-rel rendelkezô sejtek aránya 21%-kal emelkedett. 23 Némileg paradox módon, a hibás MMR-t tartalmazó HCT116 sejtek DNS-ébe nagyobb mértékben épült be a halogénezett timidin, mint az ép MMR-rel rendelkezô sejtekbe. 41 Az FU-rezisztenciával kapcsolatos megfigyelések ellenére NSABP vizsgálatunk elsôként számol be arról, hogy az MSI-H és a TS között nem mutatható ki kölcsönhatás. Bár elemzésünk retrospektív, erôsségei a következôk: (1) a betegeket prospektív, véletlen besorolásos, több központ bevonásával lefolytatott NSABP vizsgálatokból válogattuk, amelyekben standard FU/leucovorin kezelést alkalmaztak; (2) statisztikai módszerekkel igazoltuk, hogy a kiválasztott betegek megfelelôen reprezentálják a teljes kohorszt; (3) az MSI-H kimutatására a Bethesda-irányelveknek megfelelô referenciapanelt használtuk; (4) eredményeink más közleményekkel összhangban voltak az MSI-H-betegek százalékos aránya, a Bat25 és a Bat26 marker érzékenysége, valamint a mutáns p53-mal való fordított korreláció tekintetében; és (5) megfigyeltük, hogy az MSI-H-betegek recidívamentes túlélése jobb, míg a mutáns p53-at hordozó MSS-betegek prognózisa rosszabb volt. Más vizsgálatokhoz hasonlóan amelyekben több nagy munkacsoport archivált mintáit használták korlátozza elemzésünket, hogy viszonylag csekély statisztikai erôvel rendelkezik, hiszen csak kevés betegektôl álltak rendelkezésre elemzésre alkalmas tumorminták. Mivel a vizsgálatba kiválasztott betegeket nem véletlenszerûen soroltuk be a csak mûtéttel kezelt vagy FU/LV-terápiára került csoportokba, elmaradt a kezelések MSI-státustól függô, közvetlen összehasonlítása, és ezt nem is mutattuk be eredményeink között. Más vizsgálatokkal ellentétben az FU/LV-kezelés és az MSI-státus között nem találtunk kapcsolatot (2. táblázat). Mindazonáltal az interaktív tag kockázati hányadosa (HR) körüli konfidencia-intervallumok tágak voltak (2. táblázat), ezért e hatás nem zárható ki teljes bizonyossággal. Pontosabban szólva, az adatok nem utalnak arra, hogy az adjuváns terápia lényegesen kedvezôbb hatású lenne az MSI-H daganatok esetében, mint az MSS daganatoknál. Az eredmények azt jelzik, hogy az MSI-H-betegek korábban már említett kedvezôbb kórjóslata inkább e daganatok biológiai tulajdonságaitól, mintsem az adjuváns FU alapú kemoterápia hatásától függ. Az MSI mint potenciális prediktív marker szerepének tisztázására további vizsgálatokra van szükség, hiszen fontos kérdésrôl van szó. Az újabb szerek, például az oxaliplatin és a biológiai szerek adjuváns használatával és hatásaival kapcsolatos prospektív, randomizált vizsgálatok részletesebben is fel fogják tárni az MSI-H potenciális prediktív szerepét. 132 JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY

7 A nagyfokú mikroszatellita-instabilitás prognosztikai és prediktív szerepe vastagbélrákban NYILATKOZAT A szerzôk kijelentik, hogy nem állnak pénzügyi kapcsolatban a cikkben lényeges szerepet játszó termékek gyártóival, sem olyan céggel, amelyik konkurens terméket forgalmaz. A SZERZÔK HOZZÁJÁRULÁSA A KÉZIRAT ELKÉSZÍTÉSÉHEZ A vizsgálat ötlete és megtervezése: George P. Kim, Linda H. Colangelo, H. Samuel Wieand, Soonmyung Paik, Ilan R. Kirsch, Carmen J. Allegra Anyagi támogatás: George P. Kim Adminisztratív segítség: George P. Kim, Ilan R. Kirsch, Norman Wolmark A vizsgálati anyagokról, illetve a betegekrôl gondoskodott: George P. Kim, Soonmyung Paik Adatgyûjtés és -rendszerezés: George P. Kim, Linda H. Colangelo, H. Samuel Wieand, Soonmyung Paik, Carmen J. Allegra Adatelemzés és az eredmények értékelése: George P. Kim, Linda H. Colangelo, H. Samuel Wieand, Soonmyung Paik, Ilan R. Kirsch, Carmen J. Allegra A kéziratot elkészítette: George P. Kim, Linda H. Colangelo, H. Samuel Wieand, Ilan R. Kirsch, Norman Wolmark, Carmen J. Allegra A kézirat végsô jóváhagyása: George P. Kim, Linda H. Colangelo, H. Samuel Wieand, Soonmyung Paik, Ilan R. Kirsch, Norman Wolmark, Carmen J. Allegra HIVATKOZÁSOK 1. Jemal A, Murray T, Ward E, et al: Cancer Statistics, 6. CA Cancer J Clin 56:16-13, 6 2. Moertel CG, Fleming TR, Macdonald JS, et al: Fluorouracil plus levamisole as effective adjuvant therapy after resection of stage III colon carcinoma: A final report. Ann Intern Med 122: , O Connell MJ, Laurie JA, Kahn M, et al: Prospectively randomized trial of postoperative adjuvant chemotherapy in patients with high-risk colon cancer. J Clin Oncol 16:295-3, Aaltonen LA, Peltomaki P, Leach FS, et al: Clues to the pathogenesis of familial colorectal cancer. Science 2: , Ionov Y, Peinado MA, Malkhosyan S, et al: Ubiquitous somatic mutations in simple repeated sequences reveal a new mechanism for colonic carcinogenesis. Nature 363: , Lynch HT, de la Chapelle A: Genetic susceptibility to non-polyposis colorectal cancer. J Med Genet 36:81-818, Lynch HT, Bardawil WA, Harris RE, et al: Multiple primary cancers and prolonged survival: Familial colonic and endometrial cancers. Dis Colon Rectum 21: , Sankila R, Aaltonen LA, Jarvinen HJ, et al: Better survival rates in patients with MLH1- associated hereditary colorectal cancer. Gastroenterology 11: , Cawkwell L, Bell SM, Lewis FA, et al: Rapid detection of allele loss in colorectal tumours using microsatellites and fluorescent DNA technology. Br J Cancer 67: , Lothe RA, Peltomaki P, Meling GI, et al: Genomic instability in colorectal cancer: Relationship to clinicopathological variables and family history. Cancer Res 53: , Thibodeau SN, Bren G, Schaid D: Microsatellite instability in cancer of the proximal colon. Science 2: , Bubb VJ, Curtis LJ, Cunningham C, et al: Microsatellite instability and the role of hmsh2 in sporadic colorectal cancer. Oncogene 12: , Lukish JR, Muro K, DeNobile J, et al: Prognostic significance of DNA replication errors in young patients with colorectal cancer. Ann Surg 227:51-56, Gryfe R, Kim H, Hsieh ET, et al: Tumor microsatellite instability and clinical outcome in young patients with colorectal cancer. N Engl J Med 342: 69-77, 15. Fishel R, Ewel A, Lee S, et al: Binding of mismatched microsatellite DNA sequences by the human MSH2 protein. Science 266:13-15, Palombo F, Iaccarino I, Nakajima E, et al: HMutSbeta, a heterodimer of hmsh2 and hmsh3, binds to insertion/deletion loops in DNA. Curr Biol 6: , Anthoney DA, McIlwrath AJ, Gallagher WM, et al: Microsatellite instability, apoptosis, and loss of p53 function in drug-resistant tumor cells. Cancer Res 56: , Gradia S, Acharya S, Fishel R: The role of mismatched nucleotides in activating the hmsh2- hmsh6 molecular switch. J Biol Chem 275: , 19. Kat A, Thilly WG, Fang WH, et al: An alkylation-tolerant, mutator human cell line is deficient in strand-specific mismatch repair. Proc Natl Acad Sci U S A 9: , Aebi S, Kurdi-Haidar B, Gordon R, et al: Loss of DNA mismatch repair in acquired resistance to cisplatin. Cancer Res 56:387-39, Fink D, Nebel S, Aebi S, et al: The role of DNA mismatch repair in platinum drug resistance. Cancer Res 56: , Meyers M, Wagner MW, Hwang HS, et al: Role of the hmlh1 DNA mismatch repair protein in fluoropyrimidine-mediated cell death and cell cycle responses. Cancer Res 61: , Carethers JM, Chauhan DP, Fink D, et al: Mismatch repair proficiency and in vitro response to 5-fluorouracil. Gastroenterology 117: , Elsaleh H, Powell B, Soontrapornchai P, et al: p53 gene mutation, microsatellite instability and adjuvant chemotherapy: Impact on survival of 388 patients with Dukes C colon carcinoma. Oncology 58:52-59, 25. Elsaleh H, Powell B, McCaul K, et al: P53 alteration and microsatellite instability have predictive value for survival benefit from chemotherapy in stage III colorectal carcinoma. Clin Cancer Res 7: , Ribic CM, Sargent DJ, Moore MJ, et al: Tumor microsatellite-instability status as a predictor of benefit from fluorouracil-based adjuvant chemotherapy for colon cancer. N Engl J Med 349: , Wolmark N, Fisher B, Rockette H, et al: Postoperative adjuvant chemotherapy or BCG for colon cancer: Results from NSABP protocol C-1. J Natl Cancer Inst 8:3-36, Wolmark N, Rockette H, Wickerham DL, et al: Adjuvant therapy of Dukes A, B, and C adenocarcinoma of the colon with portal-vein fluorouracil hepatic infusion: Preliminary results of National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project Protocol C-2. J Clin Oncol 8: , Wolmark N, Rockette H, Fisher B, et al: The benefit of leucovorin-modulated fluorouracil as postoperative adjuvant therapy for primary colon cancer: Results from National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project protocol C-3. J Clin Oncol 11: , Wolmark N, Rockette H, Mamounas E, et al: Clinical trial to assess the relative efficacy of fluorouracil and leucovorin, fluorouracil and levamisole, and fluorouracil, leucovorin, and levamisole in patients with Dukes B and C carcinoma of the colon: Results from National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project C-4. J Clin Oncol 17: , Allegra CJ, Parr AL, Wold LE, et al: Investigation of the prognostic and predictive value of thymidylate synthase, p53, and Ki-67 in patients with locally advanced colon cancer. J Clin Oncol : , Boland CR, Thibodeau SN, Hamilton SR, et al: A National Cancer Institute workshop on microsatellite instability for cancer detection and familial predisposition: Development of international criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer. Cancer Res 58: , Edmonston TB, Cuesta KH, Burkholder S, et al: Colorectal carcinomas with high microsatellite instability: Defining a distinct immunologic and molecular entity with respect to prognostic markers. Hum Pathol 31: , 34. Michael-Robinson JM, Reid LE, Purdie DM, et al: Proliferation, apoptosis, and survival in high-level microsatellite instability sporadic colorectal cancer. Clin Cancer Res 7: , Watanabe T, Wu TT, Catalano PJ, et al: Molecular predictors of survival after adjuvant chemotherapy for colon cancer. N Engl J Med 344: ,

8 Kim és mtsai 36. Lenz HJ, Danenberg KD, Leichman CG, et al: p53 and thymidylate synthase expression in untreated stage II colon cancer: Associations with recurrence, survival, and site. Clin Cancer Res 4: , Johnston PG, Fisher ER, Rockette HE, et al: The role of thymidylate synthase expression in prognosis and outcome of adjuvant chemotherapy in patients with rectal cancer. J Clin Oncol 12: , Edler D, Glimelius B, Hallstrom M, et al: Thymidylate synthase expression in colorectal cancer: A prognostic and predictive marker of benefit from adjuvant fluorouracil-based chemotherapy. J Clin Oncol : , Ren Q, Van Groeningen CJ, Hardcastle A, et al: Determinants of cytotoxicity with prolonged exposure to fluorouracil in human colon cancer cells. Oncol Res 9:77-88, Berger SH, Berger FG: Thymidylate synthase as a determinant of 5-fluoro-2 -deoxyuridine response in human colonic tumor cell lines. Mol Pharmacol 34: , Berry SE, Garces C, Hwang HS, et al: The mismatch repair protein, hmlh1, mediates 5-substituted halogenated thymidine analogue cytotoxicity, DNA incorporation, and radiosensitization in human colon cancer cells. Cancer Res 59: , 1999 Köszönetnyilvánítás Köszönetet mondunk Barbara C. Goodnak (PhD), a National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project tudományos közleményekért felelôs igazgatójának, valamint a National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project részérôl Michael J. O Connellnek a kézirat áttekintéséért. 134 JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY