QUANTA Lite TM Chromatin In Vitro diagnosztikai alkalmazásra CLIA Bonyolultság: magas

Átírás

1 QUANTA Lite TM Chromatin In Vitro diagnosztikai alkalmazásra CLIA Bonyolultság: magas Javasolt alkalmazás QUANTA Lite TM Chromatin egy enzimmel kapcsolt immunoszorbens assay (ELISA) a chromatin antitestek szemi-kvantitatív kimutatására humán szérumban. A chromatin antitestek kimutatása felhasználható a klinikai adatokkal és más laboratóriumi vizsgálatokkal együtt a gyógyszer-indukált lupus (DIL) és a szisztémás lupus erythematosus (SLE) diagnosztikája során. A teszt összegzése és magyarázata A chromatin a sejtek magjában lévő természetes összetevő. Felépítésében a natív DNS vesz részt, ami a (H2A-H2B-H3-H4) 2 hiszton octamert borítja, a csatlakozó H1 hiszton és néhány nem-hiszton fehérjével kiegészítve. Az anti-chromatin autoantitestek kimutatására számos különböző módszert használtak, többek között az LE sejt 1 vizsgálatával, immunprecipitációval 2, immunfluorescens eljárással a sejtek savas extrakcióját követő rekonstruált hiszton 3 vizsgálatával, és ELISA módszerekkel 4,5. Ilyen ellenanyagok találhatók elsősorban SLE betegekben, 3,6,7,8 DIL, 9,10 és esetleg előfordulhatnak más betegségek kapcsán is. 11 A chromatin antitesteket másképpen antinucleosoma 5,8,11, anti-(h2a-h2b) DNA 9,13, anti-dnp 3,4, és LE-sejt faktor 1,11 néven ismerjük. A teszt alkalmazásának egyik fő területe a DIL diagnózisának elősegítése. Antitesteket találtak mind a hisztonok mind pedig a chromatin ellen procainamide-indukált lupus eseteiben. 9,12,13 Anti-hiszton antitestek azonban kimutathatók voltak olyan páciensekben is, akik procainamid kezelésben részesültek, de nem mutattak lupus-szerű tüneteket.. 9,13 Ezzel szemben, anti-chromatin antitestek sokkal ritkábban fordulnak elő, és ilyenkor is alacsony titerrel ezekben a tünetmentes egyénekben. 9,13 Ezen kívül azokban a betegekben, akiknél lupus alakult ki quinidine, penicillamine, methyldopa és acebutalol kezelés következtében, megtalálhatók az anti-chromatin de nem az antihiszton antitestek. 9,10 Így, az idézett publikációk alapján az anti-chromatin érzékenyebb és specifikusabb a gyógyszer-indukált lupus vonatkozásában, mint az anti-hiszton. Érdekes módon, az anti-chromatin antitestek kimutathatók a procainmaidot szedő betegekben már röviddel a lupusszerű tünetek megjelenése előtt.. 13 A chromatin ELISA-val foglakozó több tanulmányban azt találták, hogy az SLE betegek 50 90%- ában az anti-chromatin autoantitestek kimutathatók. 6,7,8 Ez az arány megegyezik az LE sejt pozitív betegek százalékos arányával. 14 Általánosan több SLE beteg lesz pozitív anti-chromatin antitestre, mint anti-hiszton vagy anti-dna antitestekre. 6,7,8,11,14 Az anti-chromatin antitestek jelenlétét ezen felül kapcsoaltba tudták hozni a proteinuria megjelenésével SLE betegekben. 1 A chromatin antitestek a nativ hiszton-dns komplexet alkotó epitopok ellen, a natív DNS ellen és a hisztonnak a chromatinban exponált régiói ellen irányulnak. 7,9,11 Így az anti-ndna antitestek az antichromatin antitestek egy alcsoportjának tekinthetők. Némely anti-hiszton antitestek azonban a denaturált hisztonon exponált epitopok ellen irányulnak, amelyek így nem fejeződnek ki a chromatinban. 11 A módszer elve Nagy mértékben tisztított borjú thymus chromatint, ami hiszton (H2A-H2B-H3-H4) 2 octamer törzs köré tekert DNS-t tartalmaz, rögzítenek egy mikrotiter lemez mérőedénykéinek belső falához. A tisztítási folyamatban ah 1 hiszton és a nem-hiszton fehérjék eltávolításra kerültek. Az előhígított kontrollokat és a hígított beteg-mintákat az egyes különálló mélyedésekbe töltjük, ahol a mintában esetleg jelen lévő chromatin antitestek kikötődnek az edény falához rögzített antigénhez. A nem kötődött mintát mosással eltávolítjuk, és minden egyes mélyedésbe enzimmel kapcsolt anti-humán IgG konjugátumot adunk. A második inkubáció lehetővé teszi az enzimmel jelzett anti-humán IgG számára, hogy a vizsgált mintából származó, az első inkubáció során lekötött antitesthez kapcsolódjon, ha volt ilyen. Miután az enzimmel jelölt anti-humán IgG felesleget mosással eltávolítottuk, a rögzítve maradt enzim aktivitását kromogén szubsztrát hozzáadásával és a kialakult szín intenzitásának mérésével határozzuk meg. A teszt spektrofotometriával értékelhető oly módon, hogy a minta-edényekben kialakult szín intenzitását a kontrollokéhoz hasonlítjuk. Reagensek 1. Polisztirén mikrotiter ELISA lemez, tisztított chromatin antigénnel (12-1 x 8 mérőhely) bevonva, tartókerettel, szárítóbetétet tartalmazó fóliatasakba csomagolva 2. ELISA Negatív Kontroll, 1 üveg puffer, tartósító anyagokat és humán szérumot tartalmaz, amelyben nincsenek humán anti-chromatin antitestek, előhígítva, 1.2mL 3. Chromatin ELISA Low Positive (Mérsékelten Pozitív Kontroll), 1 üveg puffer, benne tartósító anyagok és humán szérum anti-chromatin antitestekkel, előhígítva, 1.2mL 4. Chromatin ELISA High Positive (Erősen Pozitív Kontroll), 1 üveg puffer, benne tartósító anyagok és humán szérum anti-chromatin antitestekkel, előhígítva, 1.2mL 1

2 5. HRP Minta Diluens, 1 üveg rózsaszínű, tartalma: konyhasó TRIS pufferrel, Tween 20, protein stabilizátorok és tartósító anyagok, 50mL 6. HRP Mosó Koncentrátum, 1 üveg 40x-es koncentrátum pirosra színezett, tartalma: konyhasó TRIS pufferrel és Tween 20, 25mL. A hígítási javaslatok a Módszer szakaszban találhatók. 7. HRP IgG Konjugátum, (kecske), anti-humán IgG, 1 üveg kékre színezett, puffert, protein stabilizátorokat és tartósító anyagokat tartalmaz, 10mL 8. TMB Kromogén, 1 üveg, stabilizátorokat tartalmaz, 10mL 9. HRP Stop (leállító) Oldat, 0.344M kénsav, 1 üveg színtelen, 10mL Veszélyforrások 1. FIGYELEM: Ez a termék olyan kémiai anyagot (0.02% chloramphenicol) tartalmaz a mintahígítóban, a kontrollokban és a konjugátumban, amelyet California államban rákkeltőként tartanak nyilván. 2. Az összes humán eredetű anyagot, amelyeket a kontrollok előállítása során felhasználtak ehhez a termékhez, ellenőrizték és negatívnak találták HIV, HBsAg, és HCV ellenes antitestekre nézve az FDA által jóváhagyott módszerekkel. Semmilyen teszt módszer nem tud azonban tökéletes biztonságot nyújtani arra nézve, hogy a termék mentes HIV, HBV, HCV vírusoktól, vagy más fertőző ágensektől. Éppen ezért, a Chromatin ELISA Mérsékelten Pozitív Kontroll, a Chromatin ELISA Erősen Pozitív Kontroll és az ELISA Negatív Kontroll potenciálisan fertőző anyagként kezelendő Nátrium azidot alkalmaztak az oldatok stabilizálására. A nátrium azid méreg, és lenyelve, vagy szemen, bőrön keresztül felszívódva toxikus lehet. A nátrium azid ezen kívül ólom vagy réztartalmú vízvezeték csövekkel reakcióba léphet, robbanásveszélyes fém-azid komplexet képezve. Ha a reagensek maradványait a vízvezeték rendszeren keresztül távolítja el, öblítse a medencét nagy mennyiségű vízzel az azid lerakódás megakadályozása céljából. 4. A HRP konjugátum egy híg mérgező/korrozív vegyszert tartalmaz, ami nagy mennyiségben elfogyasztva toxikus lehet. Az esetleges vegyi égési sérülés megelőzése érdekében vigyázzon, hogy az anyag bőrre, szembe ne kerülhessen. 5. A TMB Kromogén irritáló anyagot tartalmaz, ami belélegezve, lenyelve, vagy a bőrön keresztül felszívódva veszélyes lehet. A sérülések megelőzése érdekében kerülje az anyag belélegzését, elfogyasztását illetve a bőrre, szembe jutását. 6. A HRP Stop oldat hígított kénsav oldat. Ne tegye ki bázisok, fémek vagy más olyan anyagok hatásának, amelyek savakkal reakcióba lépnek. A kénsav mérgező és maró anyag, lenyelve toxikus lehet. Az esetleges vegyi égési sérülés megelőzése érdekében vigyázzon, hogy az anyag bőrre, szembe ne kerülhessen. 7. Használjon megfelelő személyi védőeszközöket a kitben található reagensekkel végzett műveletek során. 8. A kicsöppenő reagenseket azonnal fel kell takarítani. A hulladékok eltávolítása folyamán tartsa be az összes szövetségi, állami és helyi környezetvédelmi előírást. Az analitikai hibák megelőzését célzó figyelmeztetések 1. Ez a termék in vitro diagnosztikai alkalmazásra készült. 2. A rendszer egyes elemeinek helyettesítése más termékekkel az eredményeket meghamisíthatja. 3. Nem tökéletes vagy hatástalan mosás, és a folyadék elégtelen eltávolítása az ELISA csíkok edénykéiből nem megfelelő reprodukálhatóságot és/vagy magas hátteret okozhat. 4. Ennek a tesztnek az adaptációja automatikus mintakezelési rendszerek és más folyadékkezelő eszközök használatához, teljes egészében vagy részleteiben, a teszt eredményeinek eltérését okozhatja attól, amit manuális módszerrel nyertek. Minden laboratóriumnak a saját felelőssége az általa alkalmazott automatizált rendszer validálása annak érdekében, hogy az eredmények elfogadható tartományon belül legyenek. 5. A teszt működését változatos tényezők befolyásolhatják. Ilyenek lehetnek a reagensek induló hőmérséklete, a környezeti hőmérséklet, a pipettázási technika pontossága és reprodukálhatósága, a mosás és a folyadék-maradványoknak az ELISA lemez edénykéiből történő eltávolításának az alapossága, az eredmények mérésére használt fotométer, és az assay kivitelezése során alkalmazott inkubációs idők tartama. Nagy gondot kell fordítani a következetességre annak érdekében, hogy a kapott eredmények megbízhatóak és reprodukálhatóak legyenek. 6. Javasoljuk, hogy a vizsgálat kivitelezése során szigorúan kövesse a protokollt. 7. A mikrotiter csíkokat és a szárító betéteket tartalmazó visszazárható tasakok tökéletlen lezárása az antigén degradációját és a teszt precizitásának romlását okozza. 8. A HRP konjugátumnak bizonyos idő-intervallumban két vagy több alkalommal történő használata ugyanabból az üvegből, elfogadhatatlanul alacsony abszorbancia értékeket eredményezhet. Fontos a HRP konjugátum kezelésére vonatkozó előírások pontos betartása az ilyen problémák megelőzése érdekében. 2

3 9. A HRP konjugátum kémiai szennyeződése következhet be az eszközök és műszerek nem megfelelő tisztítása miatt. Általánosan használt laboratóriumi vegyszerek, mint például a formalin, fehérítő szerek, alkohol vagy detergensek maradványai a HRP konjugátum lebomlását okozzák bizonyos idő után. Kémiai tisztítószerek vagy fertőtlenítő szerek használata után a készülékeket és eszközöket alaposan le kell öblíteni. Tárolási körülmények 1. A kit valamennyi reagensét tárolja 2-8 C között. Nem szabad fagyasztani a terméket. A reagensek az előírásoknak megfelelően kezelve és tárolva a feltüntetett lejárati időn belül stabilak. 2. A fel nem használt, antigénnel bevont mikrotiter csíkokat a szárítóbetéttel együtt biztonságosan vissza kell zárni a fóliatasakba, és 2-8 C között kell tárolni. 3. A hígított mosópuffer 2-8 C között tartva 1 hétig használható. A minta vétele és kezelése Ez az eljárás szérum minták vizsgálatára alkalmas. A vizsgálandó mintákhoz azidot vagy más tartósító anyagokat adni nem ajánlott, mert ezek torzíthatják az eredményeket. Mikrobiológiai szempontból szennyezett, hőkezelt, vagy látható csapadékot, szilárd részecskéket tartalmazó minta nem használható. Kerülje az erősen hemolizált vagy lipémiás minták használatát. Levétel után a szérumot az alvadéktól el kell választani. Az NCCLS Document H18-A2 a minták tárolására a következő körülményeket javasolja: 1) Ne tartsa a mintákat 8 óránál hosszabb ideig szobahőmérsékleten. 2) Ha a vizsgálat nem végezhető el 8 órán belül, tartsa a mintákat hűtve, 2-8 C között. 3) Ha a teszt nem végezhető el 48 órán belül, vagy a minták szállítására van szükség, fagyassza és tárolja a mintákat -20 C-on vagy ennél alacsonyabb hőmérsékleten. A fagyasztott mintákat a kiolvasztás után és vizsgálat előtt alaposan fel kell keverni. A teszt kivitelezése A kitben rendelkezésre álló anyagok 1 Chromatin ELISA mikrotiter lemez, (12-1 x 8 mérőhely), tartókerettel 1 1.2mL ELISA Negatív Kontroll, előhígítva 1 1.2mL Chromatin ELISA Mérsékelten Pozitív Kontroll előhígítva 1 1.2mL Chromatin ELISA Erősen Pozitív Kontroll előhígítva 1 50mL HRP Minta Diluens 1 25mL HRP Mosó Koncentrátum, 40x es koncentráció 1 10mL HRP IgG Konjugátum, (kecske), anti-humán IgG 1 10mL TMB Kromogén 1 10mL HRP Stop (leállító) Oldat, 0.344M Kénsav További szükséges anyagok a kiten kívül Mikropipetták 5, 100, , és 500µL beméréséhez Egyszer használatos mikropipetta-hegyek Tesztcsövek a betegek mintáinak hígításához, 4mL térfogattal Desztillált vagy ionmentesített víz 1L-es edény az HRP Mosó Koncentrátum hígításához Mikrotiter lemez leolvasó, ami képes az OD mérésére 450nm-en (és 620nm-en a két hullámhosszon történő leolvasáshoz) Módszer Mielőtt hozzákezd: 1. Várjon, míg a minták és a reagensek elérik a szobahőmérsékletet (20-26 o C) és mindegyiket jól keverje meg. 2. Hígítsa a HRP Mosó Koncentrátumot 1:40 arányban, úgy, hogy a HRP Mosó Koncentrátumos üveg tartalmát 975mL desztillált vagy ionmentesített vízhez adja. Ha nem kerül a teljes lemez egyszerre feldolgozásra, kisebb mennyiséget is lehet hígítani: minden 16 felhasználandó mérőhely számára adjon 2 ml koncentrátumot 78 ml desztillált vagy ionmentesített vízhez. A hígított puffer 1 hétig stabil 2 8 C között tárolva. 3. Készítsen minden egyes beteg-mintából 1:101 arányú hígítást a következő módon: adjon 5µL mintát 500µL HRP minta diluenshez. A hígított mintákat 8 órán belül fel kell használni. NE HÍGÍTSA a Chromatin ELISA Mérsékelten Pozitív, a Chromatin ELISA Erősen Pozitív és az ELISA Negatív Kontrollt. 4. Az anti-chromatin antitestek jelenlétének vagy hiányának tapasztalati egységben történő meghatározása céljából használjon minden egyes kontroll teszteléséhez két-két mérőhelyet, és a betegek mintának lemérésére egy vagy két mérőhelyet. Javasoljuk a betegek mintáiból is a párhuzamos (duplikált) meghatározásokat. A módszer kivitelezése 1. VALAMENNYI REAGENSNEK EL KELL ÉRNIE A SZOBA HŐMÉRSÉKLETÉT (20-26 C) 3

4 A VIZSGÁLAT MEGKEZDÉSE ELŐTT. Helyezze a szükséges számú mérőedénykét/csíkot a keretbe. A fel nem használt csíkokat haladéktalanul tegye vissza a szárítóbetétet tartalmazó fóliatasakba, és zárja vissza a tasakot biztonságosan, hogy a mérőhelyek minimális ideig legyenek kitéve a párásodás veszélyének. 2. Pipettázzon 100µL-t mind az előhígított Chromatin ELISA Mérsékelten Pozitív, a Chromatin ELISA Erősen Pozitív kontrollokból, az ELISA Negatív Kontrollból és a hígított betegmintákból a mérőedénykékbe. Fedje be a lemezeket, és inkubálja 30 percig szobahőmérsékleten, sima vízszintes felületen. Az inkubációs idő az utolsó minta bemérése után kezdődik. 3. Mosás: Gondosan szívja le minden egyes mérőedényke tartalmát. Adjon µL hígított HRP Mosó puffert minden egyes mérőhelyhez, majd ezt is szivassa ki. Ismételje az eljárást még kétszer, így végezzen el összesen három mosást. Fordítsa a lemezt nyílásokkal lefelé, és egy nedvszívó felületen finoman ütögetve távolítsa el tökéletesen az utolsó mosás után visszamaradt nedvesség nyomait az edénykékből. Nagyon fontos, hogy az edénykék minden egyes mosási lépés után tökéletesen ki legyenek ürítve. A leszíváskor tartsa be a minta felvitelekor alkalmazott sorrendet. 4. Adjon 100μL HRP IgG Konjugátumot minden egyes mérőhelyhez. A konjugátumot az eredeti reagens üvegből aszeptikus körülmények között és a helyes laboratóriumi eljárásnak megfelelően kell kivenni. Csak annyi konjugátumot vegyen ki az üvegből, amennyire a teszt kivitelezéséhez szüksége van. A POTENCIÁLIS MIKROBIOLÓGIAI ÉS/VAGY KÉMIAI SZENNYEZŐDÉS ELKERÜLÉSE ÉRDEKÉBEN SOHA NE TÖLTSE VISSZA A FEL NEM HASZNÁLT KONJUGÁTUMOT AZ ÜVEGBE. Inkubálja a lemezt 30 percig, mint a 2-ik lépésben. 5. Mosás: Ismételje a 3 lépést. 6. Adjon 100µL TMB kromogént minden egyes edénykébe, és inkubálja sötét helyen 30 percig szobahőmérsékleten. 7. Adjon 100µL HRP Stop oldatot minden mérőhelyre. Tartsa be a HRP Stop oldat adagolása alkalmával ugyanazt a tempót és sorrendet, amit a TMB kromogén bemérésekor használt. Óvatosan ütögesse meg ujjával a lemez oldalát, az edénykék tartalmának alapos összekeverése céljából. 8. Olvassa le minden egyes mérőhely abszorbancia (OD) értékét a reakció leállítását követő egy órán belül, 450 nm-en. Ha bikromatikus leolvasást igényel, referencia hullámhossznak a 620nm használható. Minőség-ellenőrzés 1. A Chromatin ELISA Mérsékelten Pozitív Kontroll, a Chromatin ELISA Erősen Pozitív Kontroll és az ELISA Negatív Kontroll minden egyes beteg-minta sorozattal együtt kell fusson, hogy ellenőrizhető legyen, hogy az összes reagens és az eljárás végrehajtása is kifogástalan volt a teszt kivitelezése folyamán. 2. Ne feledje, hogy mivel a Chromatin ELISA Mérsékelten Pozitív Kontroll, a Chromatin ELISA Erősen Pozitív Kontroll és az ELISA Negatív Kontroll előhígítva kerülnek forgalomba, ezek nem kontrollálják a minta hígításával kapcsolatos előkészítési folyamatot. 3. Kiegészítő kontrollok vizsgálata is végezhető a helyi, állami és/vagy szövetségi rendelkezések, vagy az akkreditációs testületek ajánlásainak vagy elvárásainak megfelelően. Alkalmas kiegészítő kontroll szérum készíthető kevert humán szérum minták szétosztásával, és < -20 C-on történő tárolásával. 4. Annak érdekében, hogy a teszt eredményeit érvényesnek tekinthessük, valamennyi, alább felsorolt kritériumnak teljesülnie kell. Ha ezek közül bármelyik nem teljesül, a tesztet érvénytelennek kell tekinteni, és az eljárást meg kell ismételni. a. Az előhígított Chromatin ELISA Erősen Pozitív Kontroll abszorbanciája nagyobb kell, hogy legyen, mint az előhígított Chromatin ELISA Mérsékelten Pozitív Kontroll abszorbanciája, és ez nagyobb kell legyen, mint az előhígított ELISA Negatív Kontroll abszorbanciája. b. Az előhígított Chromatin ELISA Erősen Pozitív Kontroll abszorbanciája 1.0-nél nagyobb kell legyen, míg az előhígított ELISA Negatív Kontroll abszorbanciája nem lehet nagyobb 0.2-nél. c. A Chromatin ELISA Mérsékelten Pozitív Kontroll abszorbanciája több, mint kétszerese kell legyen az ELISA Negatív Kontroll abszorbanciájának, vagy legyen nagyobb, mint d. Az ELISA Negatív Kontroll és a Chromatin ELISA Erősen Pozitív Kontroll a reagens minőségének jelentősebb eltérését kontrollálja. A Chromatin ELISA Erősen Pozitív Kontroll használata nem garantálja a precizitást az assay küszöb (cutoff) koncentrációja közelében. e. A megfelelő QC eljárásokra vonatkozó további információkat az NCCLS Document C24-A2 tartalmazza, ennek tanulmányozása ajánlott. 4

5 Az eredmények kiszámítása Először határozza meg a párhuzamos minták OD értékeinek átlagát. Ezután kiszámítható az egyes minták reaktivitása úgy, hogy a minta OD átlagát elosztja a Chromatin ELISA Mérsékelten Pozitív Kontroll OD átlagával. Az eredményt megszorozza a Chromatin ELISA Mérsékelten Pozitív Kontroll címkéjén található egységek mérőszámával. Minta OD Minta éretéke = x Chromatin ELISA Mérs. Pozitív Kontroll (egység) Chromatin ELISA Mérs.Poz.Kontroll OD (egység) A reaktivitás és a mintában lévő antitestek mennyisége között nem-lineáris kapcsolat van. Miközben a beteg antitest koncentrációjának növekedése és csökkenése a reaktivitás ezzel összefüggő növekedésében és csökkenésében mutatkozik meg, a változás nem lesz arányos (azaz, például a koncentráció kétszeresére nő, de a reaktivitás nem lesz kétszeres). Ha a beteg antitest koncentrációjának ennél pontosabb meghatározására van szükség, a beteg mintájának sorozatos hígítását kell tesztelni, és azt az utolsó hígítást tekintjük a beteg antitest titer értékének, ami még a tesztben pozitív eredményt adott. Az eredmények értelmezése Az ELISA assay a kivitelezési technikára nagyon érzékeny módszer, és képes a beteg-populációk között lévő igen kis különbségek érzékelésére. Az alábbi értékek csak tájékoztató jellegűek. Minden laboratóriumban meg kell határozni a saját referencia tartományokat, az aktuálisan használt technikával, kontrollokkal, eszközökkel, és a vizsgált beteg populációra jellemző módon, a helyi eljárási szabályoknak megfelelően. A mintákat az alábbi táblázat segítségével besorolhatjuk a negatív, mérsékelten pozitív vagy erősen pozitív csoportba. Egység Negatív < 20 Mérsékelten pozitív Erősen pozitív A pozitív eredmény arra utal, hogy a mintában Chromatin antitestek vannak, és felveti gyógyszer-indukálta lupus (DIL) vagy a szisztémás lupus erythematosus (SLE) lehetőségét. 2. A negatív eredmény arra utal, hogy a betegnek nincs Chromatin antitestje, vagy annak koncentrációja a teszt negatív küszöbe alatt van. 3. Javasoljuk, hogy a laboratórium által kiadott értékelés tartalmazza az alábbi meállapítást: Az itt következő eredmény az INOVA QUANTA Lite TM Chromatin ELISA használatával keletkezett. Más gyártók tesztjével kapott anti-chromatin értékek ettől eltérőek lehetnek, váltakozva nem használhatók. A közölt IgG érték nagyságrendje nem vethető össze egy végpont-titer értékkel. A módszer korlátai 1. Immunkomplexek és más immunglobulin aggregátumok jelenléte a mintában a nemspecifikus kötődés mértékét növelheti, és a teszt téves pozitivitását okozhatja. 2. Nem minden gyógyszer-indukálta lupus (DIL) vagy szisztémás lupus erythematosus (SLE) beteg lesz pozitív chromatin antitestre. 3. A teszt eredményeit minden esetben a klinikai adatokkal és más szerológiai vizsgálatok eredményével együtt kell értékelni. 4. A teszt működési jellemzői a szérumtól eltérő anyagok vizsgálatára nincsenek kidolgozva. Várható értékek Referencia tartomány Kétszáztíz mintát vizsgáltak egészséges önkéntesektől. A vizsgált normál populáció közelítőleg 68%-a nő volt, az átlagos életkoruk 38 év. Az életkori megoszlás év között volt.ezen felül vizsgálatk 29 kardiológiai beteget, akik nem szedtek procainamidot, és nem és kor szerint megfelelő kontrollként szerepeltek azon betegek vizsgálatához, akik procainamid kezelést kaptak. A vizsgált 210 mintából 208 negatív volt QUANTA Lite TM Chromatin ELISA teszttel, vagyis a teszt specificitása 99 %-os. A két pozitív minta aktivitása 24 és 22 egységnyi volt. A pozitivitás küszöbértéke (cutoff) < 20 egység. A normálpanel 90 %-ában 10 egység, vagy annál kevesebb aktivitást mértek. Valamennyi kardiológiai beteg negatív volt. Relatív szenzitivitás és specificitás Összehasonlítás a hiszton-elisa-val A hiszton-elisa kitben denaturált individuális hisztonok (azaz H1, H2A, H2B, H3 és H4) vannak az ELISA lemezhez rögzítve. A Chromatin ELISA kitben H1-fosztott chromatin (vagyis a natív (H2A- H2B-H3-H4) 2 hiszton octamer 145 bázispár DNS-sel borítva) van az ELISA lemezhez kötve. A hiszton és chromatin ELISA részletes összehasonlítása megtalálható a 11. számú irodalomban. 5

6 Röviden, a két antigénnek van néhány fontos közös epitopja. Különösen, a tripszin-szenzitív végei a hisztonoknak, amelyek mind a kétféle antigénben exponálva vannak, reaktívak a DIL és SLE betegek mintáival egyaránt. Azok az epitopok azonban, amelyek a natív H2A-H2B dimer vagy a (H2A-H2B)-DNA komplex alkotórészei, jelen vannak a chromatinban, de nincsenek a denaturált hisztonban. Az SLE és DIL páciensek antitestjei egyaránt felismerik ezeket az epitopokat. Ezzel szemben, néhány olyan epitop, ami hozzáférhető a denaturált hisztonon, rejtve van a chromatinban. Ezek az epitopok felismerésre kerülnek olyan betegek antitestjei által, akik procainamid kezelést kapnak, de nincsenek klinikailag gyógyszer-indukált lupusos tüneteik, emiatt a hiszton ELISA használata bonyolultabb a DIL diagnosztikában, mint a chromatin ELISA használata. A DNS jelenléte a chromatinban azzal a következménnyel jár, hogy az SLE betegek szérumában lévő antitestek könnyebben felismerik a chromatint, mint a hisztonokat. Mivel azonban az anti-dna antitestek ritkán fordulnak elő más betegségben, mint SLE-ben, a chromatin használata gyakorlatilag nem vezet anti-dna antitest okozta téves pozitív reakciókhoz. Amint az alábbi két táblázatban is látható, a Chromatin ELISA érzékenyebb és specifikusabb mint a Histone ELISA a procainamidot szedő beteg közül a tünetmentesek és a tünetekkel rendelkezők elkülönítésében. A lupus-szerű tüneteket mutató 26 betegből a Chromatin ELISA 20 esetben volt pozitív, míg a Histone ELISA csak 19 pozitív eredményt adott. Ezek között a minták között számos olyan volt, amelyiknek a rektivitása nagyobb volt a Chromatin ELISA-val, mint a Histone ELISA-val. Azok között a betegek között, akik procainamidot szedtek, de nem voltak lupus-szerű tüneteik, a 67- ből csak 17 lett pozitív a Chromatin ELISA tesztben, és csak 4 volt erősen reagáló pozitív. Ezzel szemben 34 volt pozitív a Histone ELISA tesztben, és közülük 21erősen reagált. Így tehát, az antichromatin antitestek jobban megfelelnek a tünettel járó betegség differenciálására a tünetmentes reakciótól, mint az anti-hiszton antitestek. 9,10,13 A procainamidot szedő, tüneteket mutató betegek (n=26) összehasonlító vizsgálata INOVA Chromatin ELISA és INOVA Histone ELISA tesztekkel. Betegek n=26 Histone ELISA Chromatin ELISA Negatív Mérsékelt Erős poz. Negatív Mérsékelt Erős poz A procainamidot szedő, tünetmentes betegek összehasonlító vizsgálata INOVA Chromatin ELISA és INOVA Histone ELISA tesztekkel. Tünetmentes páciensek n=67 Chromatin ELISA Negatív Mérsékelt Erős poz. Histone ELISA Negatív Mérsékelt Erős poz A Chromatin ELISA az SLE betegek detektálása szempontjából is érzékenyebb, mint a Histone ELISA. Nagyobb százalék volt pozitív a Chromatin ELISA teszttel, és közülük többen erősebb reaktivitást mutattak. Ezek az eredmények a megjelent közlemények alapján előre várhatók voltak. 6,7,8 Az adatokat az alábbi táblázatban foglaltuk össze : SLE betegek összehasonlító vizsgálata INOVA Chromatin ELISA és INOVA Histon ELISA teszttel SLE n=45 Histone ELISA Chromatin ELISA Negatív Mérsékelt Erős poz. Negatív Mérsékelt Erős poz A fenti táblázatokban szereplő adatok és a normál panel, valamint a kardiológiai betegek eredményeinek kombinációja segítségével meghatározásra került a Chromatin ELISA relatív szenzitivitása és specificitása a Histone ELISA-hoz viszonyítva. Összes minta Histone ELISA Chromatin ELISA Negatív Pozitív Negatív Pozitív 28* 67 Relatív szenzitivitás = 70%. Relatív specificitás = 98%. *A 28 mintából, amelyik a Histone ELISA vizsgálatban pozitív, de negatív a Chromatin ELISA-val, 18 tünetmentes procainamid szedő, 8 egészséges önkéntes, és 1 kardiológiai kontroll minta volt. 6

7 Klinikai szenzitivitás és specificitás Chromatin Pozitív Betegcsoport Összes minta # % Egészséges önkéntesek % Tünetekkel járó Procainamid-indukált lupus % Tünetmentes procainamid szedő páciens % Életkor és nem szerint válogatott kardiológiai kontroll % SLE % A fenti tanulmány alapján a Chromatin ELISA klinikai szenzitivitása DIL és SLE esetében 72% a klinikai specifikussága pedig 94%. Ezek a számok az irodalmi adatokkal megegyeznek. 11 Precizitás és reprodukálhatóság Sorozaton belül (Within-Run) Öt mintát teszteltek, mindegyiket tizennyolcszor, ugyanazon az ELISA lemezen. 1. minta 2. minta 3. minta 4. minta 5. minta Átlag 61E 49 E 91 E 75 E 133 E SD 2.9 E 2.7 E 4.1 E 5.2 E 5.1 E CV 4.8% 5.6% 4.5% 7.0% 3.9% A chromatin ELISA küszöb értékének közelében is meghatározták a sorozaton belüli precizitást, 5 mintának mintánként 14-szer végzett ismételt mérésével, egy ELISA lemezen. 1. minta 2. minta 3. minta 4. minta 5. minta Átlag 22 E 26 E 30 E 22 E 21 E SD 0.9 E 1.4 E 1.4 E 0.9 E 0.9 E CV 4.3% 5.3% 4.5% 3.9% 4.4% Sorozatok között (Between-Run) Öt pozitív minta analízise történt naponta egyszer, 5 különböző napon. 1. minta 2. minta 3. minta 4. minta 5. minta Átlag 67 E 57 E 110 E 84 E 167 E SD 4.3 E 4.1 E 8.6 E 4.7 E 10.2 E CV 6.4% 7.1% 7.8% 5.6% 6.1% 7

8 Hivatkozások 1. Lachman PJ: An attempt to characterize the lupus erythematosus cell antigen. Immunology 4: , Robitaille P, et al.: Relationship between deoxyribonucleo-protein and deoxyribonucleic acid antibodies in systemic lupus erythematosus. J Clin Invest 52: , Fritzler MJ and Tan EM: Antibodies to histones in drug-induced and idiopathic lupus. J Clin Invest 62: , Halbert SP, et al.: Studies on autoantibodies to deoxyribonucleic acid and deoxyribonucleoprotein with enzyme immunoassay (ELISA). J Lab Clin Med 97: , Burlingame RW and Rubin RL: Subnucleosome structures as substrates in enzyme-linked immunosorbent assays. J Immunol Methods 134: , Karsh J, et al.: Anti-DNA, anti-deoxyribonucleoprotein and rheumatoid factor in patients with systemic lupus erythematosus, Sjogren s syndrome and rheumatoid arthritis. Int Arch Allergy Appl Immunol 68: 60-69, Burlingame RW, et al.: The central role of chromatin in the autoimmune responses to histones and DNA in systemic lupus erythematosus. J Clin Invest 94: , Chabre H, et al.: Presence of nucleosome-restricted antibodies in patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum 38: , Burlingame RW and Rubin RL: Drug-induced anti-histone autoantibodies display two patterns of reactivity with substructures of chromatin. J Clin Invest 88: , Rubin RL, et al.: Autoantibodies associated with lupus induced by diverse drugs target a similar epitope in the (H2A-H2B)-DNA complex. J Clin Invest 90: , Burlingame RW: The clinical utility of antihistone antibodies: Autoantibodies reactive with chromatin in systemic lupus erythematosus and drug-induced lupus. Clin Lab Med 17: , Rubin RL: Autoantibody specificity in drug-induced lupus and neutrophil-mediated metabolism of lupus-inducing drugs. Clin Biochem 25: , Rubin RL, et al.: IgG but not other classes of anti[(h2a-h2)-dna] is an early sign of procainamideinduced lupus. J Immunol 154: , Tan EM, et al.: The 1982 Revised Criteria for the Classification of Systemic Lupus Erythematosus. Arthritis Rheum 25: , Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of Health, 1999, Fourth Edition, (HHS Pub. # (CDC) ). A terméket előállítja: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Forgalmazásra jogosult az EU területén: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service HUN May 2007 Revision HUN0 8