A PEROXISZÓMÁK BIOKÉMIÁJA

Átírás

1 Az itt következő anyag röviden és vázlatszerűen összefoglalja mindazt, amit a peroxiszómák biokémiájáról tudni lehet. Az első féléves konzultáció anyaga ebből az első négy fejezet. Ezen belül az 1. és 2. fejezet nagybetűs (12-es méret) része tananyag, a többi nem visszakérdezendő segédanyag. A peroxiszómális funkciók transzkripciós szintű szabályozása (5. fejezet) a II. félévben kerül sorra. A téma iránt fokozottabban érdeklődők számára a pdf formátumban elérhető review-kat és fontosabb cikkeket hiperlink formájában mellékeltem; az eredeti közlemények elérhetők a szövegben található csillagokra (*), az egyes ábrákra, illetve az irodalomjegyzék aláhúzással megjelölt közleményei első szerzőjének nevére kattintva. Kérem a felhasználókat, hogy a konzultációs anyaggal kapcsolatos észrevételeiket, megjegyzéseiket, kiegészítéseiket juttassák el a szerzőhöz (obinario@albarid.net). Budapest,

2 A PEROXISZÓMÁK BIOKÉMIÁJA Tartalom 1. Fogalmak és általános jellemzők 2. Fontosabb metabolikus reakcióutak 2.1. Peroxiszómális oxidáció és légzés 2.2. Zsírsav β-oxidáció A zsírsavak aktiválódása Zsírsavak transzportja a mátrixba A peroxiszómális β-oxidáció enzimei A végtermékek transzportja kifelé 2.3. A peroxiszómális α-oxidáció 2.4. Koleszterin és dolichol metabolizmus 2.5. Purin metabolizmus 2.6. Epesav szintézis 2.7. Éter lipidek szintézise 2.8. Aminosavak katabolizmusa 3. Peroxiszóma biogenezis 4. Peroxiszómális eredetű kórképek 5. A peroxiszómális metabolizmus szabályozása a peroxiszóma proliferációt aktiváló receptorok (PPAR) 5.1. A PPAR-ok szerepe különböző kórképekben 5.2. Karcinogenezis 6. Irodalom Bánhegyi Gábor,

3 A peroxiszómák fénymikroszkóppal nem felismerhető vezikulák, melyek a legtöbb állati és növényi sejt citoplazmájában megtalálhatók. Felfedezésük ezért nem morfológiai irányból, hanem biokémiai megközelítéssel történt. De Duve belga biokémikus (*) azt találta, hogy PEROXISZÓMÁK EMBERI MÁJBAN bizonyos enzimaktivitások latenciát mutatnak (vagyis az aktivitást a membránok integritásának megbontása növeli), mely a preparátum öregedésével csökken. Ezek a látens enzimek látszólag a mitokondriális frakcióban jelentek meg. Az általa továbbfejlesztett frakcionálási módszer a mitokondriális frakciót nehéz és könnyű mitokondriális szubfrakcióra választotta szét. Az utóbbi két addig ismeretlen organellumot, a lizoszómát és a peroxiszómát tartalmazta. A peroxiszóma nevét a rá jellemző marker enzimekről kapta, melyek hidrogén peroxidot termelnek vagy bontanak. A peroxiszómák létét később morfológiai módszerekkel (elektronmikroszóp, immunhisztokémia) is kimutatták. Ez volt az első eset, amikor egy organellumot biokémiai módszerek alkalmazásával fedeztek fel. De Duve kutatásait 1974-ben orvosi Nobel-díjjal értékelték. 1. FOGALMAK ÉS ÁLTALÁNOS JELLEMZŐK Nomenklatúra: peroxiszóma = mikroperoxiszóma (csak méretkülönbség) = glioxiszóma (növényi peroxiszóma, mely tartalmazza a glioxilát ciklus enzimeit) = microbody (élesztő, más gombák, protozoák peroxiszómája; tápanyagforrástól függő enzimkészlet) = glikoszóma (Trypanosoma; glikolízis enzimeit is tartalmazza) Emlős (máj, vese) peroxiszómák jellemzői: Egy membránnal határolt vezikulák. Belsejükben granuláris mátrix található, gyakran kristályos magot is tartalmaznak (urát oxidáz; humán peroxiszómákban hiányzik). Alakjuk kerek vagy ovális, átmérőjük µm. A máj parenhimális sejt térfogatának 2-3%-a (nem indukált állapotban), a peroxiszómális fehérje 1-1,5%-a a teljes májfehérjének, kb db peroxiszóma található egy átlagos májsejtben. Az organellum fajsúlya 1,21-1,25 g/cm 3. 3

4 2. FONTOSABB METABOLIKUS REAKCIÓUTAK A peroxiszómában zajló reakciók között vannak olyanok, melyek csak erre az organellumra jellemzőek: ilyen az éter lipidek szintézise, a nagyon hosszú szénláncú zsírsavak oxidációja és a zsírsavak α-oxidációja. A peroxiszóma biogenezis zavarai e reakcióutak kiesése miatt halálos kimenetelűek. Mennyiségileg igen jelentős a peroxiszóma hozzájárulása a zsírsavak β-oxidációjához, a koleszterol, dolichol és epesav szintézishez. Az indukáltsági állapottól függően a zsírsav β- oxidáció akár 50%-áért is felelős lehet a peroxiszóma. Peroxiszóma-specifikus a különböző oxidázok és a kataláz működéséhez kötött elektrontranszfer, mely oxigénfogyasztása a májénak 20%-át is elérheti. A többi peroxiszómális enzim vagy megtalálható más kompartimentumokban is, vagy olyan reakcióutakat katalizálnak, melyeknek van alternatívája, így működésük nem életfontosságú. A peroxiszómális betegségek fatális kimenetele egyértelműen bizonyítja az organellum vitális jelentőségét. Felmerül azonban a kérdés, hogy mi az evolúciós előnye a peroxiszómális funkciók külön organellumba való szerveződésének. A konvencionális válasz a kérdésre az, hogy a sejt ilymódon tudja a hidrogén peroxidot termelő, potenciálisan veszélyes reakciókat elkülöníteni a citoplazmától. Azonban a legtöbb ilyen reakciónak megtalálható a hidrogén peroxid képződéssel nem járó alternatívája is (pl. acil-koa oxidáz vs acil-koa dehidrogenáz, xantin oxidáz vs xantin dehidrogenáz stb.), az oxidázok működése tehát nem életfontosságú. A peroxiszómális betegségek tüneteinek nagy részéért az éter lipidek szintézisének kiesése felelős, ahol hidrogén peroxid egyáltalán nem képződik. A peroxiszómális oxidázok működésének lényege, hogy a redukáló ekvivalensek energiatárolás (ATP szintézis) nélkül használódnak fel. A peroxiszómák működtetésével a sejt tehát védekezni tud a tápanyagbőség (reduktív stressz) ellen. (Ez jól látható a PPAR-ok hatásmechanizmusánál, 5. fejezet.) A kompartimentáció lehetőséget nyújt arra, hogy a metabolitok energiatárolással, illetve energia konzerválás nélkül történő lebontása közötti arányt a peroxiszómális membrántranszport szabályozásával változtatni lehessen. Ezt alátámasztja a peroxiszómális transzporterek génjeiben bekövetkező mutációk súlyos következménye (lásd ). Ez a gondolatmenet abban az esetben is helytálló lehet, ha a peroxiszómák valóban az eukarióta sejt endoszimbiontái (lásd 3.). 4

5 2.1. Peroxiszómális oxidáció és légzés Minden peroxiszóma tartalmaz (legalább egyféle) flavin oxidázt és katalázt. A peroxiszómális légzést tehát különböző szubsztrátok oxidációja és a keletkező hidrogén peroxid kataláz általi lebontása képezi. Ezek a reakciók a máj oxigénfogyasztásának kb. 20 százalékáért felelősek! A legfontosabb oxidázok: D-aminosav oxidáz, L-α-hidroxisav oxidázok, acil-koa oxidáz, glutaril- KoA oxidáz, poliamin oxidáz, oxalát oxidáz. A kataláz a keletkező hidrogén peroxidot diszproporcionálódás révén vagy peroxidációval bonthatja. Az utóbbi reakciótípus esetén etanol, metanol, nitritek lehetnek az elektrondonorok (l. 1. ábra; YH 2 ). A peroxiszómális légzéshez sem szubsztrát szintű, sem oxidatív foszforiláció nem kapcsolódik, az elektrontranszfer során felszabaduló energia nem konzerválódik, teljes egészében hővé alakul. 2 H 2 O O 2 v. Y XH 2 FAD H 2 O 2 H 2 O 2 v. YH 2 X FADH 2 O 2 1. ábra A peroxiszómális elektrontranszfer 2.2. Zsírsav β-oxidáció A peroxiszómális zsírsavoxidáció a legkülönbözőbb zsírsavak metabolizálására képes. Kiemelkedő szerepe van a nagyon hosszú szénláncú ( 22) telített és telítetlen, valamint az elágazó szénláncú zsírsavak oxidációjában. Ezenkívül résztvesz a dikarbonsavak, a prosztaglandinok, tromboxánok, leukotriének és az acil oldallánccal rendelkező xenobiotikumok metabolizmusában. Alkalmas továbbá mindazon zsírsavak lebontására is, melyek a mitokondriális β-oxidáció szubsztrátjai is lehetnek. 5

6 A zsírsavak aktiválódása Hosszú szénláncú zsírsavak aktiválódása: acil-koa szintetáz - a peroxiszóma, az endoplazmás retikulum és a mitokondrium külső membrán citoszól felőli felszínén Nagyon hosszú (24-26) szénláncú zsírsavak aktiválódása: specifikus acil-koa szintáz (VLCFA-KoA szintáz; Very Long Chain Fatty Acyl-CoA synthase) csak a peroxiszóma külső felszínén Zsírsavak transzportja a peroxiszómális mátrixba Részleteiben nem teljesen ismert, de karnitin feltehetőleg nem szükséges hozzá. A különböző zsíracil-koa-k peroxiszómális transzportjáért a membrán ABC hemitranszportereit tartják felelősnek (*). Az ABC (ATP binding cassette) transzporterek ATP-függő aktív transzportot mediálnak a plazmamembránban (l. régi tankönyv 362. o., új tankönyv biotranszformációs fejezet). Ligandjaik közé tartoznak citosztatikumok (drog rezisztencia jelensége), illetve endogén molekulák (bilirubin glukuronid, glutationnal konjugált vegyületek stb.). A peroxiszóma membrán az ABC hemitranszporterek különböző tagjait tartalmazza. Ezek a fehérjék ATP-kötő doménnel és hat transzmembrán régióval rendelkeznek (szemben a "normál" ABC transzporterekkel, melyek 12 transzmembrán szakaszt tartalmaznak: ezért hemitranszporter) és általában membránon keresztüli aktív transzportot katalizálnak. A transzporterek homo- és heterodimerizációra képesek, ami elméletileg többféle funkciót tehet lehetővé. A család alábbi tagjait azonosították eddig: ALDP (adrenoleukodisztrófia protein): a gén mutációja a nagyon hosszú szénláncú zsírsavak emelkedett szintjét és csökkent VLCFA-KoA szintáz aktivitást okoz. Feltételezték, hogy a zsírsav transzport zavara állhat a betegség hátterében. Újabb eredmények szerint a transzport normális, a fehérje talán inkább a szintázt stabilizálja/aktiválja. ALDR, PMP70, PMP70R: az ALDP részleges homológjai, ismeretlen funkcióval A peroxiszómális β-oxidáció enzimei A folyamat a 2. ábrán látható. Acil-KoA oxidáz: FAD prosztetikus csoporttal működik, mint a mitokondriális acil-koa dehidrogenáz, de a FADH 2 reoxidációja molekuláris oxigénnel történik hidrogén peroxid képződésével. Humán májban legalább háromféle enzim van: egy az elágazás nélküli, egy az elágazó szénláncú zsíracil-koa-k részére, s egy prisztanoil-koa oxidáz. A további lépéseket multifunkcionális enzimek katalizálják: enoil-koa hidratáz és hidroxiacil- KoA dehidrogenáz aktivitás mellett hidroxiacil-koa epimeráz, vagy 3-cisz- 2-transz-enoil- 6

7 KoA izomeráz aktivitás is jelen lehet. Az enzim szekvenciája nagyfokú hasonlóságot mutat a megfelelő mitokondriális enzimekkel, a gén feltehetőleg génfúzióval jöhetett létre. Tioláz (oxoacil-koa tioláz): két izoenzim létezik, ezek 2. ábra különböznek a mitokondriális illetve citoszól tiolázoktól. Kisegítő enzimek a telítetlen zsírsavak oxidációjához: 2,4-dienoil-KoA reduktáz, 3-cisz- 2-transz-enoil- KoA izomeráz, D-3-hidroxiacil-KoA dehidratáz (3. ábra). 3. ábra A végtermékek transzportja kifelé A peroxiszómális zsírsavoxdáció 8 szénatomnál rövidebb zsírsavakkal csak nagyon lassan működik, tehát a reakciósorozat jellemző végtermékei az oktanoil-koa és az acetil-koa. A peroxiszóma két karnitin aciltranszferázt tartalmaz a mátrixban, melyek az oktanoil-koa-ra és az acetil-koa-ra specifikusak. Acil-KoA hidroláz nincs a peroxiszómában. A végtermékek a mitokondriumban oxidálódnak tovább, illetve az acetil egységek bioszintetikus reakciókban is felhasználódhatnak. 7

8 A peroxiszómális-mitokondriális és a tisztán mitokondriális β-oxidáció energiamérlegének összehasonlítása: P: palmitoil-koa + 4 O KoA + 4 NAD + = oktanoil-koa + 4 H 2 O acetil-koa + 4 NADH M: palmitoil-koa + 4 FAD + 4 KoA + 4 NAD + = oktanoil-koa + 4 FADH acetil-koa + 4 NADH A további lépések mindkét esetben a mitokondriumban történnek. A peroxiszómában keletkezett NADH az elektronjait a már ismert mechanizmusokkal (pl. malát-aszpartát inga; *) tudja a citoszólba, majd a mitokondriumba juttatni. Tehát csak az első lépésben felszabaduló energia vész el négy cikluson keresztül, ami 4x2=8 ATP veszteséget jelent. A palmitát mitokondriális oxidációja 129 ATP generálását jelenti, tehát a peroxiszómálisan kezdődő folyamat kb.6% energiaveszteséggel jár A peroxiszómális α-oxidáció A normál táplálkozás során 3-metil csoportot tartalmazó elágazó szénláncú zsírsavak (pl. fitánsav) kerülnek a szervezetbe. Ezek a vegyületek nem tudnak lebomlani a β-oxidáció folyamatában, mivel a metil csoport gátolja a hidroxiacil-koa dehidrogenáz által katalizált dehidrogenálást (mind a mitokondriális, mind a peroxiszómális β-oxidációban). A problémát az α-oxidáció reakciósorozata oldja meg. Az α-oxidáció első lépésében az elágazó szénláncú zsírsav aktiválódik, a reakciót az acil-koa szintetáz katalizálja. A második lépésben a zsírsav α helyzetben hidroxilálódik a fitanoil-koa hidroxiláz segítségével (4. ábra). Az enzim mutációja okozza a Refsum-kórt. A következő lépések vitatottak. Az egyik lehetőség a hidroxifitanoil-koa hasítása formil-koa-vá és prisztanállá (hosszú szénláncú aldehid). A reakciót egy liáz katalizálja (5. ábra). A másik reakcióúton a hidroxifitanoil-koa-t egy tioészteráz hasítja, majd a keletkező hidroxifitánsavat egy α-hidroxisav oxidáz ketofitánsavvá oxidálja. A ketofitánsav végül szintén prisztanállá dekarboxilálódik (6. ábra). A reakcióút végén a prisztanált az aldehid dehidrogenáz prisztánsavvá oxidálja és az beléphet a normál β-oxidáció folyamatába (7. ábra). 8

9 4. ábra 5. ábra 6. ábra 7. ábra 9

10 2.4. Koleszterin és dolichol metabolizmus A koleszterin szintézist korábban a citoszólban és az endoplazmás retikulumban lokalizálódó enzimek által katalizált folyamatnak tartották. Újabb eredmények szerint a reakcióút legtöbb enzime (a 8. ábrán kékkel jelölve) megtalálható a peroxiszómákban is. A peroxiszóma biogenezis különböző zavarai esetén a koleszterin bioszintézis is súlyosan érintett. A dolichol bioszintézis lépései az endoplazmás retikulumon kívül a peroxiszómában is jelen vannak. 8. ábra 9. ábra 2.5. Purin metabolizmus A purinok katabolizmusának közös intermedierje a xantin. A xantin további átalakulása különbözik az egyes fajokban: a főemlősök, madarak, hüllők és rovarok hugysavvá, míg más fajok allantoinná bontják (9. ábra). A xantin metabolizáló enzimek általában a peroxiszómában találhatók. Az emberi xantin dehidrogenáz/oxidáz peroxiszómális lokalizációját azonban eddig nem mutatták ki. (A purin katabolizmus következő enzime, a mindig peroxiszómális urát oxidáz a főemlősökben hiányzik. Mivel a hugysav hatékony antioxidáns, az enzimaktivitás elvesztése és a főemlősök hosszabb élettartama között összefüggést gyanítanak.) 10

11 2.6. Epesav szintézis Az epesavak szintézise koleszterinből egyike a legtöbb kompartimentumot érintő reakcióutaknak. Az egyes lépések a citoszólban, a mitokondriumban, az endoplazmás retikulumban és a peroxiszómában zajlanak. A peroxiszómális lépések trihidroxi- és 10. ábra dihidroxikolesztánsavból indulnak ki, az oldallánc β-oxidációját és a konjugációs reakciókat foglalják magukba. A β-oxidáció a szokásos lépésekben történik az elágazó szénláncú acil-koa oxidáz, egy multifunkcionális enzim (enoil-koa hidratáz + hidroxiacil-koa dehidrogenáz aktivitás) és tioláz (SCPX; sterol carrier protein X) közreműködésével. A keletkező kolil- és kenodeoxikolil-koa-t az epesav- KoA:aminosav N-aciltranszferáz konjugálja glicinnel vagy taurinnal (10. ábra). 11

12 2.7. Éter lipidek szintézise 11. ábra A reakcióút mindhárom enzime kimutatható a peroxiszómában mint integráns membránfehérje. Az első két enzim (dihidroxiacetonfoszfát aciltranszferáz és alkildihidroxiacetonfoszfát szintáz) aktív centruma intraluminális (latencia, rezisztencia proteolízissel szemben), míg a harmadiké (alkildihidroxiacetonfoszfát reduktáz) a citoszól felé irányul. A további lépések már az endoplazmás retikulumban zajlanak (11. ábra). A peroxiszóma jelentőségét az éter lipidek szintézisében igazolja a Zellweger szindrómában (l. később) tapasztalható súlyos éter lipid deficiencia és a betegek fibroblasztjaiban a plazmalogén bioszintézis teljes hiánya (*). 12

13 2.8. Aminosav katabolizmus Lizin Emberben a lizin metabolizmusnak két fő útja van. A köztitermék α-aminoadipát a fontosabb útvonalon szaharopinon, míg a kisegítő reakcióúton pipekoláton keresztül képződik. A kulcsenzimek (α-aminoadipát szemialdehid szintáz, illetve pipekolát oxidáz) peroxiszómálisak. A pipekolát oxidáz defektusa pipekolát acidémiát okoz. 12. ábra D-aminosav oxidáz Az enzim szerepe nem ismert, a katalizált reakció az alábbi (oxidatív dezaminálás): 13. ábra 14. ábra Alanin:glioxilát aminotranszferáz Emberben peroxiszómális enzim, a glioxilsav szerinné alakulását katalizálja. Hiányában a glioxilsav oxaláttá bomlik és hiperoxálsavúria (I. típus) vagy oxalózis alakul ki. 13

14 3. PEROXISZÓMA BIOGENEZIS A peroxiszómák sajátos organellumok, mivel osztódásra képesek és mátrix fehérjéiket másodlagosan, import mechanizmusok révén szerzik be. E mitokondriumokra emlékeztető sajátosságok alapján felmerült annak lehetősége is, hogy a peroxiszómák az eukarióta sejt szimbiontái, melyeknek az evolúció során elveszett (vagy a sejtmagba került) a saját genetikai kódja. A peroxiszómák száma és mérete ugyanazon a sejten belül is időben igen változatos lehet. Mivel membránok de novo nem szintetizálódnak, a peroxiszóma biogenezisre két elméleti lehetőség van. Az új peroxiszómák a már meglevő peroxiszómák növekedésével és osztódásával keletkezhetnek (15. ábra II), vagy más vezikuláris organellumokból (pl. az endoplazmás retikulumból) fűződhetnek le (15. ábra I). Mindkét hipotézist kísérleti eredmények is alátámasztják. Az endoplazmás retikulum eredet mellett szól az, hogy a peroxiszómák topológiailag az endoplazmás retikulum szomszédságában helyezkedhetnek el, a fehérjeszekréció zavarai érinthetik a peroxiszóma biogenezist is, számos peroxiszómális fehérje N- vagy O-glikozilált, valamint néhány peroxin (a peroxiszóma biogenezishez elengedhetetlenül szükséges fehérjék, részletesen lásd később) mutációja vagy overexpressziója peroxiszómális fehérjék endoplazmás retikulumon belüli retencióját okozza. Ezen eredmények alapján egyes szerzők a peroxiszóma biogenezis első fázisának (a membrán és membránfehérjék kialakulásának) a normál vezikuláris transzporttal való kapcsolatát, s így endoplazmás retikulum eredetét valószínűsítették (*). A fenti hipotézis ellen szól, hogy a vezikuláris transzport ismert gátlószerei nem befolyásolják a peroxiszóma biogenezist A peroxiszóma érési folyamata: 1. preperoxiszóma: kisméretű vezikulumok, melyek csak néhány membránfehérjét tartalmaznak, a mátrix enzimfehérjéi még nincsenek jelen. 2. Éretlen peroxiszóma: a mátrixfehérjék importjához szükséges membránfehérjéket mind tartalmazza. 3. A mátrix enzimfehérjéinek szintézise szabad riboszómákon. 4. A mátrix enzimfehérjéinek importja. Kialakul az érett peroxiszóma. 5. A peroxiszóma növekedése (további fehérjeimport + membránszintézis). 6. A peroxiszóma osztódása. 14

15 I II 15. ábra. A peroxiszóma biogenezis (I) endoplazmás retikulum eredetű és (II) attól független modellje Peroxinok (Pex): peroxiszómális fehérjék, melyek a peroxiszómális membrán kialakulásához, valamint a peroxiszómális (mátrix és membrán) fehérjék importjához szükségesek. Mutációjuk esetén a peroxiszómák eltűnnek, vagy nem tartalmazzák a mátrix fehérjéit (peroxiszóma "kísértet"). A membrán kialakulásához szükséges peroxinok: Pex19 (farnezilált fehérje, kívülről kapcsolódik a peroxiszóma membránhoz), Pex16, Pex3 (integráns membránfehérjék): hiányukban nem jön létre peroxiszóma, a megfelelő gének transzfektálásával a defektus kiküszöbölhető. Feltételezhető szerepük a további membránfehérjék importja a preperoxiszóma membránjába. A mátrixfehérjék importjához szükséges peroxinok: Pex5 (két izoforma), Pex7: a citoszólban felismerik a peroxiszómába irányító fehérjeszekvenciákat (PTS1 és PTS2). Pex14: integráns peroxiszómális membránfehérje, megköti s a mátrixba traszportálja a Pex5p és Pex7 által szállított fehérjéket. Pex2, Pex10, Pex12, Pex13, Pex17: feltehetőleg szintén a fehérje transzlokációban résztvevő peroxiszómális membránfehérjék. Egyéb funkciójú peroxinok: Pex1: membrán fúzióhoz szükséges Pex11: peroxiszóma proliferációban vesz részt Nem peroxinok, de szükségesek a folyamathoz: Chaperonok (pl. Hsp70): a Pex5, Pex7 és az általuk kötött fehérjék közötti kölcsönhatáshoz szükségesek. A peroxiszóma mátrixban még nincs bizonyíték chaperonok működésére 15

16 . 16. ábra A peroxiszóma biogenezisben résztvevő peroxinok A protein import mechanizmusa A peroxiszómális mátrix fehérjéit a sejtmagban található gének kódolják, szintézisük a citoplazmában szabad riboszómákon történik és a transzláció befejeződése után importálódnak a peroxiszóma mátrixba. Az irányítást ebben az esetben is szignál szekvenciák végzik, melyekből eddig kétfélét írtak le. A peroxisomal targeting signal 1 (PTS1) C-terminális SKL (Ser-Lys-Leu-COOH, egy-egy aminosav eltérés megengedett) tripeptid, mely a mátrix fehérjék nagyobb részének importját irányítja. A PTS2 N-terminális nonapeptid (Arg/Lys)-(Leu/Val/Ile)-X(5)- (His/Glu)-(Leu/Ala). Öt mátrix fehérje tartalmazza ezt a szignált: tioláz, fitanoil-koa hidroxiláz, dihidroxiacetonfoszfát szintáz, malát szintáz (glioxiszóma), mevalonát kináz. A membrán fehérjék esetében is leírtak már néhány targeting szekvenciát, ezeknek a felépítése jóval bonyolultabb (lásd 17. ábra). 16

17 17. ábra Az import lépései: a) Receptor-ligand kötés. A PEX5 fehérje felismeri és köti a PTS-1 szekvenciát, míg a PEX7 a PTS-2-t. A receptorligand kapcsolódás a citoplazmában történik, feltehetőleg chaperonok közreműködésével. b) Transzport a peroxiszómához. Mechanizmusa ismeretlen. c) Kötődés a peroxiszómához. Mind a PEX5, mind a PEX7 képes kötődni a membránban található PEX14-hez, mely a dokkolásban résztvevő fehérjekomplex obligát tagja. Más peroxinok (PEX13, PEX17) szintén tagjai a komplexnek. d) Disszociáció és transzlokáció. A peroxiszóma membrán integráns fehérjéi (PEX10, PEX12, PEX2, PEX8) vesznek részt a folyamatban, melyek mind a receptor fehérjékkel, mind a dokkoló apparátus tagjaival képesek kölcsönhatásba lépni. A transzlokáció pontos mechanizmusa nem ismert, de ATP-függő. e) Receptor újrafelhasználás. A szabad PEX5 az import megtörténte után visszajut a citoplazmába. A folyamatban szerepet játszó peroxinok: PEX1, PEX6, PEX4, PEX22; mutációjuk a PEX5 újrafelhasználás károsodásához vezet. 18. ábra 17

18 Úgy tűnik, hogy a peroxiszómális mátrix fehérjék importja nem követi a mitokondriumban és az endoplazmás retikulumban megfigyelt mechanizmust, vagyis hogy chaperonok által nem-natív konformációban tartott fehérjék jutnak keresztül a membránon. A peroxiszóma esetében natív fehérjék, sőt a citoplazmában asszociálódott fehérje oligomerek transzportja is lehetséges. A jelenség pontos magyarázata nem ismert, felvetették pórusok, illetve lokálisan a transzport során képződő vezikulák szerepét. 4. PEROXISZÓMÁLIS EREDETŰ KÓRKÉPEK Az ide tartozó betegségeknek két alapvető csoportja van. 1. Valamelyik peroxiszómális enzimet kódoló gén mutációja. Általában viszonylag enyhe lefolyású kórképek. a) Refsum kór a fitanoil-koa hidroxiláz hiánya (l. tankönyv 138. o.) b) primer hiperoxalátúria (1. Típus) az alanin-glioxilsav aminotranszferáz hiánya c) X kromoszómához kötött adrenoleukodisztrófia az ALDP (peroxiszómális ABC hemitranszporter) defektusa d) Rizoméliás kondrodiszplázia II. és III. típus dihidroxiacetonfoszfát aciltranszferáz defektus e) A β-oxidáció zavarai acil-koa oxidáz, bifunkcionális fehérje vagy tioláz defektus 2. A peroxiszóma biogenezisben szereplő fehérjét kódoló gén mutációja. (PBD: peroxisome biogenesis disorder). A betegség többé-kevésbé valamennyi peroxiszómális funkciót érinti, gyakran letális kimenetelű. a) Zellweger csoport: három kórkép tartozik ide: a Zellweger (cerebro-hepato-renális) szindróma, a neonatális adrenoleukodisztrófia (NALD) és a csecsemőkori Refsum kór (IRD). A sorrend egyúttal a kórkép súlyossági sorrendje is; a Zellweger szindróma a legsúlyosabb közülük, a PEX5 mutációja okozza. Gyakorisága: 1: , autoszomális recesszív öröklődés. Oka a funkcióképes peroxiszómák teljes hiánya minden sejttípusban. Biokémiai zavarok: az éter foszfolipidek csökkent bioszintézise, plazmalogének hiánya minden szövetben; a nagyon hosszú szénláncú (>22) zsírsavak felhalmozódása; pipekolát és fitanát felhalmozódás; a tipikusan peroxiszómális enzimek a sejtek citoszóljában mutathatók ki. A klinikai tünetek már csecsemőkorban jelentkeznek: fejlődési visszamaradottság, az arc- és agykoponya deformitásai, szemtünetek, hepatomegália, veseciszták, izomtónus csökkenése. 18

19 b) Rhizomelic Chondrodysplasia Punctata (RCDP) A kórkép oka a PEX7 defektusa. Mivel ez a receptor csak néhány fehérje importjában vesz részt, csak az elágazó szénláncú zsírsavak lebontása és a plazmalogén bioszintézis károsodik. A klinikai tünetek: csontosodási zavarok (arckoponya, végtagok), a porcszövet korai elmeszesedése, szürkehályog, pszihomotoros zavarok. A betegek ritkán élik túl második életévüket. 5. A PEROXISZÓMÁLIS METABOLIZMUS SZABÁLYOZÁSA A PEROXISZÓMA PROLIFERÁCIÓT AKTIVÁLÓ RECEPTOROK (PPAR) A PPAR (peroxiszóma proliferátor aktivált receptor) fehérjék ligand által indukált transzkripciós faktorok, melyek a magi hormonreceptorok családjához tartoznak (a szteroid- és pajzsmirigyhormonok, retinoidok és D vitamin receptoraival együtt). Három izoformájuk van, emlősökben α, δ és γ. A PPARα elsősorban a májban expresszálódik, a PPARγ a zsírszövetben, míg a PPARδ ubiquiter (*). A PPAR-ok szerkezetének közös jellegzetessége a két cink-ujj-szerű struktúrát és egy α-helikális szakaszt tartalmazó DNS-kötő régió és a C-terminálisan elhelyezkedő ligand-kötő domén (19. ábra). 19. ábra A PPAR-ok fiziológiás ligandjai kezdetben ismeretlenek voltak, árva receptorokként írták le őket a mesterséges ligandok adása után jellegzetesen megjelenő peroxiszóma proliferációs hatás alapján. Azóta a mesterséges ligandokon (pl. klofibrát és más fibrátok, indometacin stb.; 20. ábra b) kívül számos természetes ligandjukat (linolsav, linolénsav, fitánsav, arahidonsav, eikozanoidok stb.; 20. ábra a) is leírták. 19

20 20. ábra (a) Természetes PPAR ligandok 20. ábra (b) Szintetikus PPAR ligandok A PPAR-ok működésének a dimerizáció alapfeltétele. Heterodimert tudnak képezni a 9-cisz-retinoid receptorral (RXR). A heterodimert alkotó bármelyik partner ligandja aktiválja a dimert, mely így a DNS PPAR reszponzív elemeihez kötődhet. (Konszenzus szekvencia: 5 -AACTAGGNCAAAGGTCA-3 ). A kötődés eredménye a target gének expessziójának fokozódása. 20

21 21. ábra PPARα által indukált fehérjék (a májban): a peroxiszómális zsírsavoxidáció teljes enzimkészlete; zsírsav transzportban és felvételben szerepet játszó fehérjék; a májsejt citoszóljának zsírsavkötő fehérjéje (FABP); a mitokondrális zsírsavoxidáció enzimei; a ketogenezis enzimei; a mikroszómális zsírsav ω-oxidációban szerepet játszó citokróm P450 izoenzimek (CYP4A család). PPARγ által indukált fehérjék (a zsírszövetben): lipoprotein lipáz, zsírsav transzlokáz, zsírsavkötő fehérje, foszfoenolpiruvát karboxikináz (a glukoneogenezis prekurzorokból történő glicerinszintézis sebességmeghatározó enzime). PPARδ által indukált fehérjék még nem ismertek. A PPAR-ok funkciója a zsírsavmetabolizmusban: Bármilyen állapot, mely hiperlipémiához vezet (zsírsavdús diéta, éhezés, stressz, diabetes) a PPAR-okat aktiválja. Az azonos ligandok a különböző szervekben a szervre jellemző PPAR-on keresztül különböző célgének expresszióját fokozzák. A májban a zsírsavfelvétel, trigliceridbe beépülés, β- és ω-oxidáció enzimei indukálódnak, míg a zsírszövetben a zsírlerakódás fokozódik. Minden PPAR által szabályozott reakció tehát a zsírsavszint csökkentése irányába hat. PPARα-hiányos egérben normál táplálkozás mellett anyagcserezavart nem lehet megfigyelni. Zsírdús diéta vagy éhezés (a fentieknek megfelelően) a máj elzsírosodását okozza. Éhezésben emellett még súlyos hipoglikémia és hipotermia is kifejlődik (a zsírsavoxidáció és a ketontest szintézis károsodása miatt). A PPARγ hiánya embrionális korban letális. A gén kísérletes "kikapcsolása" a születés körül a zsírszövet eltűnéséhez és zsírmáj kialakulásához vezet. 21

22 5.1. A PPAR-ok szerepe különböző kórképekben X szindróma (hiperlipémia + diabetes + ateroszklerózis + elhízás) A szintetikus PPARα (fibrátok) és PPARγ (tiazolidindionok; TZD) agonisták hatékonyak a szindróma egyes tüneteinek kezelésében. A TZD-ok (troglitazon, rosiglitazon, pioglitazon) hipoglikémiát kiváltó hatásuk alapján a II. típusú diabetes kezelésében használatosak. A glukóz homeosztázisra gyakorolt direkt hatásukat nem sikerült kimutatni; feltételezik hogy a zsírszövet zsírsavfelhasználásának fokozásával a vázizomban a zsírsavoxidációt csökkentik, ami másodlagosan fokozott glukózfelhasználással jár. A fibrátok (gemfibrozil, bezafibrát, fenofibrát) a máj zsírsavoxidációjának fokozása révén hatékony antihiperlipémiás szerek. A klinikai gyakorlatban a hiperlipémia által okozott szív- és érrendszeri betegségek prevenciójában használhatók. A PPAR-RXR heterodimer RXR ligandokkal is aktiválható. Az RXR ligandok tehát elméletileg szintén alkalmazhatók a diabetes terápiájában. Állatkísérletekben e molekulák valóban hipoglikémiát okoznak, a szénhidrát anyagcserére gyakorolt hatásuk azonban még nem tisztázott. Mind a PPARα, mind a PPARγ agonisták csökkentik az ateroszklerózis kifejlődését. A hipolipémián kívül a gyulladásgátló hatásnak lehet szerepe a folyamatban. A fibrátok és a TZD-ok gátolják a gyulladást mediáló citokinek (TNFα, interleukinok) termelését Karcinogenezis A fibrátok rágcsálókban hatékony hepatokarcinogének. A hatásban direkt DNS károsodás nem játszik szerepet (nemgenotoxikus karcinogén). A karcinogén effektus a PPARα-hoz kötött, PPARα deficiens egerekben a fibrátok hatástalanok. A karcinogenezis két hipotézise: 1. Oxidatív stressz hipotézis A fibrátok indukálják a peroxiszómális acil-koa oxidázt, urát oxidázt, a peroxiszómában megjelenik a normálisan endoplazmás retikulumhoz kötött gulonolakton oxidáz aktivitás is (*). A kataláz aktivitás kevésbé emelkedik. Következményképpen a hidrogén peroxid felhalmozódik, kidiffundál a peroxiszóma lumenéből és közvetlenül vagy más reaktív oxigén származékká (hidroxil gyök) alakulva károsítja a DNS-t. 2. Fokozott proliferáció, csökkent apoptózis A fibrátok PPARα dependens módon, részleteiben ismeretlen mechanizmussal befolyásolják a sejtciklus szabályozó fehérjéit, ami sejtproliferációban, a májtömeg növekedésében nyilvánul meg. Emellett gátolják az apoptózist mind normál, mind tumoros sejtekben. Ezek a hatás emberben, más főemlősökben és tengerimalacban teljesen hiányzik, így a fibrátok felhasználhatók a terápiában, éves kezelés után sem tapasztaltak hepatokarcinogenezist. A különbségre két magyarázat lehetséges. Egyrészt a PPARα expressziója jóval alacsonyabb az emberi, mint a rágcsáló májban (kb. 10%). Másrészt lehetséges, hogy a PPARα target génjei különböznek az egyes fajokban; a rágcsálókban olyan gén expressziója fokozódhat, mely hepatokarcinogént termelő fehérjét kódol. A PPARγ ligandok antiproliferatív hatásúak, fokozzák tumoros sejtvonalak differenciálódását és apoptózisát. 22

23 6. IRODALOM Általános összefoglalók, metabolizmus De Duve, C. and Bauduin, P. (1966) Peroxisomes (microbodies and related particles). Physiol. Rev. 46, Tolbert, N.E. (1981) Metabolic pathways in peroxisomes and glyoxysomes. Annu. Rev. Biochem. 50, van den Bosch, H., Schutgens, R.B.H., Wanders, R.J.A. and Tager, J.M. (1992) Biochemistry of peroxisomes. Annu. Rev. Biochem. 61, Cooper, G.M. (1997) The cell: a molecular approach. ASM Press, Washington, pp Bowers, W.E. (1998) Chritian de Duve and the discovery of lysosomes and peroxisomes. Trends Cell Biol. 8, Tabak, H.F., Braakman, I. and Distel, B. (1999) Peroxisomes: simple in function but complex in maintenance. Trends Cell Biol. 9, Lee, T. (1998) Biosynthesis and possible biological functions of plasmalogens. Biochim.Biophys. Acta 1394, Biogenezis és fehérje import Lazarow, P.B. and Fujiki, Y. (1985) Biogenesis of peroxisomes. Annu. Rev. Cell. Biol. 1, Subramani, S. (1993) Protein import into peroxisomes and biogenesis of the organelle. Annu. Rev. Cell Biol. 9, Purdue, P.E. and Lazarow, P.B. (1994) Peroxisomal biogenesis: multiple pathways of protein import. J. Biol. Chem. 269, Rachubinski, R.A. and Subramani, S. (1995) How proteins penetrate peroxisomes. Cell 83, McNew, J.A. and Goodman, J.M. (1996) The targeting and assembly of peroxisomal proteins: some old rules do not apply. Trends Biochem.Sci. 21, Erdmann, R., Veenhuis, M. and Kunau, W.H. (1997) Peroxisomes: organelles at the crossroads. Trends Cell Biol. 7, Kunau, W.-H. (1998) Peroxisome biogenesis: from yeast to man. Curr. Opin. Microbiol. 1, Titorenko, V.I. and Rachubinski, R.A. (1998) The endoplasmic reticulum plays an essential role in peroxisome biogenesis. Trends Biochem. Sci. 23, Subramani, S. (1998) Components involved in peroxisome import, biogenesis, proliferation, turnover, and movement. Physiol. Rev. 78, Hettema, E.H., Distel, B. and Tabak, H.F. (1999) Import of proteins into peroxisomes. Biochem. Biophys. Acta 1451, Fujiki, Y. (2000) Peroxisome biogenesis and peroxisome biogenesis disorders. FEBS Lett. 476, Subramani, S., Koller, A. and Snyder, W.B. (2000) Import of peroxisomal matrix and membrane proteins. Annu. Rev. Biochem. 69,

24 Peroxiszómális eredetű kórképek Lazarow, P.B. and Moser, H.W. (1995) in The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease (Scriver, C.R. et al., eds), pp , McGraw-Hill Moser, H.W., Smith, K.D. and Moser, A.B. (1995) in The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease (Scriver, C.R. et al., eds), pp , McGraw-Hill Subramani, S. (1997) PEX genes on the rise. Nat. Genet. 15, Fujiki, Y. (1997) Molecular defects in genetic diseases of peroxisomes. Biochim. Biophys. Acta 1361, Dubois-Dalcq, M., Feigenbaum, V. and Aubourg, P. (1999) The neurobiology of X-linked adrenoleukodystrophy, a demyelinating peroxisomal disorder. Trends Neurosci. 22, 4-12 Fujiki, Y. (2000) Peroxisome biogenesis and peroxisome biogenesis disorders. FEBS Lett. 476, Gould, S.J. and Valle, D. (2000) Peroxisome biogenesis disorders. Trends in Genetics 16, Reguláció, PPAR, hepatokarcinogenezis Wilson, T.M. and Wahli, W. (1997) Peroxisome proliferator-activated receptor agonists. Curr. Opin. Chem. Biol. 1, Braun L., Mile V., Schaff Z., Csala M., Kardon T., Mandl J. and Bánhegyi G. (1999) Induction and peroxisomal appearance of gulonolactone oxidase upon clofibrate treatment in mouse liver. FEBS Lett. 458, Michalik, L. and Wahli, W. (1999) Peroxisome proliferator-activated receptors: three isotypes for a multitude of functions. Curr. Opin. Biotech. 10, Wu, Z., Puigserver, P. and Spiegelman, B.M. (1999) Transcriptional activation of adipogenesis. Curr. Opin. Cell Biol. 11, Vanden Heuvel, J.P. (1999) Peroxisome proliferator-activated receptors: a critical link among fatty acids, gene expression and carcinogenesis. J. Nutr. 129, 575S-580S Vanden Heuvel, J.P. (1999) Peroxisome proliferator-activated receptors (PPARS) and carcinogenesis. Toxicol. Sci. 47, 1-8 Holden, P.R. and Tugwood, J.D. (1999) Peroxisome proliferator-activated receptor alpha: role in rodent liver cancer and species differences. J. Mol. Endocrinol. 22, 1-8 Corton, J.C., Anderson, S.P. and Stauber, A. (2000) Central role of peroxisome proliferator-activated receptors in the actions of peroxisome proliferators. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 40, Kersten, S., Desvergne, B. and Wahli, W. (2000) Roles of PPARs in health and disease. Nature 405,