Nano-biotechnológia: érzékelés és építkezés biológiai makromolekulák segítségével

Átírás

1 Nano-biotechnológia: érzékelés és építkezés biológiai makromolekulák segítségével Bionanotechnológia: hogyan lehet érzékelésre, építkezésre és egyéb dolgokra használni a biológiai makromolekulákat. Ismétlés: élő szervezeteknél fehérjékből, nukleinsavakból lehet építkezni, amit az tesz lehetővé, hogy ezek a makromolekulák elég nagyok, kiterjedt felszínük van, melyeken könnyen felismerhető helyek vannak, amiken keresztül (? percitikus) kölcsönhatásba tudnak lépni egymással, valamint egyértelmű módón felismerni egymást. A makromolekulák különösen a fehérjék irányított belső dinamikával rendelkeznek, ami sokszor a működés szempontjából meghatározó. Az élő szervezetek példája azt mutatja, hogy a fehérjék és nukleinsavak kiválóan alkalmasak önszerveződő molekuláris gépezetek építésére! Miként használhatnánk fel őket a saját céljainkra? A biológiai makromolekulák nanotechnológiai alkalmazása A makromolekuláknak két alapvető felhasználási módja van, ebből az egyik egyértelmű, vagyis az, hogy természetes fehérjéket használjunk fel (pl. antitestek, enzimek). Ha tudjuk valamire használni a fehérjét úgy, ahogy az az élő szervezetben megvan, akkor fogjuk meg, és használjuk valamire (pl. bioszenzorokként ). De a kihívás az, hogy ne úgy használjuk a fehérjéket, ahogy azok az elő szervezetekben előfordulnak, hanem alakítsuk át őket céljainknak megfelelően, hozzunk létre új fehérjéket/nukleinsavakat. Eszköztár: - molekulamodellezés és tervezés (korlátozottan lehet alakítani, túl sok szabadsági fokkal rendelkezik - irányított evolúció - génsebészet Molekulafelismerés Immunglobulin G Ismétlés: - az immunrendszer meghatározó elemei - a molekula vége a változékony, ahol a felismerő és -kötőhelyek, vannak, melyek segítségével felismer egy-egy kötőmolekulát -több millióféle van az emberben 80%-ának csak a vége más - domain szerkezetű, 3 hurokvég (valójában domainpárok) amit variál a természet aminosavból állnak, nagy molekulák - az emberben nincs ennyi DNS, hogy ezeket mind eltárolja, ezért van egy mechanizmus, amely a konstans részhez rakosgatja össze a végeket, így nem kell az egészet annyiszor eltárolni

2 Lényeg: ha a fehérje felszínét variálgatom, akkor különböző számú felszínt generálok, így jó esélyem van arra, hogy ezek közül lesz egy olyan, ami egy adott C molekulát ad nekünk Működése: például az emberi genomban vannak olyan régiók, szegmensek, melyek az IgG különböző részét kódolják (ábra: színessel vannak jelölve), mind egy-egy darabját kódolja a molekulának. IgG génátrendeződés Ábra: C konstans rész, ez egy példányban van meg Továbbá vannak még más egységek is különböző színnel jelölve. Egy érési folyamatban van egy mechanizmus, amely úgy alakítja ki az IgG változat génjét, hogy a konstans részhez még mindegyikből rak egyet véletlenszerűen. Így alakul ki a teljes gén. Ezekből több millió variáció van (4*12*500, és ez csak az egyik szál). Mesterséges receptorok Ábra: váza a molekulának, a színes részek variálódnak, ugyanígy a fibronektinnél Tudjuk, hogy a molekulának ezt a részét szeretnénk megváltoztatni, látszik, hogy ez a három hurokrégió

3 építi fel. Itt is tudunk generálni ugyanúgy, mint az IgG-nél- több millió variánst, amelyek közül ki kell halászni azt, ami egy adott célmolekulát köt. Ha megvan a célmolekulánk, akkor azt már mesterséges receptorként lehet kezelni. A legegyszerűbb fehérje chipek vagy felismerőrendszerek úgy működnek, hogy van egy anyagom, amelyre szeretnénk egy specifikus receptort előállítani, akkor azt befecskendezzük egy állatba (pl. nyúlba), amelyben elszaporodnak azok az IgG-ok, amik azt felismerik(ezek a vérében nagy mennyiségben keletkeznek ), majd kiszedjük, és keletkezik egy olyan anyag, ami már egy receptor vagy szenzor alapeleme lehet. Hátránya, hogy állatokkal kell csinálni, és ez drágává is teszi, ráadásul az IgG-knek csak a legvége kell, mert ott van a felismerés. Célszerű lenne kis molekulákkal előállítani, melyek baktériumokkal termeltethetők. Tehát a receptorokat vagy veszem az élő szervezetből, vagy magam gyártom le őket. A következő ábrán a mesterséges előállításra láthatunk egy kísérletet: Lipocalin fehérje, színessel a hurokrégiók. A b) ábrán véletlenszerűen kicserélem oligopeptidekre, így olyan gént tudok csinálni, amelyekkel csak a sárga részeket navigálom. Néhánynak meghatározták a röntgendiffrakciós képét, a különböző színek különböző variánsokat jelölnek, a többi része szinte teljesen azonos. Az ilyen konstrukcióknak fantázianeveket is adtak, mint például az anticalin is (az antitestek mintájára). Ezek a kicsik, baktériumokkal nagy mennyiségben előállíthatók, olcsón termeltethetők. Aptamers SELEX (Funkcionális DNS/RNS molekulák előállítása irányított evolúcióval) Nemcsak fehérjékből lehet receptor molekulákat előállítani, hanem kiderült, hogy RNS-ből és DNS-ből is lehet. Általában a DNS-el kettős hélixes formában találkozunk, amely merev szerkezet, és nem változatos. Viszont, ha a DNS-t csak egyes szálként veszem, ugyanúgy fel tud venni alakokat, mint az RNS vagy a fehérje (ezek lineáris polimerek). Sok előnye van, ha nem fehérje szinten dolgozik az ember, mert sokkal könnyebb legyártani (nem kell hozzá baktérium). Ez megoldható, ha a lánc két végét konstansnak veszem, a középső nukleotiodot véletlenszerűen variálom (lehet a nuleotidok arányával szabályozni is). Ezek közül halásszuk ki azt, amelyik képes megkötni az adott célmolekulát (a köv. ábrán karikák). Nagy részük nem tudja megkötni, de van egy-kettő (az ábrán a csillagszerűek), amelyeknek

4 sikerül. Ezeket kihalásszuk, a többit eldobjuk. Az ábrán 2 olyan verzió is akadt, ami már többé-kevésbé köti a célmolekulát. Ezt az eredményt még tovább javíthatjuk polimeráz láncreakcióval (PPR), mivel ezek 1-es szálú RNS DNS-ek. Tehát tudjuk a két végét a láncnak, ezért szintetizáltatni tudjuk a kiegészítőláncát, majd annak venni a megfelelő számú komplementerét. A DNS polimeráz felépíti a kiegészítőláncot, amit PPR-el fel tudunk erősíteni.. A következő ciklusban ugyanez történik, csak végrehajtunk a láncon egy kis léptékű véletlen mutációt. Tehát az újabb körben abból indulunk ki, ami már előtte is kötötte az anyagot, vagyis a jók közül keressük a jobbakat, ezáltal jobb lesz a tulajdonságuk. Aptamerek előállítása: RNS/DNS(?) molekulák, amelyek képesek felismerni valamilyen célmolekulát. Aptamers- SELEX SELEX: egy stratégia, mellyel ez a szelekció több ciklusban elvégezhető. Kémcsőben is el lehet végezni (még baktérium se kell), hátránya viszont, hogy a DNS és az RNS négyféle építőelemből áll, így nincs annyi lehetőség, mint a fehérjékben, amelyek 20 építőelem található. Lényeg: fehérjékből is lehet mesterséges receptorokat előállítani, de lehet RNS/DNS-ből is. Az aptamer, mint hatóanyag Ábra: fekete az aptamer (1-es szálú DNS) Ha például veszem a 9-es molekulát - ami a véralvadásban játszik szerepet amely specifikusan felismeri, hozzá kötődik. Ha beadagoljuk a vérbe, nincs véralvadás, mert nem tudnak a partnereikhez kötődni. Ez a módszer trombózisnál használható, mert így szabályozni tudjuk, hogy legyen vagy ne legyen, vagy hogy mennyire legyen véralvadás. Nyilván fehérjékkel is meg lehet ezt csinálni. Előny: bármikor meg tudom szüntetni a blokkolást, ha veszem az aptamer párját (kiegészítőláncát)- amivel ő kettős szálú DNS-t tud kötni, ami nagyon stabil szerkezet- akkor rögtön elengedi ezt, mert neki így kedvezőbb. Ez ellenszerként tekinthető. Fehérjével ezt nehezebb véghez vinni.

5 Érzékelés biológiai makromolekulák segítségével Ha már vannak mesterségesen előállított receptoraink, nézzük meg hogyan tudunk érzékelni velük. DNA chip Felhasználható minták elemzésére. Például ha van egy olyan mintám, ami 6400 komponensből áll, akkor mind a 6400 célmolekula ellen előállítok receptort. Rögzítem az első fajta IgG-t a cellákba, majd ráöntöm a mintát. Ha benne van a keresett anyag, az megköt az adott cellán. Ezután lemosom a mintát. Ezt így még mindig nem látom, ezért használunk egy másik antitestet, ami csak erre specifikus. Leöntöm megint egy IgG keverékkel, nem biztos, hogy teljesen lefedik (egyik csak az egyik rész reagáltatja, a másik a másikat). Hozzáadok egy fluoreszkáló anyagot, amit pásztázó fluoriddal kiolvasok, így megtudom, hogy melyek fluoreszkálnak, ezáltal azt is, hogy melyeik cellákban történt kötés. Regenerálható, többször használható. Másfajta detektálási módszerek Ábra: 18*18 mm-es Si-lapkán 6400 rekesz Rezgőnyelves detektálás Könnyen összehozható a meglévő mikroelektronikai technológiákkal. A detektálás lényege, hogy egy Silapkán µm nagyságú nyelveket hozunk létre vagy illesztünk rá úgy, hogy mindegyik nyelven különböző receptor legyen. Átáramoltatjuk az oldatot, a nyelven megkötnek a keresett anyagok. Detektáláskor a nyelveket elektromos térben rezgetjük sajátfrekvenciájuk közelében, mert akkor legnagyobb az amplitúdójuk. Ha nyelven kötés történt, akkor változott a tömege, így változott a sajátfrekvenciája is. Lézerfénnyel történik a letapogatás, amellyel érzékelni tudom a változást. Ez a folyamat teljesen automatizálható. Egy érdekes alkalmazása ennek a technológiának a baktériumok tömegének mérése. Csak egy nyelvet veszek, amire egy vagy nagyon kevés IgG-t rögzítek, ami például baktériumot

6 képes felismerni. A nyelvre ráragad a keresett baktérium, így meg tudom mérni annak tömegét (attogrammosnagyságrendű). Detektálni sokféleképpen lehet, ha van detektorom. Egy másik detektálási módszer a Felületi plazmonrezonancia spektroszkópia Módszer: egy üvegfelületre rögzítik az IgG-t, vagy egy saját receptort, majd a vizsgálandó oldatot áramoltatják felette, amiből a keresett komponensek megkötődnek. Detektáláskor fénnyel megvilágítom alulról az üveget úgy, hogy teljes visszaverődést kapjak (az üveg törésmutatója nagyobb, mint az oldaté). Ha valami az üveghez kötődött, megváltozik a törésmutatója. A letapogatás változó szögben történik. (Használni lehet egy-egy molekula vizsgálatára flouresszenciával, pl. megjelöljük a kinezint, és nyomon tudjuk követni, hogy mit csinál). További szenzorok a génsebészet segítségével: GFP alapú szenzor Ahhoz, hogy a kötődési folyamat érzékeljen, elektromos vagy optikai jel kell, ezáltal tudom valamire használni. Ehhez szükség van a kötődési folyamat átkonvertálására elektromos jellé. A konvertálás végbemehet úgy, hogy olyan molekulát hozunk létre, amelyben egyszer benne van ez a konvertáló rész (maga úgy bocsát ki fényt -úgy változik meg az optikai tulajdonsága - hogy egyből látszik a kötődési tulajdonsága). A GFP zöld, fluoreszkáló fehérje. A fehérjék általában nem floureszkálnak, csak akkor, ha rájuk teszünk egy olyan csoportot. Kiderült azonban (kb. 20 éves felfedezés), hogy vannak olyan tengeri élőlények, melyek képesek fluoreszkálni, ha megfelelően feltekerednek ( kb. 200 aminosavból állnak). A feltekeredéskor olyan gyűrűs rendszer jön létre, amely mintha kvázi egy nagy gyűrűt alkotna. Az így keletkezett struktúra nem kovalens, egy delokalizált elektronrendszer alakul ki, ezért az egész gerjeszthetővé válik. A lényeg, ha rendesen feltekeredik, és az a 3-4 oldallánc megfelelő közelségbe kerül egymáshoz, akkor alkalmassá válik a fluoreszkálásra. Tehát a receptorunkat beépítjük a GFP aminosavszekvenciába. Vannak felületi hurokrégiók (az ábrán kis fekete rész), oda építjük be a receptor molekulát, vagyis a polipeptidlánc közepébe, így nem zavarja a GFP-t. Ezután irányított szelekcióval előidéznek korlátozott mértékű mutációkat, és megnézik, hogy ezek közül van-e olyan, amelynek megváltozik a

7 fluoresszenciája, ha bekövetkezik a kötődés. A jelenség fizikai alapja, hogy megváltozik a lokális környezet, így ott változik az optikai tulajdonság is.