Immunológiai módszerek a klinikai kutatásban 12-13 IMMUNOASSAY Katona Éva Az immunassay-k jelentősége Az analitikai biokémia hátaslova Alkalmazás Részesedés Analit típusa Koncentráció tartomány Gyógyszerszint meghatározás 26% Kis molekulák 10 nm-mm Fertőző betegségek 21% Baktériumok, vírusok, nagy molekulák, antitestek, metabolitok Endokrinológia 33% Kis molekulák, nagy molekulák beleértve az antitesteket is (70% <5 kda) Immunológia allergia, autoimmunitás, egyéb low pm-nm 7% Antitestek pm-nm Tumor 5% Nagy molekulák, antitestek pm-nm Immunoassay típusok Homogén - Heterogén Direkt - Indirekt Kompetitív - Nem kompetitív Egyéb (specifikus proteinek stb.) 8% Nagy molekulák > nm AZ IMMUNASSAY-K TÍPUSAI Kompetitív (a reagens mennyisége limitált) szimultán: Ab + + -L Ab: + Ab:-L + -L több lépéses: 1. lépés: Ab + Ab: + Ab 2. lépés: Ab: + Ab + -L Ab: + Ab:-L + -L Nem kompetitív (a reagens feleslegben van) L=ligand: radioaktív izotóp, fluorofór, enzim, chemiluminescens, kofaktor, inhibitor, fém, partikulum, szubsztrát, polinukleotid HETEROGÉN: a komplexben kötött és szabadon lévő ligandummal jelzett reagenst a lekötődött jel detektálása előtt elválasztjuk HOMOGÉN: a kötött és szabad jelzett reagens elválasztása nem szükséges RADIOIMMUNOASSAY (RIA) Csak abban az esetben használatos, ha egy specifikus és nagyon érzékeny módszerre van szükség. A RIA hátrányai: a nagy γ-sugárzó izotóp atomokkal történő jelölés, mint a I 125 gyakran nem megfelelő (a gyógyszerek kis molekulák, nem hatékony a jelölés vagy csökken az antigenitásuk) a tríciummal való jelölés megfelelő, de ennek hátránya, hogy a H 3 β-sugárzó és a β -scintillációs számlálás lassú és körülményes. Csak heterogén módszer lehet. Antigén helyett az antitest jelölése izotóppal: immunoradiometric assay (IRMA) 1
FLUORESCENT POLARIZATION IMMUNOASSAY (FPIA) I. A módszer elve: egy fluoreszkáló anyaghoz (fluorofór) kémiai kötéssel antigént (gyógyszer, hormon, metabolit) kapcsolnak (konjugátum) a fluorofórhoz kötött antigént megvilágítják polarizált fénnyel Ha a konjugátumhoz nem kötődik antitest, szabadon rotál az oldatban és a beeső és az emittált fény síkja egymáshoz képest elmozdulhat. Ha a konjugátumhoz antitest kötődik, az antitest molekula nagy mérete kb. 100x-ra csökkenti annak rotációs relaxációs idejét. Ez azt jelenti, hogy csak kis elmozdulás jöhet létre ugyanannyi idő alatt, ezért az elnyelt és kibocsátott fény ugyanabban a síkban polarizált. Az emittált fény polarizációjának mértéke arányos a szabad konjugátum mennyiségével. Ha a mintában lévő szabad antigén korlátozott mennyiségű antitest kötőhelyeiért versenyez a konjugátummal, a fény polarizációjának mértéke jelzi a minta antigén koncentrációját. FLUORESCENT POLARIZATION IMMUNOASSAY (FPIA) II. A mintában nincs antigén (az összes jelzett antigén antitesthez kötött lassú rotáció) At + At- antitest jelzett antigén síkban polarizált beeső fény minta ugyanabban a síkban kibocsátott fluoreszcencia FLUORESCENT POLARIZATION IMMUNOASSAY (FPIA) III. A mintában jelen van az antigén (a mintában lévő antigén az antitesthez kötődik a jelzett antigén szabadon rotál) At + antitest jelzett antigén + antigén a mintában At- + FLUORESCENT POLARIZATION IMMUNOASSAY (FPIA) IV. A készülékek a polarizált fény intenzitását mérik, ami fordított arányban áll a minta antigén koncentrációjával. minta polarizáció síkban polarizált beeső fény Depolarizált fluoreszcencia A detektálás síkjában csökkent fluoreszcencia intenzitás antigén koncentráció Immunoassay típusok - nem kompetitív jel At első At direkt at indirekt jel At direkt ag szendvics jel második At At 1 jel At 2 Immunoassay formációk - kompetitív 1 jelöletlen At a mintában!!! jelzett At a reagensben 2
Immunoassay formációk - kompetitív 2 A szilárd felszín típusai 96 lyukú mikrotitráló lemez felszíne (polystirol, PVC stb) (ELISA) Reakciócső felszíne (RIA) Latex partikulumok felszíne (pl. MEIA) Mágneses partikulumok felszíne (automatizált heterogén immunoassay-k) jelzett a reagensben jelöletlen At a a mintában reagensben vagy a felszínen Izotóp Enzim JELZÉSEK 1. ( 125 I: γ, T 1/2 = 60 nap 57 Co: γ, T 1/2 = 270 nap 3 H: β, T 1/2 = 12.26 év 14 C: β, T 1/2 = 5760 év) tormaperoxidáz HRPO (oxidoreduktáz) alkalikus foszfatáz AP (primer alkoholok, fenolok és aminok foszfát észtereinek hidrolízise) β-d- galaktozidáz glükóz oxidáz glükóz-6-foszfát dehidrogenáz kataláz ureáz JELZÉSEK 2. Fluorofór (megvilágítva fényt emittál) 1, direkt fluorofór jelzés (FITC, rhodamin stb.) 2, az enzim szubsztrátja válik fluorescens anyaggá pl. MUP MU Luminescens (kémiai reakció közben fényt emittál) acridium észter acridium szulfonamid isoluminol Biotin Protein A Kofaktor Inhibitor DNS Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Microwell Products 3
ELISA (szendvics típus) Enzyme-Linked ImmunoSorbent (ELISA) leggyakrabban peptidek, proteinek, antitestek és hormonok kimutatására és meghatározására szolgál. Általában 96-well plate-t használunk (Corning s/nunc/costar stb.), de lehet 384 well, stb. Lépései: A lemezt bevonjuk (capture) az antigénre specifikus elfogó antitesttel (1-10µg/ ml) leggyakrabban karbonát-bikarbonát pufferben (ph:9.5), inkubálás 2 h szobahőn vagy egy éjszakán át 4 C-on mosás A szabadon maradt felszín blokkolása (0,5-1% BSA), inkubálás 0,5-1 h szobahőn mosás Standardok/minták bemérése (50-100 µl/well), inkubálás 1 h szobahőn mosás Az antigénre specifikus, enzimmel (HRP/AP) konjugált jelző antitest bemérése, inkubálás 1 h szobahőn mosás Szubsztrát adása és detektálás Az inkubálási időket és hőmérsékleteket minden ELISA esetén optimalizálni kell. ELISA (szendvics típus) Ha az elfogó antitest biotinált és streptavidinnel bevont ELISA lemezt használunk, az elfogó, jelző antitesteket és a mintát egyszerre is bemérhetjük. Az inkubálási idő letelte után mossuk a lemezt majd bemérjük az enzim szubsztrátját és detektálunk (egylépéses ELISA). Biotinilált anti-fxiii-b elfogó antitest Reagensek FXIII A A B B Streptavidinnel fedett felület HRP-vel jelölt anti-fxiii-a jelzô antitest Reakció A A B B Az egy lépéses szendvics ELISA FXIII meghatározás elve A lemez rázatása szükséges! Szükség van istmert ag koncentrációjú standardra! ELISA kalibrációs görbe Indirekt ELISA módszer (adott antigénre specifikus antitest kimutatása) MEIA (Mikropartikuláris Enzim Immuno Assay) A Mikropartikuláris Enzim Immunoassay (MEIA) elméleti alapjai A mérendő anyagra specifikus elfogóval fedett szubmikron nagyságú latex részecskéket alkalmaz a módszer. Következmény: nagy, hatékony felületet az immunreakció számára. a kinetikus reakció felerősödik, csökken az inkubációs idő. Anti-Troponin I monoklonális antitesttel fedett Latex szemcsék Üvegszál mátrix Mintavevő egységben: A mérendő minta és a szükséges reagensek egy reakcióedénybe kerülnek Mérőegységben: 1. A minta inkubálódik 2. A reakcióelegy egy inert üvegszálas mátrix felületére kerül át. Az immunkomplex fennmarad az üvegszálakon, a reakcióelegy többi összetevője átáramlik, kimosódik. 3. Az üvegszálas mátrix felületére egy a mérendő anyagra specifikus, alkalikus foszfatázzal jelzett konjugátum kerül. 4. Az üvegszálas mátrix felületére 4-Methylumbelliferyl-foszfát (MUP) kerül, melyet az enzim Methylumbelliferonná (MU) hidrolizál. 4. A reakció során a mátrix felületén keletkező fluoreszcens MU képződési rátáját mérjük, ami arányos a mintában lévő analit koncentrációjával. 4
A MEIA reakció lépései Kétlépéses MINTAVEVŐ EGYSÉG Minta Mikropartikulumok Alkalikus foszfatáz konjugát REAKCIÓ EGYSÉG A minta és a Mikropartikulumok keverednek Reakcióelegy az üvegszálas mátrixra továbbítodik MOSÁS Alkalikus foszfatáz konjugát a mátrixra Egylépéses MINTAVEVŐ EGYSÉG Minta Mikropartikulumok Alkalikus foszfatáz konjugát REAKCIÓ EGYSÉG A minta a Mikropartikulumok és az Alkalikus foszfatáz konjugát keverednek Reakcióelegy az üvegszálas mátrixra továbbítodik MOSÁS Fluoreszcencia mérés Tipikus standard görbe MEIA módszer esetén MOSÁS Fluoreszcencia mérés JELZÉSEK Fluorofór (megvilágítva fényt emittál) 1, direkt fluorofór jelzés (FITC, rhodamin stb.) 2, az enzim szubsztrátja válik fluorescens anyaggá pl. MUP MU DELFIA: a TRF (Time Resolved Fluorometry) elvén működik A DELFIA rendszerben a fluorometer 1000 excitációs fényfelvillanást szolgáltat másodpercenként, melyek kevesebb, mint 1 mikrosecundumig tartanak. A fluoreszcencia mindegyik impulzus után 400 és 800 mikrosecundum között mérhet! JELZÉSEK Luminescens (kémiai reakció közben fényt emittál) Enzim szubsztrátja kemiluminescens fényemisszióval stabilizálódik, pl: AP szubsztrátja az adamantil 1,2-dioxetan arylfoszfát (AMPPD) isoluminol (A HRPO hatására, H 2 O 2 jelenlétében bekövetkező luminol oxidáció fényemisszió jelerősségét 1000-szeresre növelhetjük, ha a közegben szubsztituált fenolok, vagy naftolok vannak (pl. 4-jodofenol). Az enhanced kemilumineszcenciás jel 2-20 perc időtartamban jól leolvasható. Ezt a jelképzést sok automatizált módszer használja) acridium észter, acridium szulfonamid (A jel keletkezésekor alkalikus közegben az észter kötés hasad s egy instabil N-metilakridon származék keletkezik, amely jellemző hullámhosszúságú fény felvillanások emissziójával stabilizálódik. A fényintenzitás mértéke a közeg lumineszcens anyag koncentrációjával arányos.) JELZÉSEK 4. Elektrokemiluminescens immunoassay (ECLIA) Eltérően a fluoreszcencia méréstől, itt nincs besugárzási fény, és jel csak a lumineszcens molekulából származik, így a háttér teoretikusan nem ad jelet. Eltérően a radioaktív bomlástól, a kémiai reakcióból származó összes foton rövid idő alatt rendelkezésre áll, így növelve a potenciális specifikus aktivitást. A rutenium(ii) tris (bipiridil) [Ru(bpi) 3 3+ ], egy platina elektród felületén gerjesztődik, majd alapállapotba kerül fény (elektrokemilumineszcens) emisszióval. A reakcióban elektron donorként tripropilamin (TPA) vesz részt. A Ru(bpi) 3 3+ komplex redukciójával nyerjük a gerjesztett állapotú Ru(bpi) 3 2+ komplexet, amely elektronleadás mellet fénykibocsátással tér vissza alapállapotába. Ezt a fénykibocsátást (620 nm) mérik egy átfolyó elektrokémiai cellában. Elektrondonor felesleg mellett a ruténium sokszorosan gerjeszthető, ami a jel erősödését eredményezi. 5
JELZÉSEK: IPCR Amplifikáció: valós-idejű PCR kettősen jelzett próba alkalmazásával (Fluorescens festék + quencher) Miközben a DNS-polimeráz hosszabbítja a PCR primert, az exonukleáz aktivitása hasítja a primer közelében bekötődött próbát. A quencher és fluorescens festék egymástól való eltávolodása fluorescens jelet szolgáltat. Chimera biotech Biochip Multi-analyte assay-k végzésére létrehozott szilárd fázisú technika, a felszín az analit tekintetében inert. 6
Production Biochip Carrier > 20 million biochips per year Assay Panelek Kompetitív Immunoassay DOA monitorozás (Amphetamine, Methamphetamine, Cocaine, Barbiturates, Cannabinoids, Opiates, Tumor monitorozás Tumor PSA Cardiális markerek Reproduktív hormonok Thyroid hormonok Antibiotikumok Cytokinek DETEKTÁLÁS { Methadone, Benzodiazepines, Lorazepam, Phencyclidine, Creatinine) KONJUGÁTUM ANALIT E YY ANTITEST TESZT RÉGIÓK SZUBSZTRÁT Tulajdonságok Kompetitív Biochip Assay Más immunoassay-kel összehasonlítva a teljesítőképessége megfelelő. Methadone A GC/MS eredményekkel jobban megegyező eredményeket ad. Benzodiazepines Az amphetamine és methamphetamine, valamint a benzodiazepine meghatározások a drog azonosításhoz további segítséget nyújtanak. Minta: 7 ul minta / biochip Negatív vizelet kontroll Cannabinoids Amphetamine Methamphetamine Cocaine Opiates Cannabinoids Amphetamine Methamphetamine Barbiturates Phencyclidine DoA pozitív vizelet Vizelet Vér teljes vér Szérum Nyál Methadone Benzodiazepines Cocaine Barbiturates Opiates Phencyclidine 7
Előnyök Magas hozamú, automata analizátor 108 minta/óra Párhuzamos mérés Ugyanazon mintából egy időben több teszt mérődik 1188 teszt /óra (+creatinin) Kis minta térfogat 7 ul mintából 10 teszt mérhető szimultán Különösen lényeges vér és nyál esetén Kevesebb minőségi kontroll anyag szükséges Multi analit kontrollok (ár!) Különböző cut off szintek választhatók 1 kit különböző cut off szinteken detektál Pl. opiátok 300 és 2000 ng/ml Flexibilis, ha a felhasználó másként igényli Előnyök Biztonságosság A mintatartók ajtaja bezáródik a feltöltés után A software jelszóval védett A minta carry over vagy kontamináció csökkent csak 1 aliquot minta mérődik 10 helyett Az eldobható biochip fertőzések szempontjából kedvezőbb, mint a többször használt küvetták Retrospektív eredményközlés Újabb analízis nélkül ki lehet adni az addig még nem kért eredményeket Creatinin marker A minta hamisítást egyetlen méréssel ki lehet deríteni A laboratórium csak a kért teszteket számlázza FDA engedély: vizelet minta analizátor Az immunassayk-ben előforduló problémák Heterofil antitestek jelenlétének következményei Jelzett detektáló antitest Analit Elfogó antitest Heterofil antitest vagy HAMA A felszín blokkolására használt fehérje Interferáló, keresztreagáló anyag INTERFERENCIÁK VIZSGÁLATA A módszer specificitása az alkalmazott antitestek specificitásától függ! A leggyakoribb interferenciát okozó anyagok immunoassay-k esetén: az antigénnel rokon szerkezetű anyagok keresztreakciója (gyógyszerek!) Poliklonális antitestek esetén a keresztreakció tesztelése minden Lotnál szükséges! endogén humán antitestek (pl. a thyroid autoantitestek a T3 vagy T4-hez kötődnek, a reagens antitestek kötődését gátolva befolyásolják a mérést) heterofil antitestek (humán anti-állat antitestek, befolyásolhatják a reagensben lévő antitestek reaktivitását, gyakran okoznak pozitív interfrenciát a szendvics típusú módszereknél) INTERFERENCIÁK VIZSGÁLATA Heterofil antitestek kimutatása: - sorozat hígítás heterofil antitest negatív szérummal és a paralellizmus vizsgálata egy másik szérummal - a minta előinkubálása nem-immun szérummal vagy irreleváns specificitású antitesttel abból az állatfajból, melyre specifikus heterofil antitestet feltételezünk. A heterofil antitest lekötése miatt az előinkubálás után elvégezve a mérést eltérő eredményt kapunk. - A heterofil antitest eltávolítása a szérumból Protein-Abszorpcióval, hőkezeléssel, egyéb szeparációs módszerrel. - Humán anti-egér antitest kimutatására már létezik módszer. hemolízis lipémia magas bilirubin rheuma faktor (RF) 8
INTERFERENCIÁK VIZSGÁLATA Hemolízis, lipémia, magas bilirubin, rheuma faktor (RF) Szükséges anyagok: - a kérdéses interferáló anygoktól mentes minta, melynek analit koncentrációja a referencia tartomány felső régiójában van -hemolizátum ismert hemoglobin koncentrációval -intralipid infúziós oldat (lipid összetétele pontosan ismert) -bilirubin standard -rheuma faktor A vizsgálat kivitelezése: 1. Az interferáló anyagból n elemű hígítási sort készítünk (a koncentrációk a teszt koncentrációk 10-szeresei) 2. A mintából n+1 alikvotot készítünk (450 µl), melyekhez 50-50 µl hígított interferáló anyagot, ill. hígítót (+1) adunk. 3. A meghatározást elvégezzük mindegyik így elkészített teszt mintából. 4. Az interferáló anyagot nem tartalmazó mintához viszonyítva megadjuk a többi minta %-os analit koncentrációját. 10% eltérés felett tekintjük a hatást interferenciának. mért FXIII-A % Bilirubin hatása 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 0 50 100 150 200 250 300 350 400 Bilirubin koncentráció (umol/l) mért FXIII-A % Triglicerid hatása 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Triglicerid mmol/l mért FXIII-A % Hemolízis hatása 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 0 20 40 60 80 100 120 140 Hemoglobin (g/l) 9