Fluoreszcencia 2. (Kioltás, Anizotrópia, FRET) Gerjesztés A gerjesztett állapotú elektron lecsengési lehetőségei Fluoreszcencia 10-9 s k f Foszforeszcencia 10-3 s k ph 10-15 s Fizika-Biofizika 2. Huber Tamás PTE ÁOK Biofizikai Intézet 2015. 02. 23. Alap állapot Relaxáció Kioltás vagy Energia transzfer Gerjesztett állapot k q k t k ic Internal conversion (HŐ) Fluoreszcencia kioltás Intenzitás: az időegység alatt emittált fotonok számával arányos Kvantumhatásfok: Milyen hatásfokkal fordítódik az elnyelt energia fénykibocsátásra. A kibocsátott fotonok száma, osztva az elnyelt fotonok számával. Élettartam: az az időtartam, ami alatt az intenzitás az részére csökken le. 1 Q f k f k f k nr e-ad A fluorofórok által kibocsátott fény intenzitásának csökkenése olyan molekulák vagy ionok jelenlétében, melyek elektronszerkezete megfelelő ahhoz, hogy a gerjesztett állapotban lévő fluorofórral ütközve annak gerjesztési energiáját átvegyék, majd azt valamilyen formában disszipálják (például hő). Versengés a fluoreszcencia kibocsátása és a nem sugárzásos átmenet között csökkent fluoreszcencia emisszió. Fluoreszcencia intenzitás lecsökken! k f k nr 1. Statikus kioltás A kioltó és a fluorofór még a gerjesztés előtt egy komplexet (sötét komplex) alkot, mely komplex nem képes fényt emittálni. - Diffúzió által nem befolyásolt - Fluoreszcencia élettartam nem érzékeny rá + : Nincs emisszió Fluorofór Kioltó Sötét komplex (a gerjesztés előtt jön létre) Kinint kioltjuk klorid ionnal. Nem fog fluoreszkálni a minta. Kinin fluoreszcenciája kék fény emissziója Gerjesztés 1
2. Dinamikus kioltás A kioltó és a fluorofór molekulák diffúziós folyamatok révén egymás közelébe kerülnek, ütközési komplexet hoznak létre, majd a gerjesztett fluorofór átadja az energiáját a kioltónak. - Diffúzió által befolyásolt - Fluoreszcencia élettartamot csökkenti Max Volmer (1885-1965) Otto Stern (1888-1969) Fizikai Nobel díj (1943) F 0 /F= 0 / + : + Fluorofór Kioltó h*υ Gerjesztés Ütközési komplex (a gerjesztés után jön létre) Fluorofór Kioltó Az egyenes meredeksége megadja a Stern-Volmer állandót (K SV ). Ha a fluorofór élettartamát vizsgáljuk a kioltó koncentrációjának a függvényében, akkor lineáris összefüggést kapunk: 0 τ 0 kioltó távollétében az élettartam τ kioltó jelenlétében mért élettartam 1 k 0 q 1 KSV q k + (vagy k q )- állandó, mely jellemzi a fluorofór és a kioltó transzportját valamint a hozzáférhetőséget. K sv egyenes meredeksége, Stern-Volmer állandó F 0 : fluoreszcencia intenzitás a kioltó hiányában F : fluoreszcencia intenzitás a kioltó jelenlétében K sv : Stern-Volmer állandó [Q] : kioltó koncentrációja F 0 1 K [ Q sv ] F A fluorofór hozzáférhetőségéről ad információt! Dinamikus kioltás K sv =k q * τ 0 A kioltó számára nem egyformán hozzáférhető fluorofórok esetén! α: a kioltó által hozzáférhető fluorofórok aránya k q : bimolekuláris sebességi állandó, ami a fluorofór és a kioltó diffúziós képességével, illetve a fluorofór hozzáférhetőségével áll összefüggésben 2
Kioltók típusai 1. Semleges kioltók: akrilamid, nitroxidok sztérikus viszonyok feltérképezése 2. Töltéssel rendelkező kioltók: jodid, cézium, kobalt töltés viszonyok meghatározása Dinamikus kioltás Statikus kioltás Triptofán fluoreszcenciájának kioltása akrilamiddal Fehérjék konformációs állapotának és töltés viszonyainak feltérképezése Membránok permeabilitása Diffúziós állandók meghatározása Polarizált fény Izotróp rendszer: Irányultság szempontjából homogén rendszer. Anizotróp rendszer: olyan rendszer, melyben vannak kitüntetett irányok. A polarizálatlan fényben a polarizációs síkok keverednek. A polarizált fényben a polarizációs síkok összhangban vannak (azonosak). Fluoreszcencia anizotrópia: Polarizált fény segítségével az izotróp fluorofór populációt anizotróppá alakítjuk át. Nem polarizált fény Polarizátor Polarizált fény Polarizált fény: Elektromos térerősség vektor egy jól definiált síkban rezeg. 3
Polarizált fény abszorpciója Fotoszelekció Abszorpciós vektor: meghatározza a polarizált fény abszorpciójának valószínűségét. Csak a megfelelő orientáltságú abszorpciós momentummal rendelkező fluorofórok gerjesztődnek a mintában! A fotoszelekciónak megfelelően, a gerjesztett állapotú fluorofórok a z tengely köré rajzolható igen kis kúpszögű (υ) forgás-kúpon belül helyezkednek el. Gerjesztési oldali polarizátor Emissziós oldali polarizátor Polarizátorok alkalmazására van szükség! p I I VV VV GI GI VH VH G= G - faktor dimenzió nélküli nem függ a fluorofór koncentrációjától a fluorofór rotációs diffúziós mozgása befolyásolja nem additív!!! értéke 0-tól 1-ig változhat A vertikális és horizontális síkban mért intenzitások segítségével lehet meghatározni az anizotrópiát! r I I VV VV GI 2GI VH VH dimenzió nélküli nem függ a fluorofór koncentrációjától a fluorofór rotációs diffúziós mozgása befolyásolja additív!!! értéke 0-tól 1-ig változhat Perrin egyenlet (Francis Perrin - 1926) Az anizotrópia mértéke függ a rotációs diffúziótól és az élettartamtól, amely alatt az emissziós vektor elfordul. Anizotrópia A fluoreszcencia anizotrópia a tér három irányába emittáló fluorofórt jellemzi, vagyis az emissziós polarizáció mértéke, mellyel a molekulák rotációját lehet kimutatni. Ha kialakul egy komplex, akkor annak lassabb lesz a mozgása, növekszik az anizotrópia értéke. Rotációs korrelációs idő a molekulák rotációs diffúziós képességéről ad információt! Normál értéke: -0,2 és 0,4 között van. Ha ettől eltérőt mérünk az valami műtermék, hiba (pl.: fényszórásból). 4
Alexa Fluor 488-aktin steady-state anizotrópia értékei 2015.04.07. 0,22 0,20 0,18 0,16 Molekulák rotációs diffúziójának meghatározása Molekulák közti interakciók detektálása Konformációs változások észlelése Membránok fluiditásának meghatározása 0,14 0,12 0 5 10 15 20 25 30 [DAAM] M) DAD+C DAD Förster típusú Rezonancia Energia Transzfer FRET - Theodor Förster, 1948 A Förster típusú energiatranszfer a gerjesztett állapotban lévő fluoreszkáló molekula (donor), valamint egy megfelelő spektroszkópiás követelményeket kielégítő molekula (akceptor) között dipól-dipól kölcsönhatás révén, sugárzás nélküli energiaátadás formájában jön létre. A gerjesztett donor relaxációja az akceptor molekula emissziója révén valósul meg! A FRET feltételei Fluoreszcens donor és akceptor molekula. A donor és akceptor molekula közötti távolság 2-10 nm! Megfelelő orientáció Átfedés a donor emissziós spektruma és az akceptor abszorpciós spektruma között. k t = konst. * J(λ) n -4 k f R -6 κ 2 A FRET molekuláris mechanizmusa Donor Akceptor τ DA : élettartam az akceptor jelenlétében τ D : élettartam az akceptor hiányában F DA : fluoreszcencia intenzitás az akceptor jelenlétében F D : fluoreszcencia intenzitás az akceptor hiányában Donor emissziója csökken! kex k nf k f k t k f Akceptor emissziója nő! 5
E R 6 0 R 6 0 R 6 Förster féle kritikus távolság (R 0 ): Az a donor-akceptor távolság, aminél a transzfer hatásfok 0,5. Heterotranszfer: különböző fluorofórok között jön létre Homotranszfer: azonos fluorofórok között jön létre, melyeket kis Stokes-eltolódás jellemez FRET alkalmazások Molekulák közötti kölcsönhatások tanulmányozása Makromolekulák asszociációs vizsgálata (pl. DNS) Távolság mérés (molekuláris mérőszalag) Fehérjék konformációs vizsgálata Homotranszfer Heterotranszfer Gyakorlati alkalmazások Gyakorlati alkalmazások Fluoreszcencia Kioltás Milyen a nukleotid kötő zsebben található fluorofór hozzáférhetősége? Nukleotidkötő-zseb Nukleotidkötő-zseb ε-atp ε-atp Cofilin Profilin 6
Intensity (cps) F 0 / F Intensity (cps) 2015.04.07. Gyakorlati alkalmazások FRET 3,00 2,75 2,50 2,25 2,00 1,75 1,50 1,25 1,00 Ksv profilin = 1.02 M -1 Ksv 1 = 0.28 M -1 Ksv cofilin = 0.09 M -1 = 20% (bound -ATP) Ksv 2 = 53.6 M -1 (free -ATP) 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Acrylamide (M) Fehérjék konformációs változása Profilin jelenlétében a fluorofór hozzáférhetősége nagyobb! Cofilin jelenlétében a fluorofór hozzáférhetősége kisebb! Gyakorlati alkalmazások FRET 1. Donor élettartam Fehérjék interakciója 100000 10000 Intensity IRF Fit 1000 100 10 1 0 20 40 60 80 100 Time Domain Time (ns) 10000 1000 100 Intensity IRF Fit τ D =2,959 ns τ DA =1,191 ns E = 1 (τ DA / τ D ) 10 E=59,8% 1 0 20 40 60 80 100 Time Domain Time (ns) 7
2. 10740400 4738510 E = 1 (F DA / F D ) F DA =4738510 Köszönöm a figyelmet! F D =10740400 E=55,88% 8