Tömegspektrometria A tömegspektrometria olyan vizsgálati módszer, amelynél ionos részecskéket választunk el fajlagos tömegük (töltésegységre eső tömegük: m/z) szerint, csökkentett nyomáson, elektromos, vagy mágneses mezők segítségével. Az elválasztott ionok intenzitását folyamatosan mérjük, s így egy ionáram intenzitás - fajlagos tömeg függvény-kapcsolathoz, az ún. tömegspektrumhoz jutunk. Ez a tömegspektrum a minőségi információ alapja - fingerprint.
Tömegspektrométer részei 1. Mintabeviteli rendszer (közvetlen: gáz, folyadék, vagy szilárd minta bevitele, közvetett: GC, HPLC. 2. Ionforrás az ionoptikával (ionok előállítása). 3. Analizátor (ionok elválasztása fajlagos tömegük szerint). 4. Detektor (ion, vagy fotonsokszorozó). 5. Vákuumrendszer (első fokozat egy olajrotációs szivattyú (0,1 kpa), a második egy turbomolekuláris pumpa, mellyel 10-6 -10-8 kpa nyomást lehet elérni). 6. Számítógép szabályzó és adatkezelő (adatgyűjtő, feldolgozó, értékelő, archíváló) funkcióval.
Ionforrások Feladata: a vizsgálandó molekulából valamilyen gerjesztő energia (kinetikus, fény, elektromos, kémiai, stb.) segítségével ionokat hozzon létre és ezeket az ionokat lehetőleg azonos kinetikus energiával, egy nyalábban mozgatva, gyorsítva juttassa az analizátorba. 1, Elektronütközési (elektronimpakt) ionizáció (EI) Leggyakoribb (95%) 50-75 ev energiájú termikus elektronok (wolfrámizzószál) Ütközési ionizáció gázfázisban
EI ionforrás V tér 1: mintabevezető nyílás; 2: ionvisszaverő lemez (repeller); 3: izzószál; 4: elektronbevezető nyílás; 5 és 6: iongyorsító rés; 7: belépő nyílás; 8: ionképződés helye; 9: anód
Relatív intenzitás Etilbenzol spektruma bázis csúcs molekulaion
Aromás rendszerek jellegzetes ionfragmensei: 91 - tropílium-kation, nagyon stabil részecske, 77 - fenil-kation, 65 és 51.
Izobutil-benzol gyökkation M+.
2, Kémiai ionizáció (CI) Kíméletesebb ionizáció Fragmensek számának csökkentése (tömegspektrum egyszerűsítése). A mérendő mintát az elektronforrásba belépése előtt "reagens" gázzal kb. tízezerszeresére hígítják. A reagens gáz molekulái ionizálódnak. Az így keletkezett primer ionok ütközése a vizsgálandó molekulákkal vezet a szekunder ionok képződéséhez.
Kémiai ionizáció főbb lépései metán gáz esetén Primer ionképződés: Szekunder ionképződés: CH CH 4 4 e CH 4 CH 4 CH 5 2e CH 3 Pszeudo-molekulaion képződése M H 4 CH5 M CH
Szilárd hordozóra felvitt minták vizsgálata 1, Gyors atom ütközési ionizáció Fast Atom Bombardment (FAB) Argonágyú (4-10 kev) szilárd hordozóra felvitt minta, vagy szilárd minta felületéről szekunder ionok kilökése analizátor. 2, Folyadék szekunder ion tömegspektrometria - Liquid Secondary Ion Mass Spectrometry (LSIMS) Céziumion ágyú (2-30 kev) lsd. FAB Hordozó: fém Mátrix: glicerin, 3-nitro-benzil-alkohol Hőérzékeny vegyületek kíméletes ionizációja
FAB és LSIMS [M+H] + [M+Na] +
Alkalmazás: peptidek és más biomolekulák, szulfonsavszármazékok, ionos szerves fémvegyületek. FAB az egyik legjobb ionizációs technika ionos vegyületekre. Etilén-glikol-monoéter
Mátrix közvetítésével végzett lézer deszorpciós ionizáció - Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) Fotoionizációs jól szabályozható lézerforrás mátrix molekulák (fotodisszociáció elkerülése) vizsgált molekulák Kíméletes ionizáció Termikusan érzékeny anyagok, enzimek, hormonok, vagy akár több százezer dalton tömegű biomolekulák, fehérje szekvenciák tömegspektrometriás vizsgálata. Koichi Tanaka- 2002 Nobel-díj
MALDI N 2 lézer 337 nm, UV Mátrix (benzoesav és fahéjsav származékok, 100x feleslegben) és minta beszárítása vákuumban Mátrix abszorbeálja a lézerfényt elpárologtatja és ionizálja a mintamolekulákat
A Bovine Serum Albumin (BSA) MALDI spektruma
GC-MS interfész
Folyadékok ionizálási módszerei HPLC-interfész technikák 1) Termoszpré (Thermospray) vákuumba porlasztás, hőstabil vegyületek. 2) Elektroszpré (Electrospray) - atmoszférikus nyomáson folyadék porlasztás, hőérzékeny és ionizálható vegyületek. 3) Atmoszférikus nyomású kémiai ionizáció Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI) atmoszférikus nyomáson folyadék porlasztás, hőstabil és nem ionos vegyületek, kémiai ionizáció. LÁGY IONIZÁCIÓ, KISMÉRTÉKŰ FRAGMENTÁCIÓ
ELECTROSPRAY (ESI) Elektrospray ionizáció során a kromatografáló oszlopról eluálódó ionos molekulákat (szerves savak, szerves bázisok, vagy sóik) egy porlasztó gáz egy feszültség alatt lévő kapillárison porlaszt keresztül. A folyadékcseppekbe zárt töltéshordozók sűrűsége az intenzív párolgás (nincs hőbomlás!) következtében egyre nagyobb lesz, s szinte szétrobbannak a cseppek, s a szabaddá vált ionok gyorsítás után az analizátorban elválaszthatók fajlagos tömegük szerint.
ELECTROSPRAY 1-3 kv John B. Fenn- 2002 Nobel díj
Pozitív ionizáció Amin Amid Észter Aldehid/keto Negatív ionizáció Karboxil Hidroxil/fenol Imid
Pozitív ionizáció:[m+h] +, [M+Na] +, [M+CH 3 CN+H] + Negatív ionizáció:[m-h] - [M+HCOO] - Lassú áramlási sebesség < 1 ml/min Eluens ph: - Savas, a bázikus komponenseknél, pozitív módban. - Bázisos, a savas komponenseknél, negatív módban. Puffer: Illékony és kis koncentrációjú (ion szupresszió elkerülése)
Lószív mioglobin ESI tömegspektruma (M: 16955 Da) Gauss görbe
APCI Az APCI eredetileg nem ionos vegyületek vizsgálatára alkalmas ionizációs interfész. A folyadékkromatográfiás eluens molekulái ionizálódnak (pl. a vízből keletkeznek H 3 O + ), s ezek az ionok képesek protonálni (kémiai ionizáció) az eredetileg nemionos molekulákat. A keletkező pszeudo-molekulaionokat (M+H) +, (M+Na) +, (M+oldószer ionja) + és néhány fragmensét gyorsítás után az analizátor választja szét. Poláros szerves vegyületek analízise (gyógyszerek!)
APCI N2 400 0 C 3 kv
Atropin APCI tömegspektruma
MS-ANALIZÁTOROK Az analizátor választja el az ionforrásból nagy sebességgel érkező ionokat fajlagos tömegük szerint. Fajtái: 1. repülési idő (TOF: time of flight), 2. elektromos, pl. kvadrupól és ioncsapda, 3. mágneses analizátorú, 4. elektrosztatikus, 5. kettős fókuszálású (nagy felbotóképességű), 6. tandem (MS/MS, MS n ).
TOF Ha minden töltéshordozó azonos kinetikus energiára tesz szert, akkor egyszeres iontöltés esetén: zv 1 2 1 1 2 m v 2 m v 2 1 1 2 2 n n 2 2 m v Z = iontöltése V = gyorsítófeszültség v = ion sebessége t = idő L = úthossz m = tömeg t L v m z L 2Vt L 2 2 m z 2V
L repülési távolság izzó katód "üres tér" detektor minta anód U = 1-10 kv gyorsító feszültség vákuum, 10-6 -10-8 kpa Kalibrálás: pontosan ismert m/z értékű ionokra Ha L = 1m és V = 2000V, akkor t N 2 + = 8,37 μs és t O 2 + = 8,94 μs
Ioncsapda Ion Trap (IT) elektronforrás kapuelektród záró ioncsapda elektródok GC-rõl + + ++ + + központi hiperbolikus gyûrû elektród vákuum ionsokszorozó detektor
Az elektronemitterből érkező elektronok egy kapuelektródon át 50-80 ev-os energiával jutnak be az ioncsapda elektródok közé, ahová a mintát is bevezetjük. Ionizáció (EI, CI). Az ioncsapda elektródok olyan háromdimenziós teret hoznak létre, amelyben az ionok aperiodikus oszcillációra kényszerülnek, s a csapdában vannak mindaddig, amíg egy axiális amplitúdó moduláció (RF változtatása) az adott fajlagos tömegű és adott rezgésre képes iont az ionsokszorozó detektorba nem juttatja. Érzékenyebb, mint a kvadrupól. Kis helyigény. MS/MS könnyen megvalósítható.
http://www.chromacademy.com/# Ion Trap Mass Analysers - Introduction Ion Trap Scanning Experiments
Detektor A detektor fő feladata az, hogy az egyes ionok számával arányos intenzitású jelet szolgáltasson. A legelterjedtebben ion-, vagy fotosokszorozó detektorokat használunk. Az ionsokszorozók (ionmultiplierek) esetében a felfogó elektródra (dinód) becsapódó ionok elektronemissziót váltanak ki, ezek az elektronok a szemben elhelyezkedő elektródra csapódva szekunder elektronemiszsziót hoznak létre (10 6-10 8 jelerősítés).
Kvadrupól analizátorú GC-MS-DS (DS: data system, adatfeldolgozó rendszer) vázlata MS 66 GC Ionforrás Analizátor Detektor DS Vákuum rendszer
Tömegspektrométerek jellemző adatai 1. felbontóképesség, 2. tömegtartomány, 3. felvételi sebesség, 4. kimutatási határ, 5. ionátviteli hatásfok, 6. hőmérséklettartomány.
A felbontóképesség: adott tömegtartományban két egymás melletti, eltérő tömegű ion mennyire különböztethető meg egymástól. m 1 m 2 m 1 m 2 10% 50% R s m 2 m m 1 m m 100 100 100 Rs 10 0,01 100,01 100,00 100,00 99,99 4
Tömegspektrometria alkalmazása 1. gázelemzés: lámpa töltőgázok elemzése, fermentációs gázelegyek. 2. izotóparány mérés: kőzetek, ásványok, biológiai rendszerek elemeinek izotóparány meghatározása (pl. geológiai kormeghatározás, fossziliák kora). 3. szervetlen környezetszennyezők elemzése: ICP- MS. 4. szerves szerkezetvizsgálat (pontos tömegmérés, elemösszetétel, szerkezet meghatározása céljából). 5. szerves rendszerek minőségi és mennyiségi összetételének meghatározása (GC-MS, LC-MS).
Tripla kvadrupól
Mágneses szektorú
A mágneses szektor tömeganalizátor a mágneses térnek az abban mozgó ionok pályájának alakjára gyakorolt hatásán alapul. Ionsugár mágneses analizátor A V potenciállal felgyorsított, majd a H mágneses térrel m/z értékük szerint különböző rádiuszú körpályákra kényszerített ionok elválasztása kétféleképpen történhet: 1, H mágneses tér változtatása 2, Gyorsító rés V feszültségének változtatása. Mindig más m/z értékű ionokkal futtatunk be olyan körpályát, mely az analizátor kilépő réséhez vezet.