Tóth Nándor: A fehérjék fixációs immunelektroforézise A vizsgálatok időpontja: 1976 1983. Helye: Balassa János Kórház Központi Laboratóriuma (Budapest, Vas utca)
Laboratóriumi munkásságom kezdete óta (1959) érdeklődésem az elektroforézis módszereinek megismerése és gyakorlati felhasználása felé irányult. A különböző hordozók: papír- agar- agaróz, polyacrylamid- géllel nyert fehérje frakciók, lipidek, tejsavdehydrogenáz, cholinészteráz izoenzimek nagyszámú vizsgálata után következett az immunelektroforézis. Ez utóbbi eljárással kapott eredmények vizsgálata során különösen Grabar és Williams 1, valamint Backhaus 2 módszerének megismerése után, gyorsan világossá vált, hogy a polyvalens ellenanyaggal nyert fehérjefrakciók mérése quantitatíve nem értékelhető meggyőzően. Emiatt, ennek megoldására kerestem lehetőséget. A vonatkozó irodalomban megtaláltam Emidio Afonso indiai immunológus közleményét 3, amelyben olyan fehérje alakzatokra bukkantam, amelyek felkeltették érdeklődésemet az immunelektroforézis továbbfejlesztésére. Módszerének lényege: Agar-gélben a szérumfehérjék egy pontról történő elektromos elválasztása után, a polyvalens ellenanyagot felhígítva az agar felületére mérte, amely pár óra múlva, abba belediffundálva, létrehozta a kőr alakú, valamint az Ig-G-A M immunglobulinok esetén az elnyúlt precipitátumokat. Ezek nagy száma miatt nehéz volt egymástól elkülöníteni őket a 8 x 9 cm-es üveglemezen. Egy lemezen 4 szérumot vizsgált: 1 normál (egészséges) szérumot kontrollként, valamint 3 vizsgálati mintát. A vizsgált szérumok mennyisége: 4 mikroliter, a polyvalens ellenanyagé: 0,5 milliliter volt. A módszer továbbfejlesztésére az alábbi célokat határoztam meg: 1. Az eljárás legyen alkalmas: kisebb számú precipitátum kimutatására, a quantitatív mérésekre. 2. Anyagköltségek csökkentésével a gazdaságosság növelése. 3. Olyan ideális antigén-szérum arány (ekvivalencia zóna) kialakítása, melynél a megjelenő precipitátumok jól felismerhetők, jelezzék a normális, valamint a normálistól eltérő (csökkent, emelkedett) értékeket, valamint egyértelműen mutassák ki az IgG, IgA frakcióknál a fontos paraproteineket. Hosszas kísérleti időszak után egyértelművé vált, hogy az ellenanyagok rendkívül magas költségei miatt a mennyiségeket csökkenteni kell. Módszerem alkalmazása során a kivitelezéshez szükséges 50-ml agart, megfelelő puffer oldattal megfőztem, majd 53 C-ra lehűtöttem. Hozzámértem 1 ml polyvalens ellenanyagot, majd 5 darab 8x10 cm-es lemezre vízszintező asztalkán 10 ml-ként elosztottam. A lemezeken az agar-gél réteg vastagsága, e mennyiség mellett, ideálisnak bizonyult, egyrészt a vizsgálati anyagok bemérésére illetve a szükséges reservoirok készítésére. A puffer oldat konzerválására literenként 200 mg nátrium-azid-ot használtam. Ezáltal a lemezek hűtőszekrényben hetekig felhasználhatóak voltak. Ahhoz, hogy a legnagyobb mennyiségű fehérjeprecipitátumok jól elkülöníthetőek legyenek, megtaláltam azt az ideális arányt, amely lemezenként antigén esetén 0,2 mikro liternek, antitest esetén 0,2 milli liternek bizonyult. 1 Grabar P., Williams C.A., Jr.: Methode immuno.electrophoretique d analyse de substances antigeniques. Biochim.Biophys.Acta 10.193-194. o. (1953) 2 Backhausz Richárd: Immunhdiffúziós és immunelektroforézises módszerek Budapest (1968) 3 Emidio Afonso: Quantitative Immunelektrophoresis of serum Proteins- Clin. Chim. Acta 10 114-122. o. (1964) 2
Időközben már rendelkeztem a szükséges hazai gyártmányú futtató kamrákkal és egyenirányító tápegységekkel, az azóta bezárt Balassa János Kórház, ismertebb nevén a Vas utcai kórház vezetősége segítségével. További szükségletek: A vizsgálati anyag pontos méréséhez a Svájci Hamilton Bonaduz AG által gyártott 1 mikro literes,100-reszre osztott precíziós fecskendő Veronal - veronal-nátrium puffer ph 8,3, µ = 0,1 Nátrium-azid a puffer oldat konzerválásához 200 mg/l Difco-purified agar USA 1,5%-os 8x10 cm-es üveglemezek Erlenmayer lombikok Kapillárisok, pipetták Vízszintező asztalka Petri csészék, az elkészített agar lemezek tárolásához. Papír sablon, a vizsgálati minták megfelelő helyének megjelöléséhez. Macherey Nagel (továbbiakban: MN) gyártmányú 214-es számú szűrőpapír az áram agar-gélen való átvezetéséhez. 10 ml puffer oldatban feloldunk 0,5 gr brómfenolkéket, amelyet jelzőként használunk, mivel együtt halad az albuminnal. a lemezek megfestésére leginkább amidofeketét, vagy nigrozint használtam. A lemezeken 150 V feszültség és 15 ma áramerősség mellett 3 óra alatt történt meg a fehérjefrakciók szétválasztása. Ezután a lemezeket kiemeltem a futtató kamrából és vízzel átitatott MN szűrőpapírral lefedtem. 24 óra múlva a megszáradt szűrőpapírt eltávolítottam és a lemezt megfestettem. Szükség esetén a lemezek hajszárítóval rövid idő alatt festésre alkalmassá tehetők, ez által értékelésük egy munkanapon belül megtörténhet. A fehérje precipitátumok értékelése elsősorban vizuális, de a quantitatív eredmények is megállapíthatók. A kör alakban kialakult frakciók meghatározása Mancini módszerével megoldható. Az immunglobulinokat a lemez felnagyítása után, területüket lemérve, viszonyítjuk a minden lemezen megtalálható normál human szérum azonos frakciójához. A terület meghatározáshoz nagy segítséget nyújt egy magyar gyártmányú planiméter. A mért eredmények normál human szérum ismert paramétereivel való összehasonlítása lehetővé teszik a vizsgálati minta alacsony, normális vagy emelkedett értékeinek meghatározását. Történhet ez tömegmértékegységben (g) vagy tömegszázalékban. A paraproteinek esetén az agar-gél elektroforézis densitometriás értékei, valamint a kappa-lambda láncok stb. meghatározásai biztosítanak diagnosztikai jelentőségű adatokat. Természetesen tisztában vagyok azzal, hogy módszeremet, az elmúlt évtizedekben létrejött automata műszeres vizsgálatok óriási tömege, messze meghaladták. De bízom abban, hogy a szérum és más vizsgálati anyagok: plazma, sebváladékok képei, különös tekintettel a mai vizsgálatok rendkívül magas árviszonyaira, bizonyítják, hogy a manuális eljárások még szolgáltathatnak a gyakorlatban használható adatokat. Az ábrák demonstrálják az archiválás jelentőségét is. Az archiválás lehetővé teszi az adott betegséggel kapcsolatos változások megfigyelését. A következőkben, ábráim segítségével mutatom be, hogy az említett ideális antigén antitest viszonyok kialakítása mellett, a normális és kóros állapotok különbségei meggyőzően kimutathatók. 3
1. ábra A kiindulási pont: Normális és IgG paraprotein agar-gél, illetve immunelektroforézis, amelynek megváltoztatására dolgoztam ki módszeremet. 4
2. ábra Az ábra egy normális kontrol szérum (78 g/l) módszeremmel kialakított képét mutatja, amely egyben segítséget nyújt a következő ábrákon látható precipitátumok felismeréséhez. A gamma globulinok mellett a többi frakció is jól elkülönülve látható, ezáltal a jelenség a szérumfehérjék fixációs immunelektroforézisé-nek tekinthető. A kör alakú precipitátumok Mancini módszerével, a többiek egyéb eljárásokkal (pl.: planimetria) a minden lemezen megtalálható normális kontrol szérum képével összehasonlítva quantitatíve is értékelhetők. Egy lemezen általában 7-10 vizsgálati szérumot és 1-3 normál kontrol mintát tudtam vizsgálni. 5
3. ábra Az ábrán hét vizsgálandó szérumminta és három normál humán szérum képe látható. A vizsgált minták mennyisége: 0,2 μl. 1. Emelkedett α1 antitrypszin, csökkent transzferrin 3. IgA paraprotein 5. IgG paraprotein 7. Csökkent albumin, emelkedett IgG 8-9-10. Normál humán szérum 0,1 0,15 0,20 µl mennyiségei 6
4. ábra A kilenc vizsgálati minta számos tanulsággal szolgál. 3. Szülő anya emelkedett transzferrin szint 4. Újszülött fiú gyermekének köldökzsinór vér széruma 5. Újszülött leány köldökzsinór vér széruma. Az újszülöttek IgM frakciója nem látható, mivel magas molekula súlya miatt a placentán nem jut át az irodalmi adatoknak megfelelően. 6. Újszülött lány anyja ugyancsak emelkedett transzferrin szint 7. A gél elektroforézisen a gamma globulin normális. Míg itt az IgG jól látható kettős precipitációs zónában jelent meg. Tulajdonosa növényvédő szerrel dolgozó férfi, akinek cholinészteráz aktivitása erősen csökkent. A jelenség magyarázatát további vizsgálatok hivatottak eldönteni. 8. Súlyos, előrehaladott máj cirrhosis, kifejezetten csökkent albumin és transzferrin, extrém mértékben megszaporodott IgG és IgM frakciók. 9. Megnövekedett albumin valamint normális IgG mellett, IgG paraprotein; májtumor! 10. Normál kontrol szérum. 7
5. ábra A módszer továbbfejlesztése: A 8x10 cm-es lemezen 10 ml agar és 0,2 ml Hyland trivalens IgG, IgA, IgM ellenanyag, 20 vizsgálati anyag és 8 normál humán szérum emelkedő mennyiségekkel. Feltűnő az 5. minta IgM hiánya és az IgA csökkent mennyisége. A 7. mintán az IgM kifejezetten emelkedett mennyisége, míg a 15. mintán az IgM hiánya szembetűnő. A szérum minták mennyisége 0,2 mikroliter! 8
6. ábra A fibrinogén vizsgálata Hyland monovalens ellenanyaggal történt. A 11 vizsgálati minta mellett, látható a 12. normál plazma is. A lemezen 0,4 ml hyland monovalens, antifibrinogén ellenanyag, 0,4 mikroliter plazma, illetve szérum szerepel. A fibrinogén, az α és β globulinok, mint acut fázis fehérjék, valamint a paraproteinek felszaporodása fokozzák a vörösvértestek süllyedését. De többek között fontos szerepe lehet a szívizom infarctus kialakulásában is. A 13-14-15 minta szérum mintákat tartalmaz, kicsapódás nem keletkezhetett, mert a szérumban nincs fibrinogén. 9
1 2 3 4 5 6 7 8 7. ábra Az ábrán elhelyezkedő 8 tárgylemezen agar gél elektroforézissel láthatók a paraproteinémiás szérumok. Mindegyik mellett biztosítva az összehasonlíthatóságot, látható egy normál humán szérum képe is (jobb oldalon kivétel a 7. számú, ahol nincs normál szérum és a 4., ahol a baloldali a normál humán szérum). 1. Ig A paraprotein 2. Ig G paraprotein 3. Ig G paraprotein 4. Ig G paraprotein 5. Ig A paraprotein 6. Ig G jelzett paraprotein 7. Ig A paraprotein (Ugyanazon személy két mintája) 8. Erősen megszaporodott Ig G frakció. 8 a. ábra Az ábrán a kóros minták (1-8) Hyland trivalens ellenanyaggal készült IgA, IgM, IgG frakciói láthatók A jobb láthatóság kedvéért a lemezeken 0,5 µl szérumot mértem. A 9-10-es számú a normál szérum képét mutatja, előbbi 0,25 µl, utóbbi 0,5 µl mennyiséggel. 10
8 b. ábra A 8 a és a 8 b ábrán ugyanazok a szérumok szerepelnek, de a 8 b ábrán a szérumok monovalens lambda-lánc ellenanyaggal kezelt képei láthatók. Sajnos abban az időben, amikor a vizsgálatok folytak kappa-lánc ellenanyagot beszerezni nem tudtam. Célszerű lenne ezen a területen is vizsgálatokat folytatni. * A következőkben röviden arról szólok, hogy e vizsgálatot addig ismeretlen területre is kiterjesztettük: a lábszár fekélyek sebváladékának tanulmányozására. Amikor eljárásom már a kórház napi gyakorlatában is helyet kapott, néhai Dr. Mester Endre sebész professzor, aki akkor az Orvos Továbbképző Intézet Lézer Kutató Csoportjának vezetője volt, azzal a megtisztelő ajánlattal keresett fel, hogy a lábszárfekélyek lézer sugárral történő kezelése előtt és után nézzük meg a sebváladékok fehérjéinek immunológiai állapotát. 11
9/a ábra A feladat végrehajtásához meg kellett oldani a minta nyerésének módját és fehérje tartalmának meghatározását. Hematokrit vagy nagyobb méretű kapilláris csővel egyszerű volt a minta biztosítása. A cső egyik végének lezárása és centrifugálása után rendelkezésre állt a vizsgálatokhoz szükséges tiszta felül úszó anyag. A fehérje koncentráció sűrűsége lézerkezelés előtt 2,8-4,5 g/l, lézerkezelés után 5,0-6,0 g/l. Lemezünkre a sebváladékokból 0,4 mikro litert mértem ki, és a korábbiakban leírtaknak megfelelően végrehajtottam az elektroforézist. A változások leméréséhez a kezelés előtti és utáni értékek összehasonlítása adott lehetőséget. Összesen 20 személy, több alkalommal vett sebváladékának mérésével megállapítottuk, ez egyes fehérjefrakciók mennyiségi értékeinek szembetűnő szaporodását, mint a lézersugár biostimulatív hatásának bizonyítékát. Ezen tapasztalatainkról több helyen beszámoltunk. 4 5 6 4 E. Mester, N. Tóth, Zs. Járányi: Die biostimulierende Wirkung der Laserstrahlen auf die wichtigsten Wundsekret nachweisbaren Eiweissfraktionen. Laser in der Medizin (Berlin, 1981) 46-47.o. 5 E.Mester, L. Hazay, M. Fenyo, I. Kertész, N. Toth, Z. Járányi, J. Tóth: The Biostimulating Effect of Laser Beam. Optoelectronics in Medicine (Proceedings of the 5th International Congress,Springer Verlag Berlin-Heidelberg, New York, 1981) 146-152.o. 6 Endre Mester, Nándor Tóth and Ádám Mester: The biostimulative effect of beam (The 4th congress of the International Society for laser surgey,tokyo 1981) 22-27.o. 12
3 4 5 6 Lézer előtt Lézer után Lézer előtt Lézer után 9/b. ábra 9/c. ábra 7 8 9 10 Lézer előtt Lézer után Lézer előtt Lézer után 9/d. ábra 9/e. ábra Standard normál szérum 9. ábra A sebváladékok immunelektroforézissel előállított képei * Az immunelektroforézis alakulását, fejlődését később különösen a számítógép adta lehetőségeken belül igyekeztem figyelemmel kísérni. Mivel módszeremhez hasonló kivitelezést és ábrázolásmódot eddig nem találtam, bátorkodtam, ha 30 évvel később is, nyilvánosságra hozni. Tettem ezt abban a reményben, hogy manuális eljárásomnak a mai vizsgálati árak mellet még mindig lehet gyakorlati jelentősége. Az újabb fertőző betegségek előfordulása miatt a módszer egyszerűsége és rendkívüli gazdaságossága mellett, alkalmas lehetne a nagyon hiányzó tömeges immunológiai szűrővizsgálatokra. Budapest, 2015. március 9/f. ábra A szerző elérhetősége: Dr. Tóth Nándor, dr.tothn@t-online.hu 13