Gluténmentes termékek vizsgálata a cöliákia és a gabonaallergia szempontjából Takács Krisztina 1, Kovács Erzsébet T. 2, Gelencsér Éva 1 1 Központi Élelmiszer-tudományi Kutatóintézet 2 Szegedi Tudományegyetem, Mérnöki Kar Campden rendezvény, Budapest, 2011. március 25. Élelmiszer okozta káros reakciók Nem toxikus Toxikus Immunmediált Nem-immunmediált IgE-mediált Nem-IgE-mediált Enzimatikus Farmakológiai Valódi táplálék allergia Gabonaallergia autoimmun betegség Cöliákia Egyéb, nem ismert 1
Gabona allergia = cöliákia -- patomechanizmus ismert - I. típusú allergiás reakció - időleges (az élet folyamán elmúlhat) - nem minden glutén tartalmú gabona tiltott - Prolamin szupercsalád 2S albumin tartalék fehérje család Nem-specifikus lipid transzfer fehérje család Gabona eredetű a-amiláz/tripszin inhibitor család Gabona eredetű prolamin család (pl. búza, rozs, árpa, zab glutén) (pl. kukorica glutén) tünetek - patomechhanizmus nem ismert -IV. típusú allergiás reakció (T-sejt- mediált) - egy életre szól - életreszóló glutén-mentes diéta - búza, rozs, árpa, zab glutén Gabonák közötti rokonsági fa Törzs Zárvatermők Osztály Egyszíkűek Kétszíkűek Rend Pázsitfűfélék Szegfűfélék Búza Rozs Árpa Tritikálé Zab Kukorica Rizs Hajdina Amaránt Keresztreakció! 2
Glutén fogalma Olyan fehérjefrakció, amely nem oldódik vízben és 0,5 M NaCl oldatban. Gabona fehérjék Albuminok (vízoldhatóak) Globulinok (sóoldhatóak) Glutén Prolaminok (alkohol oldhatóak) Gluteninek (sav/lúg oldhatóak) Búza gliadin; Rozs secalin Árpa hordein; Zab avenin; Kukorica - zein Diagnózis gabonaallergia IgE cöliákia Glutén + ttga Aktivált T-sejtek a-glutén és a-ttga IgG, IgA -vérvizsgálat (ellenanyag kimutatása) allergén-specifikus IgE (RAST) össz. IgE (ELISA) -vérvizsgálat (ellenanyag kimutatása) IgA endomysium ellenanyag (EMA) IgA szöveti transzglutamináz ellenanyag Gliadin-specifikus IgA és IgG -allergiás bőrteszt -ételprovokációs vizsgálat -ismételt jejunális biopszia (3x-4x) 3
40/2008 (IV.3.) FVM-EÜM-GKM Glutént tartalmazó gabonák: búza, rozs, árpa, zab, tönkölybúza, ezek hibrid változatai és Ezekből készült termékek JELÖLÉSKÖTELEZETT ALLERGÉNEK Gluténmentes élelmiszer ALINORM 08/31/26 Búzából, egyéb Triticum fajokból (rozs, árpa), zabból, vagy ezek hibridjeiből 1 vagy több alkotót NEM tartalmazó élelmiszerek, amelyek glutén tartalma nem több, mint 20 mg/kg. Búzából, egyéb Triticum fajokból (rozs, árpa), zabból, vagy ezek hibridjeiből 1 vagy több alkotót tartalmazó élelmiszerek, melyekből a glutént kivonták, és így glutén tartalma nem több, mint 20 mg/kg. Csökkentett glutén tartalmú élelmiszer Búzából, egyéb Triticum fajokból (rozs, árpa), zabból, vagy ezek hibridjeiből 1 vagy több alkotót tartalmazó élelmiszerek, melyekben a glutén tartalom csökkentve lett, és glutén tartalmának 20-100 mg/kg közé kell esnie. 4
Gluténmentes termékek előállítása Előállításuk/fejlesztésük a technológusok számára nagy kihívás, de szükséges Állatmodellek hiánya Etika Jelenleg a piacon kapható választék csekély Néhány közülük alacsony minőségű Drága Cél: termék minőségének javítása cöliákiáért felelős fehérjék/peptidek detoxikálása Gluténmentes termékek előállítása Alapanyagok Jó tápértékű (pszeudo)gabonák: amaránt, hajdina, köles, quiona, barna rizs, cirok Hüvelyesek: borsó, szója Adalékanyagok Hidrokolloidok: Fehérjék: Enzimek: hidroxipropil-metil-cellulóz karboxi/metil-cellulóz guar gumi xantán pektinek tejpor (laktóz intolerancia!) tojás (allergizálhat!) ciklodextrin glikozil transzferáz glükóz oxidáz transzglutamináz 5
Gluténmentes termékek előállítása Transzgén technológia Tejsavbaktériummal és élesztővel történő fermentáció Epitópok maszkírozása enzimes keresztkötéssel Száraztészta modellek előállítása, frakcionálása és jellemzése Liszt Víz TG Keverés Enzim hatás (30, 60, 150 ) Tészta formázása Szárítás: -39 o C, 24 óra, 89% -Szobahőm., 48 óra Főzési és érzékszervi tulajdonságok vizsgálata Őrlés Szitálás (<250 µm) Frakcionálás (Feillet et al. 1977): víz- és sóoldható f.: 0,5 M NaCl alkohol oldható f.: 68% etanol sav/lúgoldható f.: β-merkaptoetanol tart. borát-puffer (ph 10) SZTE, Mérnöki Kar 6
Transzglutamináz enzim működése H 2 N (CH 2 ) 4 CH COOH NH 2 lizin + TG O=C CH 2 CH 2 CH COOH NH 2 NH 2 glutamin a fehérje láncok közötti kovalens kötés kialakítása Cél: kiváló minőségű, hipoallergén termék előállítása Tészták jellemzése Legjobb érzékszervi és főzési tulajdonságot együttesen biztosító optimális enzim-dózis: T. aestivum búzaliszt alapú: 60 mg TG/kg liszt T. durum búzaliszt alapú: 20 mg TG/kg liszt Sárgaborsóliszt alapú: 140 mg TG/kg liszt 7
Enzimhatás kimutatása - SDS-PAGE és immunblot 15%-os SDS-PAGE gél Fehérje elválasztás PVDF membrán Immunfestés Enzim szubsztrátja konjugátum humánszérum Búza alapú tésztamodellek frakciói T. aestivum-alkohol alkohol frakció Mw (kda) 185 98 52 31 19 17 11 6 3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 T. aestivum-sav/lúg sav/lúg frakció Mw (kda) 185 98 Mw (kda) 185 98 52 31 19 17 11 6 3 Mw (kda) 185 98 T. durum-alkohol frakció 1 2 3 4 5 6 7 8 9 T. durum-sav/lúg frakció 1. Natúr 2. 100 mg/kg TG, 30 3. 100 mg/kg TG, 60 4. 100 mg/kg TG, 150 5. 150 mg/kg TG, 60 6. 150 mg/kg TG, 150 7. 200 mg/kg TG, 30 8. 200 mg/kg TG, 60 9. 200 mg/kg TG, 150 52 52 31 19 17 11 6 3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 31 19 17 11 6 3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 8
Glutén kimutatás (ALINORM 08/31/26) immunológiai módszer ellenanyagnak reagálnia kell a toxikus gabonafehérjékkel és nem keresztreagálhatnak más gabonafehérjékkel és egyéb élelmiszer, valamint élelmiszeralkotó komponensével módszer validálása, referencia standard detektálási határ 10 mg glutén/kg, vagy annál kevesebb R5-ELISA Glutén kimutatása Polikl.eag. alapú Monokl. eag. (ω-gliadin)alapú Monokl. eag. (R5 gliadin-epitóp) alapú Kompetitív indirekt ELISA Saját fejlesztés direkt szendvics ELISA immunkromatográfia elvén működő gyorsteszt Kereskedelmi forgalomban kaphatók (Félkvantitatív, kvalitatív) 9
Cég /Kit név Detektálás Méréshatár ImmunoLab GmbH 4 ppm gliadin 4-400 ppm gliadin Poliklonális Gluten ELISA Test (8 ppm glutén) (8-800 ppm glutén) KÉKI módszer 1-1000ppm gliadin Monoklonális omega Monoklonális R5 G12 Kereskedelmi forgalomban lévő kitek R-Biopharm Ridascreen Gliadin R-Biopharm Ridascreen Fast Gliadin Tepnel GLuten Assay kit Tepnel Gluten Rapid Kit Diffchamb Transia Plate-Gluten Diffchamb Transia Plate-Prolamins Operon Stick Gluten R-Biopharm Rida Quick Gliadin Ingenasa Ingezim Gluten (3.0.GLU.K.2) Neogen Alert for Gliadin Neogen Veratox for gliadin Biomedal Diagnostics Glutentox ELISA (komp.) 1,5 ppm gliadin 5-80 ppb gliadin (3 ppm glutén) 5 ppm gliadin 10-80 ppb gliadin (10 ppm glutén) 1 ppm gliadin 10-200 ppm gliadin (2 ppm glutén) 100-200 ppm glutén - 5 ppm gliadin 5-.. ppm gliadin (10 ppm glutén) (10- ppm glutén) 1,5 ppm gliadin Certified Eureopean gliadin (3 ppm glutén) st. 1,5 ppm gliadin 2-2000ppm gliadin (3 ppm glutén) 2,5 ppm gliadin alatt a minta negatív 1,5 ppm gliadin (3 ppm glutén) 10 ppm gliadin (20 ppm glutén) 3 50 ppm glutén 2,5-25 ppm gliadin (5-50 ppm glutén) - Glutentox standard 7,5-120 ng/ml gliadin A glutén kimutatás nehézségei Glutén tartalom mérése gliadin meghatározáson alapszik Több specificitású és érzékenységű módszer létezik (Mit kell detektálnunk pontosan?) Kalibráció reproduktatív felvétele Gliadinok extrahálása Hőkezelés hatása Egyéb technológia kezelés hatása 10
Gluténmentes diétába illeszthető termékek?! ppm 60000 50000 40000 30000 20000 10000 0 1. 2. 3. 4. T. aestivum T. durum 5. 6. 7. 8. 9. 10. Kompetitív indirekt ELISA ppm 60000 50000 40000 30000 20000 10000 0 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Szendvics ELISA (Tepnel) 8. 9. 10. 1. Natúr 2. 100 mg/kg TG, 30 3. 100 mg/kg TG, 60 4. 100 mg/kg TG, 150 5.150 mg/kg TG, 30 6. 150 mg/kg TG, 60 7. 150 mg/kg TG, 150 8. 200 mg/kg TG, 30 9. 200 mg/kg TG, 60 10. 200 mg/kg TG, 150 A TG enzimmel előállított búzaliszt alapú tésztát a cöliákiás betegek NEM FOGYASZTHATJÁK! A TG enzimmel előállított sárgaborsóliszt alapú tésztából cöliákiás betegek számára diétás élelmiszert lehetett előállítani! ω-gliadin mérésen alapuló módszer (Skerrit és Hill,1991) AOAC ajánlása ω-gliadin frakció elleni ellenanyag >= 150 ppm glutén mérési határ Nyers és hőkezelt élelmiszerek kimutatására Előnye: ω-gliadin frakció nem denaturálódik 40%-os etanolos extrakció Hátránya: árpa prolaminokra fals negatív eredményt ad (alábecsül), hidrolizált glutént nem tud mérni, gluténtartalmat -40től +80%-ig alá/felébecsüli 11
R5-gliadin-epitóp mérésen alapuló módszer Codex Alimentarius Commission ajánlása Rozs szekalinok ellen termelt ellenanyag (Mendez et al., 2001) Felismeri a QQPFP pentapeptid szekvenciákat és a homológ szekvenciákat (QQQFP, LQPFP, QLPFP) főleg a γ és ω-típusúakban (Osmann et al, 2001) 5 ppm a mérési határ Nyers és hőkezelt élelmiszerek kimutatására Koktél (extrakciós összetevők mixe) előnye: QQPFP hőre rezisztens; felismeri a búza gliadinok-, árpa hordeinek-, és rozs szekalinok összes frakcióját R5-gliadin-epitóp mérésen alapuló módszer (Mendez et al., 2001) Hátránya: árpa prolaminokra fals pozitív eredményt ad (felbecsül) PWG-gliadin standard használata esetén, hidrolizált glutént nem tud mérni PWG- referencia anyag használata standardként, így valójában csak a búza kontamináció kimutatására alkalmas Az őrlést követő 1 heti tárolás után a minták eltérő eredményt adtak (R5-ELISA) az őrlés után rögtön lemért mintákhoz képest! Szójaminta etanolos extrakció után 100 ppm-hez közeli gluténtartalmat mutatott, míg koktél-oldattal adott ugyan reakciót, de a kimutatási határ alatt volt.(?) 12
G12-ellenanyag alapú ELISA (Morón et al, 2008) Legújabb fejlesztés; kevés információ 33-mer felismerésére képes( toxikus gliadin fragment) A 33-mer egyik peptidrésze (QPQLPY) ellen termeltett ellenanyaggal dolgozik Hidrolizált, hőkezelt élelmiszerek mérésére alkalmas Szóját nem méri (kiküszöböli az R5 hibáját) Patogenitást okozó zab fajtákat képes kimutatni 6*10 4 szer érzékenyebb mint az R5 ellenanyag Következtetések Az élelmiszer antigének molekuláris befolyásolja a patológiai immunválasz minőségét szerkezete Szükség van egy megbízhatóbb szolgáló specifikus módszerre glutén detektálására A gluténmentes bővíthető diétába illeszthető termékválaszték 13
Köszönöm a megtisztelő figyelmüket! 14