A gluténtartalom mérésének lehetőségei, mérési bizonytalanság

Átírás

1

2 Program

3 A gluténtartalom mérésének lehetőségei, mérési bizonytalanság Szigeti Tamás János Üzletfejlesztési és értékesítési igazgató WESSLING Hungary Kft. Budapest

4 Lisztérzékenység A gyermekkorban kialakuló cöliákiát az angol Samuel Gee írta le először 1888-ban, a felnőttkoriról pedig 1932-ben egy dán orvos, Hess-Thysen számolt be. Samuel Jones Gee ( )

5 Lisztérzékenység Cöliákia vagy coeliakia, (állandó gluténérzékenység, gluténszenzitív enteropátia, glutén-intolerancia), az egész szervezetet érintő autoimmun-betegség, táplálkozás-élettani zavar. A betegek az étrendben a gliadin jelenlétére érzékenyek. Kiváltói a kalászos gabonafélékben lévő sikér (glutén) egyik fehérjecsoportját képező, gliadinok, amit az ember normálisan az étkezései során fogyaszt el. A lisztérzékenység leggyakoribb formájában glutén fogyasztása hatására a vékonybél nyálkahártyája súlyosan károsodhat, ami emésztőrendszeri panaszokat és súlyos tápanyag-felszívódási zavarokat okoz. Kezelés: kizárólag gluténmentes diétával lehetséges, A diétát egész életen át kell folytatni. A népesség 1-2%-a érintett Magyarországon;

6 Lisztérzékenység Lisztérzékenység: a népesség 1-2%-a érintett Magyarországon; Glutén immunreakciók székletből: a népesség 30 40%-ánál; A diabétesz (1) és a cöliákia esetszáma azonos ütemben emelkedik; Okok: - Megnövekedett gabonafogyasztás, a régi időkhöz képest nagyobb gluténterhelés; - Kenyérgabona-ősök: A-, B- és D-genomok (D-genom: kevés α-gliadint termel), - A korszerű gabonafajták főként a D-genomok tulajdonságait hordozzák; - Gliadinok: α -, β-, γ- és ω-gliadin; A tönkölybúza "A+B+D" genomú gabonaféle nem ajánlható gluténérzékenyeknek, mert igen nagy a glutén tartalma! (Vincentini O, Maialetti F, Gazza L, Silano M, Dessi M, De Vincenzi M, Pogna NE. Environmental factors of celiac disease: cytotoxicity of hulled wheat species Triticum monococcum, T. turgidum ssp. dicoccum and T. aestivum ssp. spelta. J Gastroenterol Hepatol Nov;22(11): ).

7 Gliadinok Gliadinok: glikoproteinek (a szénhidrát és a fehérje együtt) A glutének egyik, 40-70%-os alkoholban oldható alkotórészei; Prolinban és glutaminban gazdag polipeptidek (prolaminok); Gliadinok találhatóak búzában és más gabonafélékben, köztük zabban, rozsban, árpában, kölesben, kamutban;

8 Tritikále, kamut, zab, árpa, rozs

9 A gliadin aminósav-szekvencája

10 A gliadinok aminósav-szekvencájának részletei 31 LEU-GLY-GLU-GLU-GLU-PRO-PHE-PRO-PRO-GLU-GLU-TYR-PRO- GLU-PRO-GLU-PRO-PHE LEU-GLY-GLU-GLU-GLU-PRO-PHE-PRO-PRO-GLU-GLU-PRO-TYR PRO-GLU-PRO-GLU-PRO-PHE-PRO-S-GLU-GLU-PRO-TYR 55 Az α-gliadin peptidek azon szakaszai, amelyek a cöliákia kialakulásáért felelősek. A gliadinok ezen szakaszai a HLA-DQ2 antigén-felismerő rendszerhez kapcsolódva válthatják ki a lisztérzékenység (glutén-érzékenység, cöliákia) tünetegyüttesét. A lisztérzékeny egyén főként a-gliadin fogyasztása révén súlyos egészségkárosodást szenvedhet. A CÖLIÁKIÁS EGYÉNEK ÉLELMISZEREIT ELLENŐRIZNI KELL!

11 α-gliadin DQ2 kötőhelyei Az α-gliadin (baloldal) és a DQ2 szerotípus csoport H-hidas kötései. A HLA-DQ2 antitest felismerő rendszeren belül többek között a DQ2 szerotípus felelelős a lisztérzékenység kialakulásáért. A számok az atomok közötti kötési távolságot jelölik Å-ben.

12 Gliadin + Glutenin (búzában kb %) Gliadin Glutenin

13 Gliadin + Glutenin = Glutén (vízzel: sikér) A glutén térszerkezetes hálózatot alkot

14 A gabona-laboratóriumok egyik alapvető műszere A sikér a dagasztás során vízben oldhatatlanná válik.

15 Köles és amarant nem tartalmaznak gliadinokat

16 Codex Alimentarius Standard (1979; 1983; 2008)

17 Gluténmentes élelmiszerek Gluténmentes diétás élelmiszerek a) csak egy vagy több összetevőből álló élelmiszer, amely nem tartalmaz búzát, illetve az összes Triticum fajokat (pl. durumbúzát, tönkölyt, kamutot, rozsot, árpát, zabot, vagy keresztezett fajtákat) és a glutén mennyisége nem haladja meg a 20 mg/kg szintet, vagy b) amely egy vagy több összetevőből áll búzából és egyéb Triticum fajokból származó anyagot tartalmaz, amelyből 20 mg/kg szint alá távolították el a glutént; <20 mg/kg

18 Alacsony gluténtartalmú élelmiszerek Nagyon alacsony gluténtartalmú élelmiszerek Olyan élelmiszerek, amelyekben egy vagy több összetevő búzából, illetve bármely Triticum fajból (pl. durumbúzából, tönkölyből, kamutból, rozsból, árpából, zabból, vagy keresztezett fajtákból) származik. A glutén-tartalmat különleges eljárással 20 és 100 mg/kg szint közé csökkenttették: 20< és <100 mg/kg

19 A Bizottság 41/2009 EK rendelete

20 A Bizottság 41/2009 EK rendelete 3. cikk Gluténérzékenyeknek szánt élelmiszerek összetétele és címkézése (1) Gluténérzékenyeknek szánt élelmiszerek, amelyek egy vagy több olyan, búzából, rozsból, árpából, zabból, vagy ezeknek a keresztezett változataiból készült összetevőt tartalmaznak vagy ezekből állnak, amelyeket különleges eljárással úgy állítottak elő, hogy a gluténtartalmat csökkentsék, nem tartalmazhatnak 100 mg/kg-ot meghaladó szinten glutént a végső fogyasztó számára értékesített élelmiszerben. (2) Az (1) bekezdésben szereplő termékek címkézése, kiszerelése és reklámozása során fel kell tüntetni a nagyon alacsony gluténtartalmú kifejezést. A gluténmentes kifejezés akkor tüntethető fel, ha gluténtartalmuk a végső fogyasztó számára értékesített élelmiszerben nem haladja meg a 20 mg/kg-ot. (3) A gluténérzékenyeknek szánt élelmiszerekben található zabot olyan speciális módon kell előállítani, elkészíteni és/vagy feldolgozni, hogy a búzával, rozzsal, árpával, vagy ezek keresztezett változataival való szennyeződést elkerüljék, és az ilyen zab gluténtartalma nem haladhatja meg a 20 mg/kg-ot. (4) A gluténérzékenyeknek szánt élelmiszerek, amelyek egy vagy több olyan összetevőt tartalmaznak vagy ezekből állnak, amelyek a búzát, rozst, árpát, zabot vagy ezek keresztezett változatait helyettesítik, nem tartalmazhatnak 20 mg/kg-ot meghaladó szinten glutént a végső fogyasztó számára értékesített élelmiszerben. E termékek címkézése, kiszerelése és reklámozása során a gluténmentes kifejezést kell feltüntetni

21 Hőkezelés hatása a gliadinok kimutathatóságára A gliadinok kimutathatósága hőterhelés hatására csökken. Ez összefügg a gliadinok hő hatásra bekövetkező denaturációjával, degradációjával, aggregációjával, ami alapvetően megváltoztatja az oldhatóságot. A, hőkezelt lisztekből 40 %-os etanollal több kivonat nyerhető, mint 70 %- os etanollal. Dr. Horacsek Márta: A gliadin kimutatása élelmiszerekben. Országos Élelmezés- és Táplálkozástudományi Intézet, PhD tézisek.

22 Part pro million: ppm = 1 : (mg/kg) Gluténből 20 mg/kg, azaz 20 ppm mennyiséget megbízhatóan kell tudni kimutatni!. Part pro million = Egy a millióhoz (egy millió részből egyetlen rész)

23 A gluténtartalom ellenőrzésének gyakoribb módszerei Elválasztási módszerek: Detektálás: - Gél-elektroforézis (Dr. Horacsek Márta PhD tézisek, 1995.); - Gélkromatográfia, gélszűrés, méretkizárásos kromatográfia; - Immun assay; - Enzim Linked Immun Sorbent Assay ELISA (hagyományos, kompetitív); - Surface Plazmon Resonance Spectroscopy SPRS; - UV - FLD - MS (kapcsolt technikák) - Röntgen-diffrakcós eljárások

24 Néhány analitikai eljárás rövid vázlata

25 Immunkromatográfiás tisztítás 1/2 A keresett vegyület, most: gliadin A minta valamely szennyezője

26 Immunkromatográfiás tisztítás 2/2 Mosás Eluálás

27 Immun assay 1/5 Fehérje-molekulák Egyéb részecskék Immun-assay felület

28 Immun assay 2/5

29 Immun assay 3/5 Antitesteket tartalmazó reagens

30 Immun assay 4/5

31 Immun assay 5/5 A Fehérjék mennyiségi és minőségi meghatározása

32 Gél-elektroforézis 1/5 Mikrofecskendő Minta oldata a fecskendőben Hordozólap Poliamid réteg

33 Gél-elektroforézis 2/5 a minta felvitele

34 Gél-elektroforézis 3/5 Futtatás Poliamid gél réteg Felvitt minták

35 Gél-elektroforézis 4/5 Futtatás Std 1 Std 2 Std 3 Minta 1 Minta 2 Minta 3

36 Gél-elektroforézis 5/5 Futtatás Futtatás vége Ismeretlen komp. Glutén (gliadin) Rf 3 Rf 2 Rf 1 Start Std 1 Std 2 Std 3 Minta 1 Minta 2 Minta 3

37 Poliakrilamid gél és annak elektronmikroszkópos képe SDS-PAGE, Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis.

38 A kromatográfia elve Kolonna Komponens A Komponens B Dt Relatív retenciós idő

39 Kromatográfiás elválasztás molekulaméret alapján t R << t R

40 Surface Plazmon Resonance Spectroscopy SPRS 1/3 Prizma Elektromágneses hullámok Dielektrikum Y Y Y Y Y Y Y Y Fémlemez (arany) M i n t a t é r Rögzített antitestek

41 Surface Plazmon Resonance Spectroscopy SPRS 2/3 Beeső fénysugár Visszavert fénysugár Y Y Y Y Y Y Y Y

42 Surface Plazmon Resonance Spectroscopy SPRS 3/3 Beeső fénysugár D Y Y Y Y Y Y Y Y

43 Eva Engvall: az ELISA elvének megalkotója Ph Doctor 1975-óta a Stockholmi Egyetemen. Később posztgaduális munka Hhelsinkiben, majd a City of Hope National Medical Center in California. Hatékony kutatógárdát szervezett; 1979: Burman Institute Research Stockholm 1994: Tiszteletbeli orvos-doktor: Koppenhágai Egyetem; Az ELISA elvét 1971-ben publikálta Peter Perlmann-nal a Stockholmi Egyetemen.

44 ELISA plate vázlatos képe (48 vájulattal)

45 ELISA plate egy vájulat sémája A polisztirol lemezhez antitesteket ( Y ) kötnek Y

46 ELISA plate szendvics elrendezés Y Y 2. Újabb antitesteket adnak az oldathoz 3. Enzimhez kötött antitestet adnak az oldathoz Y U Y U U U Y 1. A minta kötődik az antitesthez

47 ELISA plate szendvics elrendezés 4. A hozzáadott szubsztrát optikailag mérhető változást szenved U Y Y

48 ELISA plate (48 vájulattal, pozitív mintákkal)

49 Jelnagyság ELISA mérőgörbék (kalibrációs görbék) Hagyományos ELISA mérőgörbe Kompetitív ELISA mérőgörbe mg/kg (ppm)

50 Gyakoriság Mérési bizonytalanság Ha a mérési eredmények sokasága normális eloszlású: A gyakoriság görbéje egy Gaussfüggvénnyel írható le Szórás (σ; s)

51 Mérési eredmények valószínűsége Carl Friedrich Gauss (Gauß) (1777. április február 23.) német matematikus és természettudós.

52 Következtetés a tétel minőségére Hibaterjedés a mintavételtől a vizsgálati eredményig 1/2 Alapsokaság (tétel) Mintavételi hiba Minta Minta-előkészítés Minta-előkészítés hibája Laboratóriumi minta Vizsgálati jegyzőkönyv Analitikai mérés Mérési hiba

53 Hibaterjedés a mintavételtől a vizsgálati eredményig 2/2 + + = Mintavételi hiba Előkészítési hiba Mérési hiba A teljes folyamat hibája (bizonytalansága)

54 Sávszélességek (intervallumok) Detektált mennyiség Mérési bizonytalanság alsó méréshatár A mérés alsó határával együtt nő az a sávszélesség, amely a valószínűsíthető eredményt magában foglalja. érzékenység

55 Mérési eredmények valószínűsége Normális eloszlás (Gauss-eloszlás) 99% -5σ -4σ -3σ -2σ -1σ +1σ +2σ +3σ +4σ +5σ Várható érték

56 Mérési eredmények valószínűsége f(x) = 1 A teljes haranggörbe alatti terület 100%, azaz egységnyi Fizikai mérés eredménye sohasem lehet nulla! Ebből következik: -5σ -4σ -3σ -2σ -1σ +1σ +2σ +3σ +4σ +5σ Várható érték

57 Valódi érték Alsó méréshatár (LOQ a nullától mérhető távolság ) Az alsó méréshatár (LOQ) sohasem lehet nulla, így amennyiben a várható érték zérus, azt csak ésszerű technikai feltételek biztosításával lehet megközelíteni!

58 Döntési modellek 1/2 Döntés: szabad választás legalább 2 cselekvési lehetőség között. Döntési helyzet: amikor a döntést hozó legalább két cselekvési változat közötti választás problémájával áll szemben. Döntési helyzet elemei: Döntéshozó (egyén v. csoport) Stratégiák (cselekvési változatok) Tényállapotok (a cselekvési változat következményeire hatással vannak) Eredmény (stratégia és tényállapot következménye) Döntési kritériumok (előírások, amely megmondják, hogyan használjuk fel az előbbi információkat a döntési változat kiválasztására.)

59 Döntési modellek 2/2 1. Biztos döntés : biztosan tudjuk, melyik következmény lesz az eredmény 2. Bizonytalan döntés: nem ismerjük a tényállapotok (következmények) valószínűségeit 3. Kockázatos döntés: a legtöbb valóságos döntési probléma ide tartozik (ismerjük a következmények valószínűségeit ne feledjük: a lisztérzékeny egyén sorsa függ helyes döntésünktől!). Mintavétel, tételminősítés, döntés az áru sorsa felől

60 Mintavételi előírások csomagolt termékekre 1/5 A tétel csomagolási egységekből áll A vizsgálathoz szükséges elemi minták száma függ: A tétel nagyságától A kívánt, elfogadható minőségi szinttől (AQL = Acceptable Quality Level), amelyet a mintavételt megrendelő személy választhat ki ISO :1999 sz. szabvány alapján következő dia

61 Mintavételi előírások csomagolt termékekre 2/5 ISO :1999 sz. szabvány: ISO :1999 Sampling procedures for inspection by attributes -- Part 1: Sampling schemes indexed by acceptance quality limit (AQL) for lot-by-lot inspection Revises ISO :1999 Corrigendum 1 ICS Ref. No. ISO :1999/Cor.1:2001(E) Printed in Switzerland INTERNATIONAL STANDARD ISO :1999 TECHNICAL CORRIGENDUM 1 Published

62 Mintavételi előírások csomagolt termékekre 3/5 A mintázandó tétel mérete (csomagolási egység) Minta mennyisége (csomago-lási egység db) AQL = 1,0 % AQL = 2,5 % AQL = 4,0 % AQL = 10 % Megengedett hibás csom. db Minta mennyisége (csomago-lási egység db) Megengedett hibás csom. db Minta mennyisége (csomagolási egység db) Megengedett hibás csom. db Minta mennyisége (csomago-lási egység db) 2 8 Mind 0 Mind 0 Mind 0 Mind felett Megen - gedett hibás csom. db

65 Első és másodfajú hibák 1/5 A tétel valódi minősége Döntés: Megfelelő a tétel Döntés: Kifogásolható a tétel Valóban megfelelő tétel Nincs döntési hiba Másodfajú döntési hiba: Valóban kifogásolható tétel Elsőfajú döntési hiba: Nincs döntési hiba

68 Elfogadás valószínűsége Első és másodfajú hibák 4/5 1 Határérték Fals pozitív (eladói kockázat) Másodfajú hiba: β Megfelelő tétel Kifogásolt tétel 0 Fals negatív (vevői kockázat) Elsőfajú hiba: α A tétel mintájának mérési eredményei (pl µg/kg)

69 Relatív szórás % Első és másodfajú hibák 5/5 Várható érték Ismételt mérések sorszáma Megoldások a másodfajú hiba csökkentésére: Mintaszám növelésével (ennek hatására az α is csökken) Tűréshatárok csökkentésével.

70 Konfidencia-számítás (egyik a sokféle közül) ±s * t n S = szórás, t = t-táblázat értékei (student tábla), n = szabadsági fokok száma

71 Köszönöm megtisztelő figyelmüket!

72