QUANTA Lite TM h-ttg/dgp Screen 704575 In vitro diagnosztikai alkalmazásra CLIA komplexitás: Magas

QUANTA Lite TM h-ttg/dgp Screen 704575 In vitro diagnosztikai alkalmazásra CLIA komplexitás: Magas Javasolt alkalmazás A QUANTA Lite TM h-ttg/dgp Screen egy enzimhez kötött immunoszorbens vizsgálat (ELISA), amely a szintetikus, deamidált gliadin-származék peptidek (DGP) elleni, és humán szöveti transzglutamináz (httg) elleni IgA és IgG antitestek félkvantitatív kimutatására szolgál humán szérumban. Ezeknek az antitesteknek a jelenléte a klinikai eredményekkel és más laboratóriumi tesztekkel együtt felhasználható a IgA sufficiens és az IgA deficiens coeliakia (lisztérzékenység) diagnosztizálására. A teszt összegzése és magyarázata A coeliákia, vagy glutén szenzitív enteropathia egy krónikus állapot, melynek legfőbb jellemzője az intestinalis mucosa gyulladása és az epithelium jellegzetes szövettani ellapulása, ami malabsorptiós szindrómát eredményez. A betegség pontos etiológiája még nem ismert, de a gliadin, vagyis a búza gluténjének alkoholos extraktuma a nyilvánvalóan toxikus ágens. Eredetileg egy sor többszörös vékonybél biopsziára volt szükség a coeliakia és a hozzá kapcsolódó kórképek diagnózisának felállításához. Újabban szerológiai vizsgálatokat ajánlanak szűrésre glutén szenzitív enteropathia gyanúja esetén, valamint később a diéta megtartásának ellenőrzésére. 2-5 Az Europan Society for Pediatric Gastroenterology and Nutrition (ESPGAN) javasolja a szerológiai markerek használatát, mint amilyen az anti-gliadin, a reticulin és az endomysium ellenes antitestekkel együtt annak érdekében, hogy a diagnózis felállításához szükséges biopsziák számát redukálni lehessen. 6 A legutóbbi tanulmányok kimutatták, hogy a coeliakiában szenvedő betegekből származó gliadin-reaktív antitestek, a gliadin molekula nagyon korlátozott számú specifikus epitópjaihoz kötődnek 7,8. Ugyanezen vizsgálatok során az is kiderült, hogy a gliadin deamidálása, amelyet szöveti transzglutamináz enzimmel végeztek, anti-gliadin antitestek általi megnövekedett kötődést eredményezett. A fenti megfigyelések alapján, deamidált és meghatározott peptidek alkalmazásával végzett tesztek esetében kimutatták, hogy a coeliakiára vonatkozóan az utóbbiaknak nagyobb a diagnosztikai pontosságuk a standard anti-gliadin 9, 10, 11 és ttg tesztekhez viszonyítva. A glutén szenzitív enteropathiában szenvedő betegek szérumában mind a gliadin IgA, mind a gliadin IgG antitestek kimutathatók. 2,3 A veszélyeztetett populációkat érintő érzékeny szűrési stratégia magában foglalja a gliadin IgG és az IgA antitestekre vonatkozó tesztelést egyaránt, mivel a coeliakiás betegek jelentős arányban IgA-deficiensek. 12 A Gliadin IgA antitestek érdeklődésre tarthatnak számot a betegség időbeli lefolyásának követése, valamint a gluténmentes diéta betartásának megfigyelése szempontjából. 5 Az endomysialis antigént egy fehérje-keresztkötéseket létrehozó enzimmel, a szöveti transzglutaminázzal (ttg) azonosították. 13,14 A ttg alkalmazásával kialakított antigén-specifikus ELISA módszerek megbízható, objektív alternatívát kínálnak a tradicionális immunofluorescencia alapú eljárásokkal szemben, amelyekben főemlős oesophagusból készült vékony metszetek szolgálnak szubsztrátként. 13-17 Az ELISA módszer akár kis-, akár nagyszámú betegminta vizsgálatára is adaptálható. Az elmúlt két évben a humán ttg antigént képesek rekombináns technológiával előállítani. A rekombináns humán antigénnek lehetnek bizonyos előnyei, a hagyományosabb tengerimalac máj antigénnel összehasonlítva. 15,16,18 A coeliakia szerológiában két újabb fejlesztés vörösvérsejtekből izolált humán szöveti transzglutaminázt használ, a tesztek használata alkalmas az IgG osztályú szöveti transzglutamináz kimutatására. A natív humán vörösvérsejt ttg használata, a tengerimalac vagy rekombináns eredetű humán antigénhez képest a könnyű tisztíthatóságot és a preparátum baktériumtól, rovartól vagy egyéb szennyező fehérjétől való mentességének előnyét nyújtja. A humán antigén ttg ELISA tesztek, amint az ismert irodalom mutatja, a hagyományosabb tengerimalac antigénen alapuló tesztekkel összehasonlítva jól működnek. IgG osztályú gliandin antitest kitek már egy ideje használatban vannak, elsősorban IgA deficienciában szenvedő személyek meghatározásának eszközeként. Számos kutató igazolta az IgG osztályú ttg-hez kötődő antitestek kimutatásának klinikai hasznosságát. 16,18,19 Az egyik vizsgálat során a teszt érzékenysége a csak IgA antitestek esetén mért 91,8%-ról 98,5%-ra növekedett, ha az IgA és IgG eredményeket is figyelembe vették. 16 A QUANTA Lite TM h-ttg/dgp Screen egy érzékeny és specifikus szűrőteszt a coeliakia kimatatására. Lehetővé teszi a szelektíven deamidált szintetikus peptidhez, illetve a h-ttg-hez kötődő IgA és IgG antitestek egyidejű kimutatását, illetve lehetőséget nyújt az IgA deficienciával párosuló coeliakia kimutatására. A módszer elve A tisztított, szintetikus deamidált gliadin peptidek (DGP vagy gliadin II) olyan körülmények között kötődnek a polisztirol mikrotiter lemez celláihoz, amelyek az antigént natív formában megőrzik. Az előzetesen hígított kontrollmintákat és a betegek hígított szérummintáit a különböző cellákba adagolják, lehetővé téve bármely jelenlévő gliadin peptidnek és/vagy h-ttg IgA vagy IgG antitestek immobilizált antigénhez kötődését. A nem kötődött mintát lemossák és mindegyik cellához enzimjelölt anti-humán IgG és IgA konjugátumot adnak. Egy második inkubáció lehetővé teszi, hogy az enzimjelölt anti-humán IgA és IgG minden olyan, a beteg mintájából származó, antitesthez hozzákötődjön, amely korábban a cellához kötődött. Az összes megkötetlen enzimjelölt anti-humán IgA és IgG lemosása után a fennmaradó enzimaktivitást kromogén szubsztrát hozzáadásával, és a kialakuló szín intenzitásának mérésével határozzák meg. A teszt spektrofotometriával értékelhető oly módon, hogy a cellákban kialakult szín intenzitását mérjük, és a kontrollokéhoz hasonlítjuk. 1

Reagensek 1. Polisztirol mikrotiter ELISA lemez tisztított gliadin peptidekkel és h-ttg-vel bevonva (12-1 x 8 cella), tartókerettel, deszikkánst tartalmazó fóliatasakba csomagolva. 2. ELISA negatív kontroll, 1 ampulla tartósítószert és humán szérumot tartalmazó puffer, h-ttg-hez vagy a gliadin peptidekhez kötődő humán IgA és IgG antitestek nélkül, előhígítva, 1,2 ml. 3. h-ttg Screen ELISA mérsékelten pozitív kontroll, 1 ampulla tartósítószert és humán szérumot, valamint gliadin peptidekhez és/vagy h-ttg-hez kötődő IgA és IgG antitesteket tartalmazó puffer, előhígítva, 1,2 ml. 4. h-ttg Screen ELISA erősen pozitív kontroll, 1 ampulla tartósítószert és humán szérumot, valamint gliadin peptidekhez és/vagy h-ttg-hez kötődő IgA és IgG antitesteket tartalmazó puffer, előhígítva, 1,2 ml. 5. HRP mintahígító, 1 üveg rózsaszín, tartalmaz: Tris-pufferolt sóoldatot, Tween 20-at, protein stabilizátorokat és tartósító anyagokat, 50 ml. 6. HRP mosókoncentrátum, 1 üveg, 40-szeres koncentrátum - vöröses színű, tartalmaz: Trispufferolt sóoldatot és Tween 20-at, 25 ml. A hígítási javaslatok a Módszerek fejezetben találhatók. 7. HRP h-ttg/dgp IgG/IgA konjugátum, (kecske), anti-humán IgA és IgG, 1 üveg színtelen, puffert, protein stabilizátorokat és tartósító anyagokat tartalmaz, 10 ml. 8. TMB kromogén, 1 üveg, stabilizátorokat tartalmaz, 10 ml. 9. HRP stop oldat, 0,344 M kénsav, 1 üveg színtelen, 10 ml. Figyelmeztetések 1. FIGYELMEZTETÉS Ez a termék olyan kémiai anyagot (0,02% kloramfenikol) tartalmaz a mintahígítóban, a kontrollokban és a konjugátumban, amelyet Kalifornia államban rákkeltőként tartanak nyilván. 2. Az összes humán eredetű anyagot, amelyeket a kontrollok előállítása során ehhez a termékhez felhasználtak, az FDA által jóváhagyott módszerekkel ellenőrizték és negatívnak találták HIV, HBsAg, és HCV ellenes antitestekre nézve. Egy teszt módszer sem tud tökéletes bizonyosságot szolgáltatni afelől, hogy a termék mentes HIV, HBV,HCV vagy más fertőző ágensektől. Éppen ezért a h-ttg/dgp Screen ELISA mérsékelten pozitív kontroll, a h-ttg/dgp Screen ELISA erősen pozitív kontroll és az ELISA negatív kontroll potenciálisan fertőző anyagként kezelendő. 23 3. Az oldatok stabilizálására nátrium-azidot használtak. A nátrium-azid egy méreg, ami lenyelve, vagy szemen, bőrön keresztül felszívódva toxikus lehet. A nátrium-azid ólom- vagy réztartalmú vízvezetékcsövekkel reakcióba léphet, robbanásveszélyes fém-azidokat képezve. Ha a reagensek maradványait a lefolyóba önti, az azid-képződés megakadályozása céljából, öblítse le nagy mennyiségű vízzel. 4. A HRP konjugátum egy híg mérgező/korrozív vegyszert tartalmaz, ami nagy mennyiségben elfogyasztva toxikus lehet. Az esetleges vegyi égési sérülés megelőzése érdekében vigyázzon, hogy az anyag bőrre, szembe ne kerülhessen. 5. A TMB kromogén olyan irritáló anyagot tartalmaz, ami belélegezve, lenyelve, vagy a bőrön keresztül felszívódva veszélyes lehet. A sérülések megelőzése érdekében kerülje az anyag belélegzését, elfogyasztását illetve a bőrre, szembe jutását. 6. A HRP stop oldat hígított kénsav oldatot tartalmaz. Ne tegye ki bázisok, fémek vagy más olyan anyagok hatásának, amelyek savakkal reakcióba lépnek. A kénsav mérgező és maró anyag, lenyelve toxikus lehet. Az esetleges vegyi égési sérülés megelőzése érdekében vigyázzon, hogy az anyag bőrre, szembe ne kerülhessen. 7. A reagensekkel végzett műveletek során használjon megfelelő személyi védőeszközöket. 8. A kicsöppenő reagenseket azonnal fel kell takarítani. A hulladékok eltávolításakor tartsa be az összes szövetségi, állami és helyi környezetvédelmi előírást. Óvintézkedések 1. Ez a termék in vitro diagnosztikai alkalmazásra készült. 2. A rendszer egyes elemeinek más termékekkel történő helyettesítése téves eredményekre vezethet. 3. Nem tökéletes vagy hatástalan mosás, és a folyadék elégtelen eltávolítása az ELISA cellákból nem megfelelő pontosságot és/vagy magas hátteret okozhat. 4. A teszt adaptációja automatikus mintakezelő rendszerek, vagy más folyadékkezelő eszközök használatához, teljes egészében vagy részleteiben, a teszt eredményeinek eltérését okozhatja a manuális módszerekhez képest. Minden laboratóriumnak a saját felelőssége az alkalmazott automatizált rendszer validálása annak érdekében, hogy az eredmények elfogadható tartományon belül legyenek. 5. A teszt teljesítményét több tényező befolyásolhatja. Ilyen a reagensek induló hőmérséklete, a környezeti hőmérséklet, a pipettázási technika pontossága és reprodukálhatósága, a mosás és a folyadék-maradványok az ELISA lemez celláiból történő eltávolításának alapossága, a kiértékeléshez használt fotométer, illetve az inkubációs idők hossza. A kapott eredmények megbízhatóságának és reprodukálhatóságának érdekében nagy gondot kell fordítani a következetességre. 6. A protokoll szigorú betartása javasolt. 7. A mikrotiter csöveket és a deszikkánst tartalmazó, visszazárható tasakok tökéletlen lezárása az antigén degradációját, és a teszt pontosságának romlását okozza. 8. A HRP konjugátum ugyanazon csövének bizonyos idő elteltével két- vagy többszöri használata 2

elfogadhatatlanul alacsony abszorbancia értékeket eredményezhet. Fontos a HRP konjugátum kezelésére vonatkozó előírások pontos betartása, az ilyen problémák megelőzése érdekében. 9. Az eszközök és műszerek nem megfelelő tisztítása miatt a HRP konjugátum kémiailag szennyeződhet. Általánosan használt laboratóriumi vegyszerek, mint például a formalin, fehérítőszerek, alkohol vagy detergensek maradványai idővel a HRP konjugátum lebomlását okozzák. Kémiai tisztítószerek vagy fertőtlenítőszerek használata után a készülékeket és az eszközöket alaposan le kell öblíteni. Tárolási körülmények 1. A kit valamennyi reagensét 2-8 C között tárolja. Nem fagyasztható. A reagensek az előírásoknak megfelelően kezelve és tárolva a feltüntetett lejárati időn belül stabilak. 2. A fel nem használt, antigénnel bevont mikrotiter csövek a deszikkánssal együtt, a fóliatasakot biztonságosan lezárva és 2-8 C között tárolandó. 3. A hígított mosópuffer 2-8 C között tartva 1 hétig stabil. A minta vétele és kezelése Ez az eljárás szérum minták vizsgálatára alkalmas. A vizsgálandó mintákhoz azidot vagy más tartósító anyagokat adni nem ajánlott, mert ezek torzíthatják a mérési eredményeket. Mikrobiológiai szempontból szennyezett, hőkezelt, vagy látható csapadékot, szilárd részecskéket tartalmazó minta nem használható. Kerülje az erősen hemolizált vagy lipémiás minták használatát. Levétel után a szérumot az alvadéktól el kell választani. A CLSI (NCCLS) Document H18-A3 a minták tárolására a következő körülményeket javasolja: 1) Ne tartsa a mintákat 8 óránál hosszabb ideig szobahőmérsékleten. 2) Ha a vizsgálat nem végezhető el 8 órán belül, tartsa a mintákat hűtve, 2-8 C között. 3) Ha a teszt nem végezhető el 48 órán belül, vagy a minták szállítására van szükség, fagyassza le és tárolja a mintákat -20 C-on vagy ennél alacsonyabb hőmérsékleten. A lefagyasztott mintákat a kiolvasztás után, és a vizsgálat előtt alaposan fel kell keverni. 24 A teszt kivitelezése A kitben rendelkezésre álló anyagok 1 h-ttg/dgp Screen ELISA mikrotiter lemez (12-1 x 8 cella), tartókerettel 1 1,2 ml előhígított ELISA negatív kontroll (ELISA Negative Control) 1 1,2 ml előhígított h-ttg/dgp Screen ELISA mérsékelten pozitív kontroll (h-ttg/dgp Screen ELISA Low Positive) 1 1,2 ml előhígított h-ttg/dgp Screen ELISA erősen pozitív kontroll (h-ttg/dgp Screen ELISA High Positive) 1 50 ml HRP mintahígító (HRP Sample Diluent) 1 25 ml HRP mosókoncentrátum (HRP Wash Concentrate), 40-szeres koncentráció 1 10 ml HRP h-ttg/dgp IgG/IgA (HRP h-ttg/dgp IgG/IgA), (kecske), anti-humán IgG és IgA 1 10 ml TMB kromogén (TMB Chromogen) 1 10 ml HRP stop oldat (HRP Stop Solution) 0,344 M kénsav További szükséges anyagok, melyeket a kit nem tartalmaz Mikropipetták 5, 100, 200-300, és 500 µl-es mérésekhez Egyszer használatos mikropipetta-hegyek Tesztcsövek a betegek mintáinak hígításához, 4 ml térfogattal Desztillált vagy ioncserélt víz 1 l-es edény az HRP mosókoncentrátum hígításához Olyan mikrotiter-lemez leolvasó, ami képes OD mérésre, 450 nm-en (illetve 620nm-en a két hullámhosszon történő méréshez) Módszer Mielőtt hozzákezd: 1. Várjon, míg a minták és a reagensek elérik a szobahőmérsékletet (20-26 o C) és mindegyiket jól keverje meg. 2. Hígítsa a HRP mosókoncentrátumot 1:40 arányban, úgy, hogy a HRP mosókoncentrátumos üveg tartalmát 975 ml desztillált vagy ioncserélt vízhez adja. Ha nem egyszerre kerül a teljes lemez felhasználásra, kisebb mennyiséget is lehet hígítani: minden 16 felhasználandó cellánként adjon 2,0 ml koncentrátumot 78 ml desztillált vagy ioncserélt vízhez. A hígított puffer 2 8 C között tárolva 1 hétig stabil. 3. Készítsen minden egyes betegmintából 1:101 arányú hígítást, a következő módon: adjon 5 µl mintát 500 µl HRP mintahígítóhoz. A hígított mintákat 8 órán belül fel kell használni. NE HÍGÍTSA a h-ttg/dgp Screen ELISA mérsékelten pozitív kontrollt, a h-ttg/dgp Screen ELISA erősen pozitív kontrollt és az ELISA negatív kontrollt. 4. A h-ttg/dgp IgA és/vagy IgG antitestek jelenlétének vagy hiányának tetszőleges egységekben való meghatározásához használjon mindhárom kontroll méréséhez két-két cellát, és minden betegminta mérésére egy vagy két cellát. A betegmintákból párhuzamos minták (duplikátumok) meghatározását javasoljuk. 3

A teszt kivitelezése 1. A TESZT MEGKEZDÉSE ELŐTT VALAMENNYI REAGENSNEK EL KELL ÉRNIE A SZOBAHŐMÉRSÉKLETET (20-26 C). Helyezze a szükséges számú cellát/csövet a keretbe. A fel nem használt csöveket haladéktalanul tegye vissza a deszikkánst tartalmazó fóliatasakba, és zárja vissza a tasakot biztonságosan, hogy a cellák minimális ideig legyenek kitéve a párásodás veszélyének. 2. Pipettázzon 100-100 µl-t az előhígított h-ttg/dgp Screen ELISA mérsékelten pozitív kontrollból, a h-ttg/dgp Screen ELISA erősen pozitív kontrollból, az ELISA negatív kontrollból és a hígított betegmintákból a cellákba. Fedje be és 30 percig szobahőmérsékleten inkubálja a lemezeket, egy vízszintes felületen. Az inkubációs idő az utolsó minta adagolása után kezdődik. 3. Mosás: Gondosan szívja le minden egyes cella tartalmát. Adjon 200-300 µl hígított HRP mosó puffert minden egyes cellához, majd ezt is szívassa le. Ismételje meg ezt az eljárást még kétszer, így végezzen el összesen három mosást. Fordítsa a lemezt nyílásokkal lefelé, és egy nedvszívó felületen, finoman ütögetve tökéletesen távolítsa el az utolsó mosás után visszamaradt nedvesség nyomait a cellákból. Nagyon fontos, hogy az cellák minden egyes mosási lépés után tökéletesen ki legyenek ürítve. Leszíváskor a minta felvitelekor alkalmazott sorrendet tartsa be. 4. Adjon 100μl HRP h-ttg/dgp IgG/IgA konjugátumot minden egyes cellához. A konjugátumot az eredeti reagens üvegből aszeptikus körülmények között, és a helyes laboratóriumi eljárásoknak megfelelően kell kivenni. Csak annyi konjugátumot vegyen ki az üvegből, amennyire a teszt kivitelezéséhez szüksége van. A POTENCIÁLIS MIKROBIOLÓGIAI ÉS/VAGY KÉMIAI SZENNYEZŐDÉS ELKERÜLÉSE ÉRDEKÉBEN SOHA NE TÖLTSE VISSZA A FEL NEM HASZNÁLT KONJUGÁTUMOT AZ ÜVEGBE. Inkubálja a lemezt 30 percig úgy, mint a második lépésben. 5. Mosás: Ismételje meg a 3. lépést. 6. Adjon 100 µl TMB kromogént minden egyes cellához, és inkubálja sötét helyen, 30 percig szobahőmérsékleten. 7. Adjon 100 µl HRP stop oldatot minden egyes cellához. A HRP stop oldat adagolása alkalmával, ugyanazt az időzítést és sorrendet tartsa, amit a TMB kromogén esetében alkalmazott. Óvatosan ütögesse meg ujjával a lemez oldalát, hogy a cellák tartalma alaposan összekeveredjen. 8. Olvassa le minden egyes cella abszorbancia (OD) értékét 450 nm-en, a reakció leállítását követő egy órán belül. Ha bikromatikus mérést kíván végezni, referencia hullámhossznak használja a 620 nm-t. Minőség-ellenőrzés 1. Futtassa együtt h-ttg/dgp Screen ELISA mérsékelten pozitív, a h-ttg/dgp Screen ELISA erősen pozitív és az ELISA negatív kontrollt minden egyes betegminta sorozattal annak ellenőrzésére, hogy az összes reagens, és a végrehajtás is megfelelően működik. 2. Ne feledje, hogy mivel az h-ttg/dgp Screen ELISA mérsékelten pozitív, az h-ttg/dgp Screen ELISA erősen pozitív kontroll és az ELISA negatív kontroll is előhígított, ezért egyikük sem kontrollálja a minta hígításával kapcsolatos előkészítési lépéseket. 3. Kiegészítő kontrollok vizsgálata is végezhető a helyi, állami és/vagy szövetségi rendelkezések, vagy az akkreditációs testületek ajánlásainak vagy elvárásainak megfelelő módon. Alkalmas kiegészítő kontroll szérumok készíthetőek kevert humán szérum minták szétosztásával, és -20 C alatt történő tárolásával. 4. Annak érdekében, hogy a teszt eredményeit valósnak tekinthessük, valamennyi, alább felsorolt kritériumnak teljesülnie kell. Ha ezek közül bármelyik nem teljesül, a tesztet érvénytelennek kell tekinteni, és az eljárást meg kell ismételni. a. Az előhígított h-ttg/dgp Screen ELISA erősen pozitív kontroll abszorbanciája nagyobb kell legyen, mint az előhígított h-ttg/dgp Screen ELISA mérsékelten pozitív kontroll abszorbanciája, ami nagyobb kell legyen, mint az előhígított ELISA negatív kontroll abszorbanciája. b. Az előhígított h-ttg/dgp Screen ELISA erősen pozitív kontroll abszorbanciája 1,0-nél nagyobb kell legyen, míg az előhígított ELISA negatív kontroll abszorbanciája nem lehet nagyobb 0,2-nél. c. A h-ttg/dgp Screen ELISA mérsékelten pozitív kontroll abszorbanciája több, mint kétszerese kell legyen az ELISA negatív kontroll abszorbanciájának, vagy nagyobbnak kell lennie, mint 0,25. d. Az ELISA negatív kontroll és az h-ttg/dgp Screen ELISA erősen pozitív kontroll a reagensek alapvető hibájának jelzésére szolgál. Az h-ttg/dgp Screen ELISA erősen pozitív kontroll nem garantálja a precizitást a teszt diagnosztikai küszöbértékének közelében. e. A felhasználó megfelelő minőség-ellenőrzési eljárásokra vonatkozó további információkat a CLSI (NCCLS) Document C24-A3 -ban találhat. 25 Az eredmények kiszámítása Először határozza meg az egyes párhuzamos minták OD értékeinek átlagát. Ezután kiszámítható az egyes minták reaktivitása úgy, hogy a minta OD átlagát elosztja az h-ttg/dgp Screen ELISA mérsékelten pozitív kontroll OD átlagával. Az így kapott eredményt megszorozza a h-ttg/dgp Screen ELISA mérsékelten pozitív kontroll címkéjén feltüntetett egységek számával. 4

Minta OD Minta értéke = x h-ttg/dgp Screen ELISA mérsékelten pozitív (egységek) h-ttg/dgp Screen ELISA mérsékelten pozitív OD (egységek) A reaktivitás és a mintában lévő antitestek mennyisége között nem-lineáris kapcsolat van. Miközben a beteg antitest koncentrációjának növekedése és csökkenése a reaktivitás ezzel összefüggő növekedésében és csökkenésében mutatkozik meg, a változás nem lesz arányos (azaz, például a koncentráció kétszeresére nő, de a reaktivitás nem lesz kétszeres). Ha a beteg antitest koncentrációjának ennél pontosabb meghatározására van szükség, a beteg mintájának hígítási sorát kell tesztelni, és azt az utolsó hígítást tekintjük a minta antitest titerértékének, ami még a tesztben pozitív eredményt adott. Az eredmények értelmezése Minden egyes laboratóriumnak meg kell határoznia a saját referencia tartományait, az aktuálisan használt technikával, kontrollokkal, eszközökkel, és a vizsgált beteg populációra jellemző módon, a saját eljárásaiknak megfelelően. A minta besorolása az alábbi táblázat szerint lehet negatív vagy pozitív. Egységek Negatív <20 Pozitív >20 1. A pozitív eredmény arra utal, hogy a mintában gliadin peptid- és/vagy h-ttg IgG és/vagy IgA antitestek vannak, és felveti bizonyos glutén szenzitív enteropathiák, mint a coeliakia fennállásának lehetőségét. 2. A negatív eredmény arra utal, hogy a betegnek nincsenek gliadin peptid- és/vagy h-ttg IgG vagy IgA antitestei, vagy azok koncentrációja nem éri el a teszt diagnosztikai küszöbértékét. 3. Javasoljuk, hogy a laboratórium által kiadott értékelés tartalmazza az alábbi megállapítást: Az itt következő eredményeket az INOVA QUANTA Lite TM h-ttg/dgp Screen használatával kaptuk. Más gyártók tesztjével kapott gliadin peptid és ttg IgG/IgA értékek ettől eltérőek lehetnek, ezek fel nem cserélhetőek. A közölt antitest érték mennyisége nem vethető össze egy végpont-titer értékkel. A módszer korlátai 1. Kezeletlen beteg esetén a negatív eredmény nem zárja ki teljesen a glutén-szenzitív enteropathiát. 2. Kezelt betegekben, akikről ismert, hogy IgA antitesttel rendelkeztek, a gliadin IgA antitest eredmény jobban jelzi a diéta megtartását, mint a gliadin IgG antitest koncentrációja. 5 3. Téves pozitív eredmény (nagy antitest koncentráció jellegzetes hisztológiai eltérések nélkül) előfordulhat. A kapott pozitív eredményeket egyéb specifikus coeliakia szerológiai tesztek, mint például endomisyum (EMA), elvégzésével lehet megerősíteni. Lehet mérni a szérum IgA szinteket is az IgA deficiencia ellenőrzése érdekében. 4. Pozitív eredmény előfordulhat még akkor is, ha az egyedi h-ttg és gliadin II tesztek negatívak voltak. Mivel az szűrőteszt a h-ttg és a gliadin II elleni IgA és IgG antitesteket is detektálja, additív hatása lehet a többszörös egyéni vizsgálatokra vonatkozó többszörös erősen negatív eredmények miatt. 5. Mivel ez a kit az IgA és IgG antitestek egyidejű kimutatására kevert konjugátumot használ, nem lehet eldönteni, hogy egy pozitív eredmény az IgG, az IgA, vagy mindkettő miatt van. Amennyiben specifikus IgA és IgG egyedi kimutatásra és mennyiségi meghatározásra van szükség, a h-ttg-hez és gliadin II-höz való külön IgA- és IgG-tesztet kell használni. A különálló gliadin IgG és gliadin IgA értékek nem egyeznek meg a h-ttg/dgp teszttel nyert értékekkel, mivel ez utóbbi kevert IgG és IgA konjugátumot használ. 6. Ezen teszt eredményeit a klinikai eredményekkel együtt használja. 7. Ehhez a teszthez szérum mintákat kell használni. Várható értékek Referencia tartomány 496 véletlenszerűen kiválasztott, tünetmentes, egészséges, Egyesült Államokban élő személyt teszteltek h-ttg/dgp antitestek tekintetében. Ezek közül, 299 donor a 14-től 78 évesig terjedő korcsoportba tartozott, 150 férfi és 149 nő volt. A 20-egységes cutoff felett 7 minta (1,4%) volt. 5 minta volt pozitív, a következő értékekkel: 20,2, 22,1, 23,4, 29,2 és 36,5 egység. További két pozitív minta értéke 46,1 illetve 39,0 egység volt, valószínűleg ezek valódi coeliakiás minták volt, azon tény miatt, hogy a h-ttg IgA eredményeik 57,2 illetve 72,4 egység volt. A csak negatív minták standard deviációja 3,8 egység volt. A középérték háromszoros standard deviációval volt a 20-egységes cutoff alatt. Specifikus működési jellemzők Elfogadott termékkel történt összehasonlítás Négy, coeliakiával foglalkozó referencia laboratóriumból származó 99 mintát teszteltek QUANTA Lite TM Celiac DGP Screen, QUANTA Lite TM h-ttg IgA, QUANTA Lite TM h-ttg IgG és QUANTA Lite TM h- ttg/dgp Screen ELISA teszteken. Ezek eredményei, valamint a 496 normál mintáé az alábbi 5

táblázatban szerepelnek: Egy mintát akkor tekintettek az elfogadott termék használata alapján pozitívnak, ha a három elfogadott termék valamelyikén pozitívnak bizonyult (az eredmény nem lehetett pozitív mindhárom eszközön). Egy mintát akkor tekintettek az elfogadott termék használata alapján negatívnak, ha mindhárom eszközön negatív eredményt adott. N= 595 Celiac DGP Screen és/vagy h-ttg Pozitív Negatív h-ttg/dgp Screen Pozitív 48 4* Negatív 7** 536 Pozitív százalékos egyezés: Negatív százalékos egyezés: Összesített egyezés: 48/55 (87,3%), 95% konfidencia intervallum: 94,5 és 94,7% között 536/540 (99,3%), 95% konfidencia intervallum: 94,5 és 97,4% között 584/595 (98,2%), 95% konfidencia intervallum: 96,7 és 99,1% között *A 4 mintából amit h-ttg/dgp Screen-pozitívnak, mégis minkét h-ttg kiten negatívnak találtak, 3 a normál vizsgálatból volt. A negyedik beteg egy gluténmentes diétán lévő coeliakiás beteg volt, 22,1 egység. **A 7 mintából amit h-ttg/dgp Screen-pozitívnak, mégis vagy a Celiac DGP, vagy a h-ttg kiten negatívnak találtak, 5 a normál vizsgálatból volt. A fennmaradóból egy gluténmentes diétán lévő coeliakiás beteg volt, az értéke a h-ttg IgA teszten 21,5 egység volt. A másik minta egy elsőfokú rokoné volt, 20,2 egységgel a Celiac DGP Screen teszten. Klinikai vizsgálatok Klinikailag definiált mintákat, úgymint kezeletlen coeliakiás betegek (139 gyerekkorú beteg), coeliakiás betegek, coeliakiás betegek, akik IgA deficienciával rendelkeznek, látens coeliakiás betegek, makacs coeliakiások, gluténmentes diétán lévő coeliakiás betegek, coeliakiás betegek elsőfokú rokonai, IgA deficienciás kontrollok, és a nem coeliakiás betegek mintáit tesztelték házon belül és külső klinikai vizsgálatokon QUANTA Lite TM h-ttg/dgp Screen-en. A klinikailag definiált minták, valamint a fent említett normál tartományba tartozó minták eredményeinek összegzése az alábbiakban látható. Betegcsoport # h-ttg/dgp pozitív % Kezeletlen coeliakiások (gyerek) 185 (139) 183 (139) 99% (100%) Coeliakiás, IgA deficiens 5 5 100% Coeliakiás, látens 11 10* 91% Coeliakiás, makacs 9 8** 89% Coeliakiás, gluténmentes diétán 120 34 28% Elsőfokú rokonok 18 2 11% Beteg kontrollok 76 8 10,5% Normális 914 20*** 2,2% *A 11 látens coeliakiás beteg közül 8 volt ttg IgA pozitív és 9 EMA pozitív **A 9 makacs coeliakiás beteg közöl egy sem volt EMA pozitív, és csak 2 (22%) volt ttg pozitív A 20 pozitív közül, amelyek pozitívak voltak az egyedi h-ttg és DGP ELISA teszten 2 volt ttg pozitív a folyadékfázisú RIA teszten is. A h-ttg/dgp Screen ELISA teljesítménye a coeliakia diagnózisban QUANTA LITE h-ttg/dgp Screen Diagnózis* Pozitív Kezeletlen coeliakiás, gyerek, IgA deficiens, látens, vagy makacs Negatív (elsőfokú rokonok, beteg kontrollok és egészséges kontrollok) Összes Pozitív 207 30 237 Negatív 3 978 981 Összes 210 1008 1218 *A 120 gluténmentes diétán lévő coeliakiás beteget nem tartalmazza. Érzékenység: 98,6% (207/210), 95% konfidencia intervallum: 94,5 és 99,7% között Specificitás: 97,0% (978/1008), 95% konfidencia intervallum (CI): 94,5 és 98,0% között Érzékenység A teljes coeliakia érzékenységet az összes coeliakiások beteg eredményeinek, (kivéve azokét, akik már gluténmentes diétán vannak) csoportosításából számolták. Az összesen 210 coeliakiás közül 207 (azaz 98,6%) volt pozitív. Specificitás A specificitást a 914 normál, a 76 beteg kontroll és a 18 elsőfokú rokon eredményeinek csoportosításából számolták. Ez a csoport összesen 1008 mintát tartalmazott. Ezek közül 30 minta volt pozitív, 97,0%-os specificitással. Kereszt-reaktivitás A más autoantitestekkel lehetséges kereszt-reaktivitás miatt várható problémák felmérése céljából különböző nagy titerű autoantitest pozitív mintákat vizsgáltak a QUANTA Lite TM h-ttg/dgp Screen kitel. Összességében 83 mintát teszteltek. Számos minta egyéb INOVA QUANTA Lite TM antitest teszt kitek erősen pozitív kontrolljai voltak. A minták között található Aktin (4), kromatin (7), dsdna (4), M2 (4), 6

MPO (5), Centromer (7), CCP3 (5), GBM (9), Ribo P (4), RF IgG (4), SS-B (4), RNP (4), Scl-70 (4), Jo-1 (4), Sm (4), SS-A (6) és TPO (4). Az 83 minta középértéke 4,51 egység volt. Valamennyi minta negatív volt a QUANTA Lite TM h-ttg/dgp Screen-en. A középérték 4,4-szeres standard deviációval volt a 20- egységes cutoff alatt. Laboratóriumon belüli pontosság A QUANTA Lite TM h-ttg/dgp Screen intra-assay teljesítményét 12 minta, egyenként 5-szöri, ismételt tesztelésével értékelték ki. Ezt a tesztet egyetlen kezelő hajtotta végre az INOVA Diagnostics-ban, egy adag kiten. Az eredmények az alábbi táblázatban láthatók. QUANTA Lite TM h-ttg/dgp Screen ELISA intra-assay teljesítménye 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 középérték 113,3 62,9 41,3 35,7 22,1 21,6 18,7 19,0 7,9 6,8 12,2 7,0 SD 1,3 1,1 0,7 0,6 0,4 0,3 0,2 0,9 1,0 0,5 0,6 0,3 CV % 1,2 1,7 1,7 1,7 1,9 1,2 1,2 4,5 12,4 7,7 4,6 4,6 Az Inter-assay változás vizsgálata során 3 napig duplikátumban teszteltek egy 12 mintából álló panelt, naponta kétszer (reggel és délután egyszer-egyszer). Ezt a tesztet egyetlen kezelő hajtotta végre az INOVA Diagnostics-ban, egy adag kiten. A vizsgálat eredményeinek összefoglalása az alábbi táblázatban látható. QUANTA Lite TM h-ttg/dgp Screen ELISA inter-assay teljesítménye A B C D E F G H I J K L középérték 66,6 117,1 46,4 22,4 36,8 22,9 16,1 17,1 7,2 6,6 6,6 9,7 SD 2,1 3,6 2,4 1,2 3,3 2,2 1,1 1,5 0,3 0,7 1,4 1,8 CV% 3,2 3,0 5,2 5,3 9,0 9,5 6,9 8,7 4,4 11,2 21,3 18,8 Adagok közötti eltérés Az adagok közötti eltérés vizsgálatát az INOVA Diagnostics-ban hajtották végre, három kezelő, három különböző adag kitet használt három különböző napon. A vizsgálat eredményeinek összefoglalása az alábbi táblázatban látható. Minta Adag 1 Adag 2 Adag 3 középérték Std Dev CV % Erős pozitív kontroll 88,23 77,39 98,90 88,17 10,76 12,20 Pozitív 1 53,22 57,92 58,94 56,69 3,05 5,38 Pozitív 2 104,68 118,56 110,69 111,31 6,96 6,25 Pozitív 3 44,16 43,85 44,83 44,28 0,50 1,13 Pozitív 4 27,31 21,24 29,48 26,01 4,27 16,42 Pozitív 5 30,63 36,85 37,25 34,91 3,71 10,63 Pozitív 6 22,23 23,23 21,74 22,40 0,76 3,39 Pozitív 7 40,39 47,32 46,74 44,82 3,84 8,58 Pozitív 8 114,13 121,18 114,36 116,56 4,01 3,44 Vak próba 1,66 1,66 1,96 1,76 0,17 9,84 Negatív kontroll 1,71 1,54 1,96 1,74 0,21 12,17 Negatív 1 6,64 5,64 7,43 6,57 0,90 13,65 Negatív 2 6,44 6,61 8,63 7,23 1,22 16,86 Negatív 3 8,55 8,94 9,19 8,89 0,32 3,63 Negatív 4 8,55 11,90 12,45 10,97 2,11 19,25 7

Hivatkozások 1. Trier JS: Celiac Sprue. New England Journal of Medicine 325: 1709-1719, 1991. 2. Troncone R and Ferguson A: Antigliadin antibodies. J Pediatr Gastroenterol Nutr 12: 150-158, 1991. 3. McMillan SA, Haughton DJ, et al.: Predictive value for celiac disease of antibodies to gliadin, endomysium and jejunum in patients attending for jejunal biopsy. BMJ 303: 1163-1165, 1991. 4. Lindh E, Ljunghall S, et al.: Screening for antibodies against gliadin in patients with osteoporosis. Journal of Internal Medicine 241: 403-506, 1992. 5. Burgin-Wolff A, Gaze H, et al.: Antigliadin and antiendomysium antibody determination for celiac disease. Arch Dis Child 66: 941-947, 1991. 6. Working Group of European Society of Paediatric Gastroenterology and Nutrition. Revised criteria for diagnosis of celiac disease. Arch Dis Child 65: 909-911, 1990. 7. Osman AA, et al.: B-Cell epitopes of gliadin. Clin Exp Immunol 121: 248-254, 2000. 8. Aleanzi M, et al.: Celiac disease: Antibody recognition against native and selectively deamidated gliadin peptides. Clinical Chemistry 47: 2023-2028, 2001. 9. Schwertz E, et al.: Serologic assay based on gliadin-related nonapeptides as a highly sensitive and specific diagnostic aid in celiac disease. Clinical Chemistry 50: 2370-2375, 2004. 10. Prince HE: Evaluations of the INOVA Diagnostics Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Kits for Measuring Serum Immunoglobulins G (IgG) and IgA to Deamidated Gliadin Peptides. Clinical and Vaccine Immunology 13: 150-151, 2006. 11. Sugai E, et al.: Accuracy of Testing Antibodies to Synthetic Gliadin-Related Peptides in Celiac Disease. Clinical Gastroenterology and Hepatology 4: 1112-1117, 2006. 12. Collin P, et al.: Selective IgA deficiency and celiac disease. Scand Journal Gastroenterology 27: 367-371, 1992. 13. Dieterich W, Ehnis T, Bauer M, et al.: Identification of tissue transglutaminase as the autoantigen of celiac disease. Nature Medicine 3: 797-801, 1997. 14. Sollid LM, Molberg O, McAdam S, Lundin K, et al.: Autoantibodies in celiac disease: tissue transglutaminase guilt by association? Gut 41: 851-852, 1997. 15. Sardy M, et al.: Recombinant human tissue transglutaminase ELISA for the diagnosis of glutensensitive enteropathy. Clin Chem 45: 2142, 1999. 16. Sblattero D, et al.: Human recombinant tissue transglutaminase ELISA : an innovative diagnostic assay for celiac disease. Am J Gastroenterology 95: 1253, 2000. 17. Sugai E, et al.: Tissue transglutaminase antibodies in celiac disease: assessment of a commercial kit. Am J Gastro 95: 2318-2322, 2000. 18. Lampasona V, et al.: Tissue transglutaminase and combined screening for celiac disease and type 1 diabetes-associated autoantibodies. Lancet 352:1192-1193, 1998. 19. Hansson T, et al.: Antibody reactivity against human and guinea pig tissue transglutaminase in children with celiac disease. J Pediatric Gastroenterology and Nutrition 30: 379, 2000. 20. Andersson AS, et al.: Inhibition of endomysial staining with human tissue transglutaminase. Ninth International Symposium on Celiac Disease. J Pediatric Gastroenterology and Nutrition 31: S16, 2000. 21. Axiö-Frekricksson UB, et al.: Differences in human and guinea pig tissue transglutaminase. Ninth International Symposium on Celiac Disease. J Pediatric Gastroenterology and Nutrition 31: S16, 2000. 22. Signorini M, et al.: Human erythrocyte transglutaminase: Purification and preliminary characterization. Biological Chemistry 369: 275, 1988. 23. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control and Prevention/National Institutes of Health, Fifth Edition, 2007 24. CLSI (NCCLS). Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens; Approved Guidline- Third Edition. CLSI Document H18-A3, Vol 24(38), 2004. 25. CLSI (NCCLS). Statistical Quality Control for Quantitative Measurement Procedures: Principles and Definitions; Approved Guideline- 3rd edition NCCLS Document C24-A3, Vol. 26(25), 2006. A terméket előállítja: INOVA Diagnostics, Inc. 9900 Old Grove Road San Diego, CA 92131 United States of America Forgalmazásra jogosult az EU területén: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D-66386 St. Ingbert, Germany Tel.: +49-6894-581020 Fax.: +49-6894-581021 www.mt-procons.com Technical Service 888-545-9495 624575HUN January 2009 Revision 0 8