Galactosaemia Dr. Rózsa Melinda SZTE ÁOK Gyermekgyógyászati Klinika és Gyermekegészségügyi Centrum Központi Laboratórium Továbbképzı Tanfolyam 2007. Október 16 - október 19
Mire irányul? A veleszületett anyagcsere betegségek korai diagnosztizálására. Klasszikus angol meghatározása: Egy enzim vagy hormon aktivitásának monogenetikus mőködési zavara az intermedier anyagcsere folyamatban. / 1902 /
Története: 1908 Von Ruess galactosaemia felfedezése / megfigyelés anyatej táplálásnál / 1917 Tejmentes diéta bevezetése 1935 Mason és Turner Leroir cukor metabolizmusának leírása / 1970 Nobel dij / 1956 Galactosaemia génjének felfedezése 1963 Guthrie és Paigen újszülöttkori szőrés bevezetése 1974 SZOTE szőrés megkezdése 1975 Kötelezı szőrés bevezetése
67/2005. (XII.27.) EüM rendelet A kötelezı egészségbiztosítás keretében igénybe vehetı, betegségek megelızését és korai felismerését szolgáló egészségügyi szolgáltatásokról és szőrıvizsgálatok igazolásáról szóló 51/1997. (XII.18.) NM rendelet módosításáról
26/2006 VI.26 EÜM Rendelet Életkorhoz kötött szőrıvizsgálatok I. Fejezet 1. 0-4 napos életkorban: f) veleszületett anyagcsere-betegségek: fa) galactosaemia (összgalaktóz-szint és Gal-1-PUT), hypothyreosis, biotinidáz hiány, phenylketonuria, fb) tömegspektográfiás vizsgálattal, egy vizsgálati mintából: tömegspektográfiás vizsgálattal, egy vizsgálati mintából: jávorfaszörp betegség (MSUD), tyrosinaemia I, II, citrullinaemia I (argininosuccinát synthase hiány, ASS), arginosuccinic aciduria (arginosuccinát lyase hiány, ASL), homocystinuria, rövid-láncú acyl-coa dehydrogenase hiány (SCAD), közép-láncú acyl-coa dehydrogenase hiány (MCAD), hosszú-láncú hydroxi-acyl-coa dehydrogenase hiány (LCHAD), nagyon hosszú-láncú acyl-coa dehydrogenase hiány (VLCAD), Carnitin-palmytoil transferase hiány (CPT-I, II), Carnitin transzport zavara (CT), multiplex acyl-coa dehydrogenase defectus (glutársav aciduria GA II), beta-ketothiolase (oxothiolase) hiány, glutársav aciduria I (GA-I), isovaleriánsav acidaemia (IVA), metilmalonsav acidaemia (MMA), propionsav acidaemia (PA), 3-hydroxi-3-metilglutaryl-(HMG-)-CoA lyase, methylcrotonyl CoA karboxylase hiány (MCC) multiplex carboxylase hiány, phenylketonuria
Országos Szőrıcentrumok: 1. SZTE Gyermekklinika 2. Semmelweis Egyetem I.Gyermekklinika
Schleicher-Schüll szőrıpapír - Guthrie kártya Koraszülött: igen - nem Szül. Idı: Vérvétel ideje: Vérvétel helye: Anyja neve: Irányítószám: Lakcím: Koraszülött: igen - nem Szül. Idı: Vérvétel ideje: Vérvétel helye: Anyja neve: Irányítószám: Lakcím: Tejtáplálás elkezdve: Antibiotikum: Vércsere, transf.: igen - nem igen nem igen nem Tejtáplálás elkezdve: Antibiotikum: Vércsere, transf.: igen - nem igen nem igen nem NÉV: NÉV: NÉV: NÉV:
Schleicher-Schüll szőrıpapír - Guthrie kártya Koraszülött: igen - nem Szül. Idı: Vérvétel ideje: Vérvétel helye: Anyja neve: Irányítószám: Lakcím: Koraszülött: igen - nem Szül. Idı: Vérvétel ideje: Vérvétel helye: Anyja neve: Irányítószám: Lakcím: Tejtáplálás elkezdve: Antibiotikum: Vércsere, transf.: igen - nem igen nem igen nem Tejtáplálás elkezdve: Antibiotikum: Vércsere, transf.: igen - nem igen nem igen nem NÉV: NÉV: NÉV: NÉV:
Mit értünk galaktosaemián? Tejcukor ( Laktóz ) ( diszaharid ) Vékonybél bolyhainak tövében laktáz (β galaktozidáz ) enzim + H2O hidrolízis Galaktóz monoszaharid Szılıcukor (D Glükóz) monoszaharid Glükóz monoszaharid
galaktóz aldózreduktáz galaktitol össz galalaktóz galaktokináz galaktóz-1-p gal.-1-p uridil transzf. UDP galaktóz UDP gal.-4-epimeráz UDP glükóz UDPG pirofoszforiláz glükóz-1-p
- Galaktokináz enzimhiány: újszülöttkorban tünetmentes tejtáplálás után galactosaemia, cataracta felnıttkorban a galaktitól miatt vakság - Galaktóz-1-PUT enzimhiány: hányás, hasmenés, elhúzódó sárgaság veseelégtelenség, máj megnagyobbodás fejlıdési zavar, cataracta mentális retardáció -Duarte - galactosaemia
Mikrobiológiai tömegszőrés Galactosaemia újszülöttkori tömegszőrése Guthrie metabolitgátláson alapuló mikrobiológiai módszerével történik. Elve: galaktózra érzékeny mutáns E. coli ( W5 ) baktérium-törzset tartalmazó agaróz táptalajra helyezzük fel a vérrel átitatott szőrıpapír korongokat
Galaktokináz: Holden HM, Thoden JB, Timson DJ, Reece RJ. Galactokinase: structure, function and role in type II galactosemia. Cell Mol Life Sci. 2004 Oct;61(19-20):2471-84. A galaktokináz enzimnek kimutathatóan szerepe van a sejten belüli galaktóz szint érzékelésében.
Zavaró tényezık: Ál-pozitív eredmény: 1. ha olyan antibiotikumot kapott az újszülött ami gátolja az E-coli növekedését 2. bármilyen szennyezés ami kioltási zónát ad Ál-negatív eredmény: 1. ha vérmintát a tejtáplálás megkezdése elıtt vették le 2. ha a szőrıpapír nem volt megfelelıen átitatva 3. ha az újszülött transzfúziót kapott
Weidemann teszt: galaktóz 30 mg % fölött Elve: A galaktóz dehidrogenáz ( Gal-DH ) enzim a galaktózról a NAD-ra hidrogént visz át, fluoreszkáló NADH-t képezve. Kontroll (mg % ) Minta 20 25 30 35 40
a galaktóz-1-foszf foszfát- uridil-transzfer transzferáz ( G-1-PUT ) enzim hiányának kimutatása a klasszikus galaktozémia diagnózisának megerısítésére Beutler próba: Minta: heparinnal levett teljes vér ( vérgázkapillárisban ) azonos körülmények között levett, tárolt és szállított egészséges kontroll minta
Elve: Vér G-1-PUT jelenlétében a NADP redukálódik fluoreszkáló NADPH-t képezve ( UV 360nm ) + galaktóz-1-foszfát + NADP 30 60 90 120 Kontroll: Minta:
Idı ( perc ) 0 30 60 90 120 Kontroll Galactosaemia heterozygote Galactosemic Duarte variant Duarte variant heterozygote
összgalaktóz totál galaktóz mérése / galaktóz és galaktóz-1- foszfát / Galaktóz 1- foszfát alkalikus foszfatáz Galaktóz galaktóz dehidrogenáz Galaktóz + NAD+H 2 O Galaktono (1,4) lakton + NADH + H NADH + NBT ( sárga ) / nitroblu-terazolium / diaphorase NBT ( ibolya ) + NAD
Galactosaemia szőrés ELISA-módszerrel
Specifikus enzimvizsgálatok: galactokinase gal.-1-p uridil transzferase Németország A szőrésbıl kimaradó populációk pl.: cigány török észak afrikai
Galaktóz-1-foszfát uridil-transzferáz enzim meghatározás /GALT/ GALT GAL-1-P + UDPG Galaktóz-1-foszfát uridil-transzferáz G-1-P + UDP-GAL PGM G-1-P foszfoglükomutáz G-6-P G-6-PD G-6-P + NADP glükóz-6-foszfát dehidrogenáz 6-PGA + NADPH + 6-PGD 6-PGA + NADP 6-foszfoglükonát dehidrogenáz R-5-P + NADPH +
GALT enzim aktivitás: Eredmények Normál : > 3,8 U/gHb Átmeneti: 2,9-3,8 U/gHb Kóros: < 2,9 U/gHb Beteg B.I. T.K. A.G. M.I. M.A F.G. S.A. S.I. T.A. GALT 3.40 3.11 1.05 2.93 3.51 1.77 3.34 1.75 1.25 Terhelés ( 1,5 g/kg laktóz; max 50g ) 30 perc 3,67 3,10 3,12 3,47 3,83 60 perc 4,01 3,33 3,22 3,91 4,11 120 perc 3,81 3,52 3,28 3,88 3,97
Screening year 1986 1987 1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 Galaktozémia kiszőrt esetei Galactosaemia frequency 1 G1PUT 1 G1PUT 1 G1PUT 1 G1PUT 0 1 G1PUT 2 G-kinase 1 G-kinase 1 G1PUT 1 G-kinase 1 G1PUT 1 G-kinase 1 G1PUT 1 G-kinase 2 G1PUT 5 G-kinase incidency 1.64941 1:63303 1: 61116 1:61780-1:64038 1:32019 1:61767 1:59084 1:59084 1:30030 1:57670 1:57670 1:27257 1:10900 Screening year 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 Galactosaemia frequency 2 G1PUT 3 G-kinase 5 G1PUT 2 G-kinase 2 Duarte? 3 G-kinase 3 G1PUT 1 G-kinase 0 2 G-kinase 2 G1PUT 2 G-kinase 1 G1PUT 2 G-kinase 1 Duarte? 2 G1PUT 0 1 G1PUT 10 G-kinase 1 G1PUT 3 G-kinase incidency 1:26520 1:17680 1:10330 1:25825 1:24462 1:16440 1:16440 1:49320-1:24507 1:24030 1:24030 1:46104 1:23052 1:46104 1:22638-1:47358 1:4736 1:46149 1:15383
Ajánlás a napi galaktóz bevitelre ( SCHWEITZER et. al., 1998 Galaktosämie. Jubileumsausgabe Elterninitiative Galaktosämie e.v. Düsseldorf, pp. 21-24. Csecsemık Kisgyermek Iskolás gyermek Fiatalok Felnıttek 50 (-200 mg) galaktóz/nap 150 (-200 mg) galaktóz/nap 200 (-300 mg) galaktóz/nap 250 (-400 mg) galaktóz/nap 300 (-500 mg) galaktóz/nap
GALT GalK1 GalK2 transzferáz kináz kináz 9p13 17q24 15q21.1 Klasszikus Duarte Q188R G1391A S142I G171V K285N G148C N314D P28T
DNS EDTA-val alvadásgátolt vérbıl / heparin leukocyta tartalmú buffy coat / ( 5-7 napig szobahın tárolható ) Tisztítás: hagyományos módszerrel vvt lizálás fehérje emésztés / Proteináz K / fehérje kicsapás / NaCl / DNS kicsapás / alkohol / DNS oldása / d.víz, puffer / Tárolás: + 4 C O -on hónapokig Koncentráció mérés: 260 nm-en - 20 C O -on évekig - 70 C O -on évtizedekig Tisztaság: Abs 260/280 = 1,7-1,9
Principle of the PCR Method 5 5 g h 1. 2. 3. Taq polimeráz dntp 3 5 5 3 datp dttp A = T dgtp dctp G = C primerek Denaturálás : 92-95 C O -on 4. Hibridizálás: 40-55 C O -on Szintézis: 71-73 C O -on
The LightCycler Instrument
Principle of Detection with the LightCycler TM HybProbes Primer 1 Primer 2 Excitation (470nm) Detector (640nm) horgony = anchor / 23-25 bázis 6FAM / Emission: 520nm Sensor / 13-15 bázis LC 640 / Absorption: 520nm LED Light Source
perfect match Mutation Detection Probe Design mismatch Anchor Probe Mutation Probe T m of Mutation Probe approx. 5 C lower than T m of Anchor Probe
Mutation Analysis with Hybridization Probes Mismatch Perfect match low medium high Temperature
Different Stability for Different Mismatches Most Stable Least Stable G-T > G-G = AG >TG >GA = TT >TC > AC > CT You can make the probe so that it matches the wild type or the mutant sequence - pick the one with the least stable mismatch
LightCycler Applications Mellting Point Mutation Detection
Eddigi vizsgálatok G-1-PUTranszferáz Galaktokináz AG TA SI FG TP SG SA IG IG2 KT NA Q188R Q188R/ N N/N N/N Q188R/ N N314D N314D/ N N/N N/N N/N P28T P28T/N P28T/N P28T/N N/N N/N N/N N/N További vizsgálatok? DNS szekvenálás
Galaktozémia újszülöttkori szőrése Európában Ország Ausztria Írország Egyesült Királyság Svájc Magyarország Belgium Németország Dánia Franciaország Hollandia Norvégia Lengyelország Spanyolország Szőrés bevezetése 1966 1972 Csak Skóciában 1972 1975 1975 1978 csak a Flamand tartományokban 1978 csak bizonyos tartományokban nem kötelezıen 2002 nincs nincs nincs nincs nincs
Mennyi 2 x 2? Matematikus: 4 Vegyész: 3.9 4.1 Jogász: 5!!! Közgazdász: Mennyi legyen? Orvos: Mi a labor eredmény?
THE END
Tesztkérdések Mikor normális az újszülöttkori galactosaemia szőrés eredménye? Amikor 5 mg% alatti a vérszint Amikor 10 mg% feletti a vérszint Amikor 20 mg% feletti a vérszint X Amikor 10 mg% alatti a vérszint Az újszülöttkori galactosaemia szőrésénél mit mérünk? Galalaktóz-1-foszfát-uridil-transzferáz szintet Galaktóz-1-foszfát szintet Glükóz-1-foszfáz szintet X Össz galaktóz szintet
Köszönöm a figyelmet!