Az elválasztás elméleti alapjai

Az elválasztás elméleti alapjai Az elválasztás során, a kromatogram kialakulása közben végbemenő folyamatok matematikai leirása bonyolult, ezért azokat teljességgel nem tárgyaljuk. Cél: * megismerni az elválasztás során azokat a főként fizikai folyamatokat, amelyek befolyásolják az elválaszthatóságot * az aktuális paraméterek ismeretében hogyan lehet az elválasztást szabályozni, optimalizálni

a mintakomponensek az elválasztás során a heterogén összetételű álló- és mozgófázis között eltérő fizikai és kémiai tulajdonságaik következtében kölönbözőképpen oszlanak meg a kialakult rendszerre a minta és a fázisok dinamikus kölcsönhatása jellemző: MINTA ÁLLÓFÁZIS MOZGÓFÁZIS

a komponensek az állófázishoz való kötődésüknek megfelelően mozognak a mozgófázisban, melyet meghatároz: az álló- és mozgófázis összetétele, a hőmérséklet, a nyomás visszatartáskor a minta szétterül, létrehozza a zóna- vagy sávszélesedést, melynek oka elsősorban diffúzió, másrészt anyagátadási gátlás

Örvénydiffúzió Oka: a mozgófázis eltérő áramlási útja a széles csatornákban gyorsabban, a szűk, keskeny csatornákban lassabban halad az eluens a molekulák belekerülve ezekbe az áramlási csatornákba, hosszabbrövidebb szakaszt foglalnak el, ezáltal megnövelve a felviteli keskeny sávot

Anyagátadási gátlás a mozgó fázisban Oka: a mobilfázis az állófázis egyenetlen részei mentén eltérő áramlási sebességgel halad a szemcsék közelében az áramlási sebesség kicsi, vagy nulla, míg a csatorna közepén nagy

Anyagátadási gátlás a mozgó fázis álló részében Oka: a szemcsék pórusaiban lévő mozgófázis nem mozog, hanem áll a meghatározandó molekulák diffúzió révén ki-be mozognak ezekben a pórusokban a sávszélesedés attól függ, hogy mennyi időt töltöttek a pórusokban

Anyagátadási gátlás az állófázisban Oka: a komponensek bediffundálva az állófázisba valamilyen mechanizmus révén be is hatolnak abba és ott megkötődnek ha a molekula mélyre hatol, akkor sokáig tartózkodik az állófázisban, ezzel megnövelve a sávszélesedést

A kromatogram keletkezése

A kromatogram jellemzői 1.) a komponens retenciós ideje (t R ): a minta beadagolásától a csúcsmaximum megjelenéséig eltelt idő * értéke az adott rendszerre mindíg állandó * felhasználható az ismeretlen komponens azonosítására 2.) a vissza nem tartott komponens retenciós ideje (t 0 )

A mintamennyiség hatása a retencióra kis mintamennyiségek estében a retenciós idő nem változik(a ) egy bizonyos kritikus értéknél a t R csökkenése figyelhető meg (b) a mintaméret további növekedésével a retenciós idő tovább csökken és gyorsan romlik az elválasztóképesség, a szelektivitás is (c), (d).

3.) visszatartási tényező (retenciós faktor; kromatográfiás megoszlási hányados; k) k = t R - t 0 t 0 megadja, hogy egy vizsgált komponens az elválasztás során mennyi időt tartózkodott az állófázison, viszonyítva a mozgófázisban töltött időhöz k értéke gyakorlatilag 1-10 közé kell essen biológiai minták esetében k értéke 2-5 között már megfelelő elválasztást jelent

k értékét térfogategységekben is megadhatjuk: k = V R - V 0 (nettó retenciós térfogat) V 0 (hottérfogat) következmény: a.) ha változtatjuk a hordozón az állófázis relatív mennyiségét, akkor megváltozik minden komponens k értéke is b.) változtatva a mobilfázis összetételét ugyancsak változnak a k értékek

A kapacitási tényező és a mintatérfogat összefüggése azt mutatja, hogy olyan mintaméret tartományon belül kell dolgozni, ahol a k értéke állandó ez a kritikus érték a rendszer lineáris kapacitása, melyet túllépve a retenciós adat azonosításra nem használható

4.) Szelektivitási tényező ( ) : a két visszatartási tényező hányadosaként adható meg = k 2 k 1 változtatása alapvetően két úton lehetséges: az állófázis megváltoztatásával (ún. állófázis hatás) a mozgófázis változtatásával (ún. mozgófázis hatás) a kettő egymással szorosan összefügg: pl., ha megváltozik a mozgófázis összetétele, akkor változik az adszorpciós réteg összetétele, de egyúttal változik az anyagok megoszlása és így a szelektivitás is

A kromatográfiás csúcs az összetevők anyageloszlását mutatja nem írhatók le Gauss görbével, torzultak, nem szimmetrikusak a csúcsok alakját befolyásolja: túlterhelés, nyomás, hőmérséklet nem megfelelően megválasztott álló- és mozgófázis

Sávelhúzódás a.) kémiai : - a minta és az álló-/mozgófázis nem összeillő -a leszálló ág nehezen vagy egyáltalán nem tér vissza az alapvonalra - teendő: új fázisrendszert kell választani!

b.)oldószer okozta sávelhúzódás a minta oldására használt oldószer nem azonos az eluenssel nagyobb mennyiségű anyag után kis csúcsot akarunk detektálni megoldás: kisebb mennyiségű minta injektálása

c.) Poisson-féle sávelhúzódás gyenge minőségű állófázis esetében alakul ki igyekezzünk azokat mellőzni

d.) exponenciális vagy normális sávelhúzódás minden kromatográfiás rendszerben megtalálható, bár esetenként alig észlelhető jól tervezett rendszerekben hatása elhanyagolható a HPLC-ben kisebb a sávok elhúzódása, mint a GC-ben

5. Csúcsfelbontás vagy relatív elválasztás (R S ) : a két szomszédos sáv középpontja és az átlagos sávszélességük hányadosaként adható meg R S =2 (t 2 - t 1 ) (W 1 +W 2 ) W-a sávok csúcsszélessége nagyobb R S értékek jobb, a kisebbek gyengébb elválasztást eredményeznek

Az R S értékét meghatározza: a.) a visszatartási tényező (k) b.) az elméleti tányérszám (N), mely a komponens retenciós ideje és a sávszélessége ismeretében számítható N=16 t R 2 W R az N a kromatográfiás rendszer hatásosságát fejezi ki értéke egy kromatogram különböző sávjaira közelítőleg azonos

A két sáv közül ha az egyik lényegesen kisebb a másiknál, az átfedés nagyobb mértékűvé válik:

N arányos az elválasztó rendszer hosszával (növekedésével nő) N= L (az elválasztó rendszer hossza) H (HEPT= height equivalent to theoretical;az egységnyi hosszban lévő hatásosság mértéke) a felbontás a következőképpen adható meg: R s = 1/4 N * ( -1)/ *k/(k+1) 1 2 3 az első tag az elválasztásra jellemző kinetikai hatásokat (zónaszélesedés), a második az elválasztást megszabó termodinamikai hatásokat, a harmadik tag a komponensek visszatartását adja meg

Az elválasztás alapegyenlete: R s = 1/4 N * ( -1)/ *k/(k+1) N - elméleti tányérszám -szelektivitási tényezö k - visszatartási tényezö /kapacitásarány/ az alapegyenletben szereplő tényezők definíciója és a javasolt értékek: N= 16(t R /W b ) =k 2 /k 1 k=(t R -t 0 )/ t 0 ahol: t R =retenciós idő ahol: k 2 k 1 ahol: t 0 az inert W b =az alapvonalon mért csúcsszélesség anyag retenciós ideje N>1000 >1,05 1 k >10 ha =1 nincs biológiai minta esetén elválás 2 k >5

Összefoglaló A kromatográfiás elválasztás célja: hasonló fizikai-kémiai szerkezetű vegyületek elkülönítése, azonosítása és mennyiségi meghatározása A kromatografálhatóság kritériuma: az anyagok átalakulás nélkül oldatba vihetők legyenek Az elválasztás alapja: két hasonló fizikai-kémiai tulajdonsággal rendelkező komponens megoszlása az álló- és egy állandó mozgásban lévő mozgófázis között Eluciós módszer: a minta bevitele impulzusszerűen (dugószerűen) történik, a mozgó fázis folyamatosan áramlik az állófázis felett és szorpciója kisebb, mint a legkevésbé szorbeálódó mintakomponensé