Nagyfelbontású elválasztástechnikai módszerek kifejlesztése és alkalmazása biológiailag aktív és gyógyszer-jelölt molekulák analízisében

Nagyfelbontású elválasztástechnikai módszerek kifejlesztése és alkalmazása biológiailag aktív és gyógyszer-jelölt molekulák analízisében Doktori értekezés Dobos Zsófia Semmelweis Egyetem Gyógyszertudományok Doktori Iskola Témavezető: Dr. Idei Miklós Hivatalos bírálók: Dr. habil. Janáky Tamás egyetemi docens Biczókné Dr. Magyar Anna tud. főmunkatárs, Ph.D. Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság tagjai: Prof. Dr. Klebovich Imre egyetemi tanár Dr. habil. Torkos Kornél egyetemi docens, Dr. Hrabák András egyetemi docens, Ph.D. Budapest 2009

Tartalomjegyzék Tartalomjegyzék... 2 Rövidítések jegyzéke... 4 1. Bevezetés... 6 1.1 A kapilláris elektroforézis története... 6 1.2 A kapilláris elektroforézis készülék felépítése... 6 1.3 Elektroforézis... 13 1.3.1 Elektroozmotikus áramlás... 15 1.3.2 Az elektroozmotikus áramlás szabályozása... 18 1.3.4 Analítikai paraméterek... 20 1.4 Kapillárelektroforézis technikák ismertetése... 22 1.4.1 Kapilláris zónaelektroforézis (CZE )... 22 1.4.2 Kapilláris gélelektroforézis (CGE)... 23 1.4.3 Kapilláris izoelektromos fókuszálás (CIEF)... 23 1.4.4 Kapilláris izotachoforézis (CITP)... 24 1.4.5 Kapilláris elektrokromatográfia (CEC)... 25 1.4.6 Micelláris elektrokinetikus kromatográfia (MEKC)... 26 1.4.6.1 Az elválasztás elve... 26 1.4.6.2 Retenciós faktor... 30 1.4.6.3 A MEKC elválasztást jellemző fizikai paraméterek... 33 1.4.6.4 Alkalmazási területek... 34 2. Célkitűzések... 37 3. Módszerek... 38 3.1 Vegyszerek... 38 3.2 Vizsgált vegyületek... 38 3.3 Vizsgált pszeudostacioner fázisok... 39 3.4 Készülékek... 40 3.4.1 ISCO Model 3850 Capillary Electropherograph... 40 3.4.2 Beckman P/ACE System 5500... 41 3.5 Pufferek... 41 3.6 Minták... 42 3.6.1 MDR-peptidek... 42 2

3.6.2 Tesztanyagok... 42 3.7 Hidrofobicitás... 42 4. Eredmények... 43 4.1 Számítások... 43 4.2 CLOGP-t mic... 44 4.3 CLOGP-t prop,mic... 45 4.4 A pszeudostacioner fázisok összehasonlítása... 46 4.4.1 A CLOGP 50 érték... 46 4.5 Metilén szelektivitás... 47 5. Megbeszélés... 51 5.1 CLOGP-t mic... 51 5.2 CLOGP-t prop,mic... 54 5.3 A pszeudostacioner fázisok összehasonlítása... 57 5.3.1 A CLOGP 50 érték... 61 5.4 Metilén szelektivitás... 63 6. Következtetések... 65 7. Összefoglalás... 66 8. Irodalomjegyzék... 68 Saját közlemények... 76 Köszönetnyilvánítás... 78 3

Rövidítések jegyzéke BOC t-butiloxikarbonil Bzl benzil CE kapilláris elektroforézis (Capillary Electophoresis) CGE kapilláris gélelektroforézis CIEF kapilláris izoelektromos fókuszálás CITP kapilláris izotachoforézis CLOGP számított LOGP érték CMC kritikus micella koncentráció CTAC cetil-trimetilammónium-klorid CZE kapilláris zónaelektroforézis D diffúziós állandó D mc E EOF F e a micella diffúziós állandója elektromos térerő elektroozmotikus áramlás (Electro Osmotic Flow) a részecskére ható elektromos erő FMOC 9-fluorenilmetiloxikarbonil F s GC a közeg által kifejtett surlódási erő gázkromatográfia (Gas Chromatography) HPLC nagyfelbontású/nagynyomású folyadékkromatográfia (High Performance Liquid Chormatography) HTAB hexadecil-trimetilammóniumbromid k" módosított retenciós faktor K megoszlási hányados k retenciós faktor k HPLC retenciós faktor a HPLC-nél L a kapilláris teljes hossza L d a kapilláris hossza az injektálási ponttól a detektorig LiPFOS lítium-perfluoroktán-szulfonát MDR multidrog rezisztens Me metil MEKC micelláris elektrokinetikus kromatográfia MS tömegspektrometria (Mass Spectrometry) N elméleti tányérszám pi izoelektromos pont q az ion töltése r az ion sugara R felbontás SC nátrium-kolát SDC nátrium-deoxikolát SDS nátrium-dodecilszulfát t 0 t aq tbu t m t mic elektroozmotikus áramláshoz tartozó idő a vizes fázisra vonatkozó fázistartózkodási idő t-butil migrációs idő a micelláris fázisra vonatkozó fázistartózkodási idő t prop,mic normalizált fázistartózkodási idő t r retenciós idő 4

TTAB tetradecil-trimetilammóniumbromid v az ion sebessége V feszültség v EOF V M V S w Z α az elektroozmotikus áramlás sebessége a mozgó fázis térfogata a micelláris fázis térfogata az alapvonali csúcsszélesség értéke időben benziloxikarbonil szelektivitás ε ζ η μ app,mc μ e μ eo μ EOF μ l μ mc σ dielektromos állandó zeta-potenciál az oldat viszkozitása látszólagos micelláris mobilitás elektroforetikus mozgékonyság az elektroozmotikus áramlás mobilitása az elektroozmotikus áramlás mozgékonysága látszólagos mozgékonyság micellák mobilitása a jel standard deviációja 5

1. Bevezetés 1.1 A kapilláris elektroforézis története A kapilláris elektroforézis az 1970-es években alakult ki a hagyományos elektroforézis módszerekből. Az elválasztástechnikai alkalmazás kifejlesztése J. W. Jorgenson, S. Hjerten és K. D. Lukacs nevéhez fűződik [1,2,3,4]. Az első szabadzónás elektroforézist Hjerten végezte, kisméretű, 3 mm-es kapillárist használva [5]. Azonban a kapilláris méretéből adódóan sok gyakorlati problémát tapasztaltak, ami a későbbiekben egy kisebb belső átmérőjű kapilláris segítségével már kiküszöbölhető volt. Ezeket a kísérleteket 1979-ben Mikkers és munkatársai 200 µm belső átmérőjű politetrafluoretilén kapillárisban végezték. 1981-ben Jorgenson és Lukacs kidolgozták a 100 μm-nél kisebb belső átmérőjű kapillárisban végzett elektroforetikus elválasztás elméleti hátterét. A kapilláris elektroforézis mai formáját a 80-as évek elején érte el. A nyolcvanas évek elején kezdték bevezetni a különféle elektroforézis technikákat. 1983-ban Hjertén kidolgozta a kapilláris gélelektroforézis módszerét. A módszerben rejlő előnyökről Cohen és Karger 1987-ben jelentettek meg publikációt [6]. 1984-ben Terabe és munkatársai írták le a micelláris elektrokinetikus kromatográfiát, és annak elméleti hátterét [7,8]. Az első készülékek 1989-ben jelentek meg a kereskedelemben. A kilencvenes években egyszerre több új technika jelent meg, mint pl.: kapilláris izoelektromos fókuszálás, kapilláris izotachoforézis, kapilláris elektrokromatográfia, affinitás kapilláris elektroforézis. 1.2 A kapilláris elektroforézis készülék felépítése A készülék fő részei a következők: mintaadagoló egység, kapilláris, puffertartályok a kapilláris két végénél, elektródok, amelyek a puffertartályokba merülnek, nagyfeszültségű tápegység, termosztát egység, detektor, vezérlő egység, adatgyűjtő és adatfeldolgozó egység (számítógép) (1. ábra). Természetesen a rendszer több detektorral, különféle mintaadagoló rendszerekkel tovább bővíthető. 6

1. ábra A kapilláris elektroforézis készülék szerkezeti felépítése Mintaadagolás: a minta injektálása többféle módon történhet. Változtatható osztásarányú mintaosztón (splitteren) keresztüli injektálás: Az injektálás mechanikus úton történik, mikrofecskendővel. Az injektált mennyiség általában a µl nagyságrendbe tartozik. A teljes injektált térfogat adott arányban megoszlik az analizáló és a megosztó kapilláris között, és így az injektált mintának csak egy meghatározott hányada kerül az analizáló kapillárisba. A kapillárisba jutó minta mennyisége a megosztó kapilláris méretének, illetve az injektált minta térfogatának megváltoztatásával szabályozható. Elektroozmotikus (elektrokinetikus) injektálás (ld. 2. ábra) Ennél az injektálási technikánál a minta kapillárisba való juttatása feszültséggel történik, amely hatására elektroozmotikus áramlás jön létre a rendszerben. A minta komponensei saját mobilitásuk mértékében kerülnek a rendszerbe. Az injektált minta mennyisége a feszültség mértékével és annak idejével változtatható. A módszer hátránya hogy az egyes komponensek különböző mennyiségben kerülnek a rendszerbe, vagyis a mozgékonyabb komponensből több jut a kapillárisba, mint a kevésbé mozgékonyból. 7

Hidrodinamikus injektálás (ld. 2. ábra) Három fő típusa van: Pneumatikus injektálás: a minta bevitel külső nyomással történik. Vákuumos injektálás: a minta vákuum hatására jut a rendszerbe. Hidrosztatikus injektálás: miközben a kapilláris a mintatartó edénybe merül, bemeneti oldalát magasabbra emelik, mint a kapilláris kimeneti oldalát. A rendszerbe juttatott minta mennyisége a szintkülönbséggel és az idő hosszával szabályozható. 2. ábra A hidrosztatikus injektálás különböző változatainak és az elektroozmotikus injektálás vázlatos rajza 8

Kapilláris A kapilláris anyagának kémiailag és elektromosan inertnek, UV és látható fényt áteresztőnek, hajlékonynak, de ugyanakkor kellően szilárdnak és nem túl drágának kell lennie. Ezen követelményeket jelenlegi ismereteink szerint a kvarc elégíti ki leginkább. A legelterjedtebb az ún. ömlesztett kvarc ( fused silica ) kapilláris azonban néhány esetben alkalmaznak polietilén, illetve teflon kapillárist is. A kvarcot már régóta használják optikai cellák és gázkromatográfiás (GC) kolonnák anyagául is. A GC-s kolonnákhoz hasonlóan, a CE kapillárisokat is poliimid védőréteggel borítják a kapilláris erősítése és könnyebb kezelhetősége érdekében. A detektálás helyén, az optikai ablakban ez a műanyag réteg könnyen leégethető, vagy lekaparható. A kapilláris lecsupaszított néhány mm-es szakasza azonban igen törékennyé válik, így óvatosan kell vele bánni. Általában 25-75 μm belső és 350-400 μm külső átmérőjű kvarc kapillárisok használatosak. A meghatározás idejét tekintve a rövid kapillárisok alkalmazása előnyös. A leggyakrabban használatos effektív kapillárishosszúság 50-75 cm. Ennél 5-15 cm-rel nagyobb a kapilláris teljes hossza, vagyis a detektor és a kapilláris kimeneti vége közötti távolság. Legelőnyösebb, ha az effektív hosszúság a kapilláris teljes hosszának lehető legnagyobb részét kiteszi a nagy elektromos térerő használata és a kapilláris kondícionálásához illetve az elemzéshez szükséges idő csökkentése miatt. A nemborított kvarc kapillárisok szabad szilanol csoportjai kölcsönhatásba léphetnek a mintakomponensek molekuláival és adszorpciót idézhetnek elő a fal felületén. Ennek visszaszorítása érdekében a kapillárisok belső felületét különböző borítóréteggel szokták ellátni, például: poli-(akrilamid), poli-(etilénglikol), poli-(etilénimin), poli- (vinilpirrolidon) réteggel [9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17]. Puffertartó A puffertartó edények teremtik az elektromos kapcsolatot a beléjük merített kapilláris és elektród között. A hagyományosan normál polaritásnak nevezett elrendezés esetén a kapilláris bemeneti, úgynevezett inlet vége az anóddal, kimeneti vagy detektor oldali, úgynevezett outlet vége a katóddal teremt közvetlen kapcsolatot. Ellentétes elrendezés esetén fordított polaritásról beszélhetünk. 9

Tápegység Leggyakrabban 10-30 kv feszültséget biztosító tápegységet alkalmaznak. A migrációs idők nagyfokú reprodukálhatóságához (± 0,1%) jól szabályozott feszültség szükséges. A feszültséget a kapilláris végeihez platina elektródok vezetik. A készülék megfelelő működésének ellenőrzéséhez szükséges a feszültség hatására kialakuló áram mérése, mely tipikusan nem haladja meg a 100 μa-t. Termosztát A reprodukálható elválasztáshoz elengedhetetlen az elektroforézis során keletkező hő hatékony elvezetése és az állandó hőmérséklet biztosítása, ezért a kapillárist általában valamilyen termosztát rendszerrel veszik körül. A kapilláris nagy fajlagos felülete lehetővé teszi, hogy az elválasztás alatt fejlődő Joule-hőt a termosztáló rendszer hatékonyan el tudja vezetni. A kapilláris termosztálása nagyon lényeges, mert az analizált komponensek mobilitása 1 ºC hőmérsékletingadozás hatására kb. 2%-kal változik [18,19]. Detektor A CE technikáknál a detektálás egyfajta kihívásnak számít a kapilláris kis átmérője és a felhasznált, csupán nanoliternyi térfogatú minta miatt. Bár a CE egyike a legkevesebb mintamennyiséget felhasználó módszereknek, mégsem tekinthető nyomanalitikai módszernek, mivel nagyon kis koncentrációk meghatározására nem alkalmas, vagy pedig elődúsítási eljárás alkalmazása szükséges. A kapilláris elektroforézisben, hasonlóan a HPLC-hez, sokféle detektálási módszert alkalmaznak. A leggyakrabban alkalmazott módszerek, módszercsoportok: ultraibolya (UV)-, látható (VIS)- és fluoreszcens- vagy lézer indukált fluoreszcens-, elektrokémiai-, refraktometriás-, lángionizációs detektálás, indirekt detektálás, tömegspektrometriás-, illetve nukleáris mágneses rezonancián alapuló detektálási módszerek. A módszerek egy része lehetővé teszi a mintakomponensek folyamatos, az analízissel egyidejű ( on-line, on column ) detektálását, de előfordul az analízist követő ( off-line ) detektálás is, amikor az elválasztott komponenseket kinyerik a kapillárisból, majd a kinyert frakciókat analizálják. 10

Legelterjedtebb módszer az ultraibolya detektálás melynek előnye, hogy a mintakomponenseket az elválasztás megszakítása nélkül, egyenesen a kapillárisban képes detektálni külön detektorcella nélkül [20, 21]. Az érzékenység és a lineáris kimutatási tartomány ugyan javítható a kapilláris belső átmérőjének növelésével, ezt azonban korlátozza az a tény, hogy nagyobb áramerősségek alkalmazása a kapilláris jelentős felmelegedését vonja maga után [9]. A túlzott áramfelhasználás (és így hőtermelődés) elkerülése érdekében olyan speciális kapillárisokat állítottak elő, melyek átmérőjét csupán az optikai fényút helyén növelték meg. Ilyen kapilláristípust képviselnek a buborékcellás, a Z-cellás vagy a szögletes keresztmetszetű kapillárisok (3. ábra) [22, 23]. 3. ábra Speciális alakú kapillárisok és kapilláris toldatok [22] Az UV detektorok közül a forgó monokromátoros illetve a diódasoros detektort is alkalmazzák a CE készülékekben. Először 1989-ben kísérleteztek diódasoros detektor alkalmazásával, ami azóta eléggé elterjedt. [24, 25]. Ez a típusú detektor nemcsak egy hullámhosszon képes detektálni az elnyelést, hanem az egyes komponensek UV spektrumát is képes felvenni. A spektrum alapján segítséget kaphat az analitikus az egyes komponensek kémiai azonosításában és a kapott csúcsok tisztaságának (egységességének) ellenőrzésében. 11

Az UV detektáláshoz (érzékenységi határ: 10-8 -10-5 M) viszonyítva érzékenyebb módszereknek bizonyulnak a fluoreszcencia (érzékenységi határ: 10-9 -10-7 M) és a lézer indukált fluoreszcencia (érzékenységi határ: 10-16 -10-14 M) detektálási technikák [21, 26, 27]. Ezekben az esetekben az elválasztást megelőzően, vagy azt követően gyakran kell származékképzéshez folyamodni [27]. Rendkívül jelentős a tömegspektrometriás (MS) detektálásnak az alkalmazása a kapilláris elektroforézisben, mivel nemcsak rendkívül érzékeny (mérési határ: 10-9 -10-5 M), hanem lehetőséget ad a kémiai szerkezet meghatározására is. A kapilláris elektroforézis készülék tömegspektrométerhez való kapcsolása például a következő esetekben volt kivitelezhető: elektrospray tömegspektrometria (CE/ES-MS = Capillary Electrophoresis / Electrospray Mass Spectometry) [28, 29, 30], mátrix-asszisztált lézerdeszorpciós / ionizációs time-of-flight tömegspektrometria (CE/MALDI-TOF-MS = Capillary Electrophoresis/Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectometry) [31,32], egyenletes folyású, gyorsított atombombázó tömegspektrometria (CE/CF-FAB MS = Capillary Electrophoresis/Continuous Flow-Fast Atom Bombardment Mass Spectometry)[33]. 12

1.3 Elektroforézis Az elektroforetikus elválasztási módszerek alapja, hogy az elektromos térben, az oldott anyagok különböző sebességgel vándorolnak. Egy ion sebességét a következő egyenlettel írhatjuk le: v = μ e E 1 ahol v az ion sebessége, μ e az elektroforetikus mozgékonyság, E az elektromos térerő. Az elektromos térerő az alkalmazott feszültség és a kapilláris hosszának hányadosa. Egy adott ion és közeg esetén a mozgékonyság állandó, és az adott ionra jellemző. Egy részecske mozgékonyságát a részecskére ható elektromos erő (F e ) és a közeg által kifejtett súrlódási erő (F s ) határozza meg. Az elektromos erő a F e = q E 2 a súrlódási erő (ideális gömb alakú ionok esetében) pedig a F s = 6 π η r v 3 egyenlettel írható le, ahol q az ion töltése, η az oldat viszkozitása, r az ion sugara, v az ion sebessége. Az elektroforézis során e két erő egyenlő, irányuk ellentétes, amiből következik, hogy: q E = 6 π η r v 4 A 4. egyenlet segítségével az ion sebességét kifejezve az 1. egyenletbe behelyettesítve a mozgékonyságot fizikai állandókkal leíró egyenletet kapjuk: q μe = 6 π η r 5 13

Az egyenletből egyértelműen látszik, hogy a kisméretű, nagy töltésű részecskéknek a legnagyobb a mozgékonysága, míg a nagyméretű de kis töltésű részecskék kisebb mobilitással rendelkeznek. Az abszolút (elektroforetikus) mozgékonysági adatok, melyek végtelen híg oldatra és teljes töltésű (α=1, lásd 4. ábra) részecskékre vonatkoznak, megtalálhatók a különböző fizikai állandókat tartalmazó táblázatokban. Az abszolút mozgékonysági értékektől a kísérleti úton kapott relatív (effektív) mozgékonysági értékek általában eltérnek, mivel ez utóbbi értékek függnek a ph-tól (az oldott anyag pk-jától) és a közeg (puffer) összetételétől. Az abszolút és relatív mozgékonyság közötti különbséget mutatja be a 4. ábra. Ha két részecske abszolút mozgékonysága teljes töltés mellett megegyezik, elvileg nem választható el egymástól, holott valójában e részecskék különböző pk értékük, és ph által megszabott töltésük miatt különböző mozgékonysággal rendelkeznek [9]. 4. ábra Két gyenge sav mozgékonyságának ph függése [9] 14

1.3.1 Elektroozmotikus áramlás Az elektroozmotikus áramlás (EOF = Electroosmotic Flow) a kapilláris elektroforézis egyik legfontosabb jelensége, amely nagymértékben befolyásolja az elválasztást. A szakirodalomban ritkábban, de használatos az elektroendoozmotikus áramlás megnevezés is. Az elektroozmotikus áramlás a kapilláris belsejét kitöltő folyadék egyirányú áramlását jelenti. Az EOF a folyadék kapilláris beli tömegtranszportja, mely a kapilláris belső falán kialakult felületi töltések (kettős réteg) következménye. Az EOF vektoriálisan (az irány lényeges!) hozzáadódik az oldott anyagok mozgékonyságán alapuló áramláshoz, de az elválasztásra nincs hatással. Kvarc kapilláris alkalmazása esetén a felületi szilanol csoportok ph függő disszociációjának következtében a kapilláris belső felszíne negatív töltésűvé válik, minek hatására a puffer kationjai feldúsulnak, a fal közelében elektromos kettősréteget hozva létre. Ez a kettős réteg a fal felületének közvetlen közelében egy zeta (ζ) potenciállal jellemezhető, és pár száz nanométer vastagságú [4].(5. ábra és 6. ábra) 5. ábra A kapilláris falán kialakuló kettős réteg ábrázolása [9] 15

6. ábra A ζ-potenciál csökkenése a kapilláris falától a puffer belseje felé haladva [36] a: adszorbeált ionokból álló kötött réteg; b: mozgékony (diffúz) ionréteg; c: puffer Helmholz egyenlete [4] alapján: π η μeo ζ = 4 ε 6 ahol μ eo az elektroozmotikus áramlás mobilitása (hányadosa), és ε a dielektromos állandó. A zeta potenciál ph-függő, mivel az ömlesztett szilika szilanol csoportjai gyenge savak. Magas ph-n, amikor a szilanol csoportok teljes mértékben deprotonálódnak, a zeta potenciál elérheti a 120 mv értéket [3]. A kettősréteg felszínhez közeli része statikus jellegű, míg a faltól távolabb elhelyezkedő diffúz része feszültség alkalmazásának hatására elmozdul a katód irányába. A diffúz kationos réteg magával vonja a pufferoldat teljes tömegét és ez a katód felé irányuló áramlás a tulajdonképpeni elektroozmotikus áramlás, amely a következő egyenletes sebességgel (v EOF ) jellemezhető [4]: v EOF = ( ε ζ / η) E 7 vagy μ EOF = ( ε ζ / η) 8 ahol v EOF az EOF sebessége, μ EOF az EOF mozgékonysága, ζ a zéta potenciál és ε a dielektromos állandó. 16

A kapillárisbeli EOF fontos jellemzője a dugószerű áramlási profil (7. ábra). Mivel az áramlás hajtóereje egyenletesen oszlik el a kapillárisban, egyáltalán nincs nyomásesés a kapillárison belül, s így az áramlás teljesen egyenletesnek tekinthető. 7. ábra Áramlási profilok és a hozzájuk tartozó részecske zónák Ezzel szemben a HPLC-re jellemző áramlási profil parabolikus, lamináris jellegű, mivel a falhoz közelebb eső folyadék kisebb áramlási sebességgel halad a kapilláris közepéhez viszonyítva. A kapilláris elektroforézisre jellemző lapos áramlási profil 1-2 nagyságrenddel is megnövelheti az elválasztás során elérhető elméleti tányérszámot a HPLC-hez viszonyítva [3]. Az EOF egy másik fontos előnye, hogy az gyakorlatilag az összes részecskét, függetlenül azok töltésétől, azonos irányú mozgásban tartja. A szokásos körülmények mellett (vagyis amikor a kapilláris belső felülete negatív töltésű) az áramlás az anódtól a katód irányába történik. A katód felé nemcsak a kationok vándorolnak, de az anionok is, mivel az EOF akár egy nagyságrenddel is nagyobb lehet az anionok sebességénél. Így a kationok, töltés nélküli részecskék és az anionok akár egyetlen CE-s futtatással is elemezhetők (8. ábra). Azonban a semleges molekulák szétválasztása nem valósítható meg szabad zónás kapilláris elektroforézises eljárással, de a micelláris elektrokinetikus kromatográfia kiváló kapilláris elektroforézis alternatívát nyújt a semleges mintakomponensek analízisére. 17

8. ábra A mintakomponensek detektálási sorrendje az elektroozmotikus áramlás hatására, pozitív polaritás esetén [23] 1.3.2 Az elektroozmotikus áramlás szabályozása Bár a meghatározásoknál az EOF általában előnyös, gyakran szükséges annak szabályozása. Nagy ph értékeknél az EOF akár olyan gyors is lehet, hogy az még az elválasztás megtörténte előtt a részecskék elúcióját okozza. Kis ph értékeknél viszont a negatív töltésű fal kationos részecskék adszorpcióját okozhatja (ez különösen a bázikus fehérjék elválasztásánál jelenthet problémákat). Az EOF szabályzásához elsősorban a kapilláris felületi töltésének vagy a puffer viszkozitásának megváltoztatása szükséges. Az EOF szabályozásának módszereit és a változtatott paraméter hatásának összefoglalását az 1. Táblázat tartalmazza. 18

1. Táblázat Az EOF szabályozásának módszerei [9] 1.3.3 Mozgékonyság és migrációs idő A szabad zónás kapilláris elektroforézis különböző elektroforetikus sebességű, illetve különböző migrációs idővel (t m ) rendelkező mintakomponensek szétválasztására alkalmas módszer. A migrációs idő alatt a mintakomponensek az L d utat teszik meg a 19

kapilláris belsejében, amely a kapilláris injektálási végétől a detektálás pontjáig terjed. A kapilláris teljes hossza az adott feszültségre létrejövő térerősséget határozza meg: E = V / L 9 ahol L a kapilláris teljes hossza. A migrációs idő és más kísérleti paraméterek alapján számítható ki a látszólagos mozgékonyság (μ l ) μ = 1 LD t E = LD L t V 10 ahol μ l =μ e +μ EOF, V a feszültség, L D a kapilláris effektív hossza (injektálási ponttól a detektorig), L a kapilláris teljes hossza, t a migrációs idő és E az elektromos térerő[9]. 1.3.4 Analitikai paraméterek Az elválasztást a szelektivitás, az elméleti tányérszám és a felbontás jellemzik [23]. Szelektivitás A szelektivitás számszerűleg két mintakomponens mobilitáskülönbségének és az átlagmobilitásuknak a hányadosa: α = μ 2 μ1 μ + μ 1 2 2 11 Elméleti tányérszám N μeff E = 2 D 12 ahol D a diffúziós állandó. 20

Felbontás Az elválasztástechnikában a végső cél a mintának komponenseire való bontása. A felbontás a legegyszerűbben a következőképpen adható meg: 2( t2 t1) t2 t1 R = = w + w 4 σ 1 2 13 ahol t a migrációs idő, w az alapvonali csúcsszélesség értéke időben és σ a jel standard deviációja [9,23]. 21

1.4 Kapillárelektroforézis technikák ismertetése A CE alapvető módszerei a kapilláris zónaelektroforézis (CZE), a kapilláris gélelektroforézis (CGE), a kapilláris izoelektromos fókuszálás (CIEF), a kapilláris izotachoforézis (CITP) és a micelláris elektrokinetikus kromatográfia (MEKC). 1.4.1 Kapilláris zónaelektroforézis (CZE ) A mai napig a legelterjedtebb kapilláris elektroforézis technika a szabadzónás kapillárelektroforézis. A kapillárist homogén pufferrel töltik fel, majd a minta injektálása után feszültséget kapcsolnak a rendszerre, amelynek hatására adott erősségű, hosszanti irányú elektromos tér (E) jön létre. Az elektromos tér hatására a mintakomponensek vándorlása kezdődik meg, mely töltés és molekulaméret függvényében a komponensek szétválásához vezet (9. ábra). A módszer hátránya, hogy a semleges, illetve az azonos fajlagos töltéssel bíró molekulákat nem lehet egymástól elválasztani. A kvarc kapillárison az elválasztás sorrendje a következő: kationok, semleges molekulák, anionok. Az elválasztás során leggyakrabban alkalmazott puffer a foszfát, borát és citrát puffer. A pufferekkel szemben követelmény, hogy azok fajlagos elnyelése illetve mozgékonysága kicsi legyen. Biológiai puffereket is szokás alkalmazni (Tris, CAPS), azonban ezek hátránya a jelentős UV elnyelés, viszont kicsi a Joule-hő fejlődés. 9. ábra Zónaektroforézis elválasztásának sematikus ábrája : kationok : semleges molekulák : anionok [23] 22

1.4.2 Kapilláris gélelektroforézis (CGE) A gélelektroforézis is a zónaelektroforézis elvén alapul, de az elválasztás egy molekulaszűrő hatással rendelkező gélben vagy polimer oldatban megy végbe (10. ábra). Az elválasztásra hatással van a molekula mérete, töltése és alakja. Az elektroozmotikus áramlás kiküszöbölésére általában kovalensen módosított belső felületű kapillárist alkalmaznak. A klasszikus gélelektroforézishez viszonyítva a kapillárisban végzett gélelektroforézis során 10-100-szor nagyobb térerővel lehet dolgozni, minimális felmelegedés mellett. A detektálás közvetlenül a kapillárisban történik. A módszer előnyei közé tartozik az automatizálhatóság. Az agarózzal, dextránnal, poli-(akrilamid)-dal, poli-(akrilamid/bisakrilamid)-dal és más gélekkel töltött kapillárisokban elsősorban nagyméretű biomolekulák: oligonukleotidok, DNS restrikciós fragmensek, PCR termékek, RNS fragmensek és fehérjék méret szerinti elválasztását szokták megvalósítani [21, 28, 35, 36, 37, 38, 39, 40]. 10. ábra Az elválasztás sematikus ábrája CGE-nél [23] 1.4.3 Kapilláris izoelektromos fókuszálás (CIEF) Az izoelektromos fókuszálás során ph gradienst alkalmaznak az elválasztás megvalósítására. A kapillárist úgynevezett amfolit oldatokkal töltik fel, amely különböző izoelektromos ponttal rendelkező ikerionos pufferek keverékéből áll. A kapilláris bemeneti és kimeneti végét sav illetve lúg oldatba merítik. A feszültség rákapcsolásakor a kapillárisban dinamikus ph gradiens alakul ki. Az elválasztani kívánt mintát az amfolit oldattal együtt töltik a kapillárisba. A mintakomponensek az izoelektromos pontjuknak megfelelő zóna elérésekor megállnak (11. ábra). A fókuszálás 23

után a mintakomponenseket nyomás vagy sóadagolás hatására juttatják el a detektorig. Az elválasztás során az elektroozmotikus áramlás teljes visszaszorítása szükséges, amit leggyakrabban a kapillárisfal kovalens vagy dinamikus borítása révén szoktak elérni. Kapilláris izoelektromos fókuszálással már a 0,005 pi egységnyi különbséggel rendelkező mintakomponensek elválasztása is megvalósítható [23]. A módszert elsősorban peptidek és fehérjék elválasztására illetve pi értékének meghatározására alkalmazzák. A módszer tömegspektrometriás csatolt technikával fontos alkalmazás a proteomikában. [41, 42, 43, 44, 45, 46]. 11. ábra Az elválasztás sematikus ábrája CIEF esetében. A kapilláris töltete a mintakomponensek és az amfolitok (A, B, C, D, E, F,G,H) keveréke [23] 1.4.4 Kapilláris izotachoforézis (CITP) Az izotachoforézisben a mintakomponenseket egy vezető (legnagyobb elektroforetikus mobilitású iont tartalmazó leading ) és egy záró (legkisebb elektroforetikus mobilitású iont tartalmazó terminating ) zóna közé szorítják be úgy, hogy az elektroforézis során a komponensek elektroforetikus mobilitáskülönbségük alapján elkülönülő sávokba sorakoznak fel, mely sávok azonos (a vezető ion által meghatározott) sebességgel haladnak át a kapillárison. (12. ábra) Az izotachoforézises eljárást gyakran használják mintaelőkészítés során dúsító lépésként szabad zónás kapilláris elektroforézist, micelláris elektrokinetikus kromatográfiát, kapilláris gélelektroforézist, vagy más elválasztásokat megelőzően [23, 24, 47, 48]. 24

12. ábra Az elválasztás sematikus ábrája ITP esetén L: vezető zóna T: záró zóna 1.4.5 Kapilláris elektrokromatográfia (CEC) A kapilláris elektrokromatográfia a kromatográfia és az elektroforézis előnyös tulajdonságait kombinálja. A mintakomponensek elválasztása kromatográfiás kölcsönhatáson alapul, míg a vándorlást a kapillárisban az elektroozmotikus áramlás biztosítja. Az áramlási profil ily módon dugószerű marad, ami így nem okoz csúcsszélesedést [49]. A kapilláris elektrokromatográfiát sikerrel alkalmazzák gyógyszerkutatásban és minőségi ellenőrzésben [50], biomolekulák: fehérjék, nukleinsavak, peptidek, antitestek elválasztásában és analízisében [51, 52], királis elválasztások területén [53, 54], DNS adduktok analízisében [55]. 25

1.4.6 Micelláris elektrokinetikus kromatográfia (MEKC) 1.4.6.1 Az elválasztás elve A micelláris elektrokinetikus kromatográfiát Terabe és munkacsoportja vezette be 1984- ben [7, 8] és azóta az egyik legelterjedtebb elválasztási módszerré vált. A kapilláris zónaelektroforézissel a töltéssel rendelkező mintakomponensek elválasztása megvalósítható, azonban a semleges molekulák vándorlási sebessége között ezzel a módszerrel nem lehet különbséget tenni. A MEKC alkalmazásával már a töltéssel nem rendelkező mintakomponensek elválasztására is lehetőség nyílik, a töltéssel rendelkező mintakomponensek elválasztásával egy időben. Az alkalmazott elektrolit oldat általában valamilyen anionos felületaktív anyagot tartalmaz (ph 6-10 között), a kritikus micellakoncentrációt (CMC) meghaladó mennyiségben, amikor is a felületaktív anyag micellákat képez (13. ábra). A belül hidrofób, kívül negatív töltésű micellák pszeudoállófázist alkotnak [49]. A mintakomponensek hidrofób, vagy elektrosztatikus kölcsönhatásba léphetnek a micellákkal és ezáltal a klasszikus kromatográfiához hasonlóan, a mintakomponensek megoszlanak a puffer vizes fázisa és a micellák hidrofób belseje között. Az elválasztás során a micellák szerepe hasonló a kromatográfiás álló fázisokéhoz, ezért a micellákat gyakran nevezik pszeudostacioner fázisnak illetve pszeudoállófázisnak. (14. ábra) 13. ábra Micellák lehetséges szerkezete [23] 26

14. ábra A micelláris elektrokinetikus kromatográfiás elválasztás elve [23] A rendszer feszültség alá helyezésekor, a micellák μ app,mc látszólagos micelláris mobilitással vándorolnak a kapillárisban. Ez a mobilitás a micellák mobilitásának (μ mc ) és az elektroozmotikus áramlásnak az összegével egyenlő: μ = μ + μ app, mc mc eo 14 Anionos micellák esetében a két mobilitás irányultsága ugyan ellentétes, azonban az elektroozmotikus áramlás mobilitása általában meghaladja a micellák ellentétes irányú mobilitásának mértékét, és így a micellák a gyors elektroozmotikus áramlás hatására a katód irányába mozdulnak el. A micellák hosszú migrációs idővel, de áthaladnak a detektor előtt. A MEKC-ben a mintakomponensek retencióját az adott komponens hidrofobicitása határozza meg. Az elválasztás során három fő csoportot különböztetünk meg: Vannak olyan hidrofil vegyületek, amelyek nem lépnek kölcsönhatásba a micellákkal, azaz mindvégig a vizes fázisban tartózkodnak, és csak az elektroozmotikus áramlás 27

hatására mozdulnak el a kapillárisban. Ezeknek a vegyületeknek a migrációs ideje megegyezik az elektroozmotikus áramláshoz tartozó t 0 idővel Vannak olyan erősen hidrofób vegyületek, amelyek a micellák belsejében tartózkodnak és a micellákkal együtt mozognak a kapillárisban, vagyis a migrációs idejük megegyezik a micellák migrációs idejével. (μ app, i =μ app, mc ) Az előző két csoportba nem tartozó vegyületek a hidrofobicitásuk által meghatározott arányban idejük egy részét a vizes, másik részét a micelláris fázisban töltik. Anionos tenzidek esetében: t 0 t m t mc A leggyakrabban alkalmazott micellaképző anyagok az anionos tenzidek, és ezek közül is a leggyakrabban a nátrium-dodecilszulfátot (SDS) alkalmazzák [56,57,58,59,60] Kationos felületaktív anyagok alkalmazásánál bizonyos koncentráció alkalmazásakor az elektroozmotikus áramlás értéke nulla lesz, és adott koncentráció felett az áramlási irány megváltozik [4,57]. Ennek magyarázata az, hogy a pozitív töltésű részükkel elektrosztatikus kölcsönhatásba lépnek a kapilláris negatív töltésű falával és a hidrofób rész a kapilláris belseje felé fordul. A további micellaképzők pedig kettős réteget alakítanak ki a kapilláris fala mentén, így a kapilláris belső felületére a pozitív töltés lesz jellemző (15. ábra). A nemionos és ikerionos micellaképzők enyhébb hatással vannak az elektroozmotikus áramlásra, és a fehérjék szerkezetére is [61,56]. Az epesavak sói is gyakran használt biológiai felületaktív anyagok. Rendelkeznek mind hidrofil, mind hidrofób csoportokkal és vizes oldatokban királis micellákat képeznek, tehát optikai izomerek elválasztását is lehetővé teszik. Előfordul, hogy más, pl. SDS pufferoldatokhoz adagolják az elválasztás jobb felbontása érdekében [62, 63]. Kevert micellás rendszerrel tovább lehet fokozni az elválasztás szelektivitását és hatékonyságát [64]. A MEKC-ban alkalmazott micellaképzők csoportosítását a 2. Táblázat tartalmazza. 28

15. ábra A kapilláris belső felületén kialakuló kettős réteg kationos micellaképző alkalmazásakor 2. Táblázat A MEKC-ban alkalmazott felületaktív anyagok csoportosítása, valamint azok vizes oldatra vonatkozó CMC értékei [23] 29

1.4.6.2 Retenciós faktor A klasszikus folyadékkromatográfiában a retenciós faktort (k ) az állófázis és a mozgó fázis közötti megoszlás jellemzésére alkalmazzák, aminek értéke az alábbi egyenlet alapján számítható: k' HPLC t = r t t 0 0 15 ahol t r a retenciós idő, t 0 pedig a holtidő. A micelláris elekrtokinetikus kromatográfiában a HPLC analógiájára 1984-ben Terabe és munkatársai vezették be a retenciós faktor fogalmát [7]. Mivel a MEKC-ban mindkét fázis mozog, a megfelelő komponensek retenciós faktorát korrigálni kell. A MEKC-ban alkalmazott retenciós faktor számítását az alábbi egyenlet írja le: k' = t 0 t m t 0 V = K ( 1 tm / tmc ) VM s 16 ahol K a megoszlási hányados, V s a micelláris fázis térfogata és V M a mozgófázis térfogata. Az adott mérési körülményhez tartozó t 0 illetve t m értékeket metanol illetve szudán (III) injektálásával szokták meghatározni [7, 8]. A 16. egyenlet alapján jól látható, ha t mc értéke végtelen, azaz a micelláris fázis állófázissá lényegül, akkor a retenciós faktort meghatározó képlet azonossá válik a klasszikus retenciós faktor képletével. Ha egy adott mintakomponens a migrációs ideje alatt végig a vizes fázisban tartózkodik, akkor a hozzá tartozó retenciós faktor, k =0. Amennyiben a mintakomponens az elválasztás során végig a micella belső zsebében tartózkodik, azaz t m =t mc, a retenciós faktor k =. Elmondható tehát hogy a Terabe által bevezetett retenciós faktor értéke nulla és végtelen között mozog. (16. ábra) 30

500 400 300 k' 200 100 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 t m (min) 16. ábra A k paraméter változása a migrációs idő függvényében (t 0 =4 min, t mc =40 min) [65] Munkacsoportunk 1996-ban vezette be a módosított retenciós faktort, amelynek jele k. Ez a fajta retenciós faktor az alábbi egyenlet alapján számítható [65]: t k" = t m mc t 0 t 0 17 Amennyiben egy mintakomponens az elválasztás során a migrációs ideje során végig a vizes fázisban tartózkodik, azaz t m =t 0, akkor a hozzá tartozó k érték 0. Ha a mintakomponens az elválasztás ideje alatt a migrációs idejének teljes hányadát a micelláris fázisban tölti, azaz t m =t mc, akkor k =1. Amennyiben a mintakomponens a migrációs ideje egy részét a micelláris, másik részét pedig a vizes fázisban tölti, azaz t 0 < t m < t mc, akkor k értéke nulla és egy közé esik. A k paraméter nagy előnye hogy véges tartományban mozognak az értékei. (17. ábra) 31

1,0 0,8 0,6 k" 0,4 0,2 0,0 5 10 15 20 25 30 35 40 t m (min) 17. ábra A k paraméter változása a migrációs idő függvényében (t 0 =4 min, t mc =40 min) [65] Korábban szimulált adatok felhasználásával munkacsoportunk kimutatta, hogy az újonnan bevezetett k módosított retenciós faktor meredeksége állandó a migrációs idő függvényében, tehát adott migrációs idő különbségnek (Δtm) ugyanaz a k retenciós faktor különbség (Δk ) felelt meg a migrációs ablak teljes hosszában. A k paraméter nagy előnye, hogy számíthatók belőle a vizes (t aq ) illetve a micelláris (t mic ) fázisra vonatkozó fázistartózkodási idők t mic = t mc k " 18 t aq ( 1 ") = t 0 k 19 A két egyenlet összege kiadja a migrációs időt: t ( 1 k" ) t " m = tmic + taq = t0 + mck 20 32

1.4.6.3 A MEKC elválasztást jellemző fizikai paraméterek A MEKC-ben is mint más folyadékkromatográfiás módszernél is az elválasztást a szelektivitás, az elméleti tányérszám és a felbontás jellemzi [4]. Szelektivitás: α = k' 2 / k' 1 21 Ahol k 1 és k 2 két egymást követő retenciójú mintakomponens retenciós faktorai. Elméleti tányérszám: μ N = app L 2 D d mc E 22 Ahol D mc a micella diffúziós állandója. Felbontás: R s = 1/ 2 N α 1 k' 2 1 t0 / tmc 4 α 1 + k' 1 + ( t / t ) k' 2 0 mc 1 23 [66] Ahol N az elméleti tányérszám, α a szelektivitás. A képletben az utolsó tag jelenti a különbséget a hagyományos HPLC-nél alkalmazott képlethez képest. Ahogy a t mc érték eléri az egyet, a képlet utolsó tagja értékben nulla lesz, és ily módon a HPLC-nél is alkalmazott képlethez jutunk. Ha a t mc értéke egy, az azt jelenti, hogy a micelláris fázis nem mozog, azaz állófázisnak tekinthetjük. A 23. egyenlet alapján a felbontóképességet a hatékonyság, szelektivitás és a retenciós faktorok révén lehet optimalizálni. Jó felbontást eredményez, ha széles a migrációs idő ablak, vagyis a t 0 és a t mc által határolt időintervallum, amit az elektroozmotikus áramlás visszaszorításával, vagy nagy elektroforetikus mobilitással rendelkező anionos micellákkal lehet elérni. Az elválasztást a micellák méretének, töltésének, térszerkezetének változtatása révén lehet befolyásolni (18. ábra). 33

18. ábra Különböző térszerkezetű (anionos) micellák sematikus ábrája. A fehér kör a micellaképző hidrofil részét jelöli. (A) hosszú alkilláncú micellaképző (B) mikroemulzió (C) polimerizált felületaktív anyag (pl.:polysua) (D) csillag polimer (E) dendrimer [66]. A retenciós faktorok általában lineárisan nőnek a micellaképzők koncentrációjával [23], a micellaképzők koncentrációjának növelését azonban korlátozza a feszültség arányos emelkedése, amely felmelegedéshez vezet. Az elválasztás szempontjából legmegfelelőbb micellaképző kiválasztása után a szelektivitást a puffer koncentrációja, ph-ja, vagy más adalékok (pl. urea, metanol, királis szelektorok: ciklodextrinek, epesavak) használata révén lehet fokozni. Az adalékokkal szabályozni lehet az elektroozmotikus áramlás mértékét, meg lehet akadályozni a fal felületére történő adszorpciót, illetve be lehet vezetni egy újabb elválasztási mechanizmust [4, 27, 63, 67, 68, 69]. A szabad zónás kapilláris elektroforézishez hasonlóan polimeres falborítással is lehet optimalizálni az elválasztást, mint pl. poli-(akrilamid), polibrén és poli- (vinilszulfonát) felhasználásával [70, 71]. 1.4.6.4 Alkalmazási területek A micelláris elektrokinetikus kromatográfiát mint módszert gyakran alkalmazzák gyógyszerhatóanyagok és más vegyületek hidrofobicitásának jellemzésére [72, 73]. A gyógyszerek, gyógyszer jelölt molekulák hidrofobicitása fontos szerepet játszik a molekula biológiai hatásmechanizmusában, mivel ahhoz, hogy a molekula hatását a megfelelő helyen kifejthesse, apoláris lipid mebránokon kell átjutnia. A gyógyszer tervezés egyik fontos eszköze a molekula hidrofobicitásának becslése fizikai-kémiai paramétereik alapján. Ennek eszköze Hansch javaslata óta a logp érték (oktanol/víz megoszlási hányados logaritmusa) meghatározása [74,75]. E módszer alkalmazásának 34

nehézségei (anyag-, idő- és munkaigény) a figyelmet részben a kémiai szerkezet alapján végzett számítógépes hidrofobicitás becslés (CLOGP), predikció, illetve az elválasztástechnikai módszerek felé fordították, amikor is az elválasztástechnikai módszer alkalmazása során nyert adatokat alkalmazzák és a hidrofobicitás jellemzésére. A MEKC analízis során mért kisérleti adattal, illetve az ebből számolt kapacitás faktorral (k ) jellemzik a vizsgált molekula hidrofobicitását. Különösen jelentőssé váltnak a gyors elválasztási módszerek (így a MEKC is) a kombinációs molekula könyvtárak megjelenésével, alkalmazásával, mert rendkívül nagyszámú molekula gyors jellemzésére van szükség. A módszer továbbá alkalmas peptidek és analógjaik [76], aminosavak [77], fehérjék [78], vitaminok [79], enantiomerek [80, 81], DNS-adduktok analízisére [82]. A MEKC-t mint módszert élelmiszeranalítikai célokra is alkalmazzák. Burton és munkatársai a kávéban található koffein meghatározására fejlesztettek ki módszert. A leggyakrabban alkalmazott SDS fázis mellet kipróbálták cetil-trimetilammóniumkloridot (CTAC) is mint micellaképzőt. Tapasztalataik szerint jobb reprodukálhatóság volt elérhető. Ennek oka, hogy a CTAC lecsökkentette a kávéban található kationos összetevők falhoz való adszorpcióját. [83] A bűnügyi laboratóriumokban is alkalmazzák a MEKC-t, többek között illegális kábítószerek, illetve robbanószermaradékok meghatározában.[83] A MEKC segítségével királis elválasztás is megvalósítható. Ebben az esetben valamilyen természetes vagy szintetikus királis micellaképzőt alkalmaznak, vagy valamilyen nem királis micellaképzőt kevernek ciklodextrinekkel. A leggyakrabban alkalmazott királis felületaktív anyagok az epesavak. Számos olyan biológiai folyamat létezik, amelyet nehéz direkten vizsgálni, mint például a vér-agy gáton való átjutás, biológiai hozzáférhetőség, adszorpció vagy penetráció biológiai membránokon. Az ilyen összetett jelenségek becslésére általánosan elfogadott az egyszerűsített modellrendszerek alkalmazása. A kromatográfiás módszerek, beleértve a MEKC-t is, megbízható és egyszerű utat kínálnak olyan tulajdonságok vizsgálatára, amelyek fontos szerepet játszanak egyes biológiai folyamatokban [84, 85, 86]. 35

A klinikai vizsgálatok során is alkalmaznak MEKC-ás technikákat. Az irodalomban található módszerek között szerepel biomarkerek és metabolitok testfolyadékból történő meghatározása is. A biomarkerek fontos szerepet játszanak bizonyos betegségek korai diagnosztizálásában, míg a metabolitok vizsgálata gyógyszerkutatásban játszhat fontos szerepet. A testnedvekben legtöbb célvegyület nagyon kis koncentrációban találhatók meg, ezért nagyon fontos a megbízható nagy érzékenységű kimutatási módszer alkalmazása. A plazma minták direk injektálásával történő cefotaxime és annak deacetilezett metabolitjának MEKC-ás meghatározását először Nakagawa és munkatársai írták le. A CZE és MEKC mérések összehasonlításából kitűnik, hogy a MEKC-ra épülő meghatározás egyszerűbb, gyorsabb, pontosabb és érzékenyebb, mint a CZE-en alapuló módszer [87]. 36

2. Célkitűzések MEKC módszer alkalmazása a kiválasztott vegyületcsoportok hidrofobicitásának meghatározására az elválasztás során kapott retenciós adatok alapján. Egy olyan módszer kidolgozása, amely jellemzi az elválasztás során alkalmazott pszeudostacioner fázis hidrofobicitását és a mintával való kölcsönhatását. Mindezt a MEKC-ban alkalmazott normalizált retenciós faktor segítségével kívánom meghatározni. Bizonyítani kívánom, hogy a MEKC mérések során kapott retenciós idők alapján nem csak a vizsgált vegyület hidrofobicitása jellemezhető, hanem a vizsgált vegyületek segítségével maguk az elválasztás során alkalmazott fázisok hidrofobicitása is jellemezhető. Mindezen jellemzések után az alkalmazott fázisok várhatóan összehasonlíthatóvá válnak. A MEKC mérések során az alkil-benzol homológ sor esetében kapott paraméterek segítségével meg kívánom határozni a vizsgálatok során alkalmazott pszeudostacioner fázisok metilénszelektivitását. Továbbá igazolni kívánom azt a feltételezésemet, miszerint az újonnan bevezetett paraméter, a normalizált retenciós faktor alkalmas a metilénszelektivitás meghatározására is. 37

3. Módszerek 3.1 Vegyszerek A kísérletek során az alábbi vegyszerek kerültek felhasználásra: A nátrium-dodecilszulfát (SDS) a Fluka terméke (Buchs, Svájc). Az aceton, a nátriumhidroxid (NaOH), a sósav (HCl), és a bórsav (H 3 BO 3 ) analitikai tisztaságban a Reanaltól (Budapest, Magyarország) került beszerzésre. Míg a HPLC tisztaságú acetonitri a Chemolab (Budapest, Magyarország) terméke. A peptidszintézisek során felhasznált aminosavak a Bachem-től (Bubendorf, svájc) származnak. A foszforsav, a szudán III, a lítiumhidroxid, a nátrium dihidrogén-foszfát monohidrát, a dinátrium hidrogén foszfát, a dinátrium tetraborát és a metanol a Merck (Darmstadt, Németország) termékei. A nátrium-kolát (SC), tetradecil-trimetilammónium-bromid (TTAB), hexadeciltrimetilammónium-bromid (HTAB) és a lítium-perfluoroktán-szulfonát (LiPFOS) a Fluka-tól került beszerzésre, míg a nátrium-deoxikolát (SDC) az Aldrich-tól (Milwaukee, WI, USA) származik. A reagens tisztaságú teszt vegyületek (alkil-benzolok, alkil-fenolok, alkoholok, és az egyéb aromás vegyületek) forrása több különböző gyártótól való, azonban a tisztaságukról elmondható hogy reagens vagy annál nagyobb tisztaságúak voltak. Az oldatok elkészítéséhez az Elgastat UHP (Elga, Anglia) víztisztító készülék által előállított ioncserélt, baktériummentes és szerves szennyezőktől mentes vizet használtuk. 3.2 Vizsgált vegyületek Munkám során a vizsgált vegyületek az alábbi csoportokba sorolhatók: Alkil-benzolok: benzol, toluol, etil-benzol, propil-benzol, butil-benzol Alkil fenonok: propiofenon, butirofenon, valerofenon, heptanofenon Alkoholok: pentán-1,5-diol, bután-1-ol, pentán-3-ol, pentán-1-ol 38

Vegyes csoport: anilin, o-toluidin, benzaldehid, metil-benzoát, naftalin MDR-peptidek MDR peptidek Az alábbiakban felsorolt di-, tri- és tetrapeptidek a munkacsoportunk által szintetizált hidrofób, multidrog rezisztencia ellenes hatásra tesztelt, tehát potenciális reverzin molekulák. A peptideket hagyományos vizes fázisú módszerrel szintetizáltuk, a peptidszintézist követően a szabad karboxil- és amino- végződéseket védő csoportokat nem választottuk le. (Z-Pro) 2 -Lys-OMe [BOC-Glu(OBzl)] 2 -Lys-OMe [BOC-Asp(OBzl)-Lys(Z)]-OtBu [BOC-Pro-Glu(OBzl)] 2 -Lys-OMe [BOC-Pro-Pro-Glu(OBzl)] 2 -Lys-OMe [BOC-Asp(OBzl)-Glu(OBzl)] 2 -Lys-OMe FMOC-Glu[Lys(Z)OtBu] 2 A védőcsoportok rövidítései: BOC: t-butiloxikarbonil; tbu: t-butil; Z: benziloxikarbonil; FMOC: 9-fluorenilmetiloxikarbonil; Bzl: benzil; Me: metil. 3.3 Vizsgált pszeudostacioner fázisok Munkám során a vizsgálni kívánt pszeudostacioner fázisok kiválasztásánál fontos szempont volt, hogy jellegében egymástól eltérő micellaképző anyagok kerüljenek a vizsgálati csoportba. Így a felületaktív anyagok között szerepel anionos, kationos, oldallánc hosszúságában két metilén-csoportban eltérő illetve perfluorozott felületaktív anyag. A kiválasztott fázisképzők a következők: nátrium-dodecilszulfát (SDS), nátriumdeoxikolát (SDC), nátrium-kolát (SC), tetradecil-trimetilammónium-bromid (TTAB), hexadecil-trimetilammónium-bromid (HTAB) és a lítium-perfluoroktán-szulfonát (LiPFOS) (19. ábra). 39

SDS TTAB HTAB SC SDC LiPFOS 19. ábra A vizsgálatok során alkalmazott micellaképző vegyületek szerkezeti képlete 3.4 Készülékek 3.4.1 ISCO Model 3850 Capillary Electropherograph A micelláris elektrokinetikus kromatográfiás vizsgálatok az MDR peptidek esetében ISCO Model 3850 Capillary Electropherograph (Lincoln, NE, USA) készüléken történtek. Az elválasztások nem módosított belső felületű, 50 μm belső átmérőjű és 375 μm külső átmérőjű ömlesztett kvarc kapillárisban (Polymicro Technologies, Phoenix, AZ, USA) zajlottak, amelynek teljes hossza 60 cm, a detektorablakig pedig 40 cm. A minták injektálása a gyárilag beépített, változtatható osztásarányú mintaosztón (split) 40

keresztül zajlott, a mérések során minden esetben az 1:1000 osztásaránnyal történt, vagyis minden esetben az osztófejbe injektált minta 1/1000 része (1 μl mintából 1 nl) jutott a kapillárisba. Mérések során mindkét: pozitív (anód az injektor felől), illetve negatív (katód az injektor felől) polaritás alkalmazásra került. A feszültség 21 kv-ra lett beállítva, optimalizálást követően. A detektálás spektrofotométerrel, az adatgyűjtés és feldolgozást az ISCO ChemResearch vezérlő, adatgyűjtő és adatfeldolgozó rendszerével történt. 3.4.2 Beckman P/ACE System 5500 Az MDR-peptidek kivételével a tesztvegyületek méréseit Roses és munkatársai végezték Barcelonában, egy Beckman P/ACE 5500-as diódasoros UV detektorral szerelt kapilláris elektroforézis készüléken. A borítatlan kvarc kapilláris effektív hossza 40 cm volt, 50 μm belső átmérő mellett. A kapilláris kondicionálása minden egyes micellaképző közötti váltás esetén az alábbiak szerint történt: 5 perc vizes mosás, 20 perc mosás 1 M-os lúggal, 10 perc mosás vízzel, 10 perc mosás 0,1 M-os lúggal, 20 perc mosás az elválasztó pufferrel. Minden egyes futtatás előtt a kapilláris 5 percen keresztül át lett öblítve a futtató pufferrel. Az elválasztás 25 C-on anionos felületaktív anyagok esetén +15 kv feszültséggel, kationos felületaktív anyagok esetén -15 kv-tal történt. A detektálás 214 nm-en zajlott. Az injektálás nyomással történt, 0,5 p.s.i.*1sec (1 p.s.i.= 6894,76 Pa). 3.5 Pufferek Az MDR peptidek esetében a futtatóelegy 0,1 M Na-borát puffer (ph=7,70) amely 75 mm SDS-t tartalmaz. A Na-borát puffer elkészítése 0,1 mol H 3 BO 3 és 0,05 mol NaOH 1000 ml vízben való oldásával készült, amelynek ph-ja 0,1 M-os HCl oldat segítségével ph=7,70-re lett beállítva. LiPFOS esetében a puffer készítése az alábbiak szerint történt. 40 mm LiPFOS került oldásra vízben, H 3 PO 3 hozzáadása mellett (20 mm), a ph =7,0-ra lett beállítva LiOHdal. Az SDS 40 mm, a SC 80 mm, a TTAB 20 mm, a HTAB 20 mm koncentrációban került oldásra ph=7,00-es 20 mm-os nátrium foszfát pufferben. 41

A SDC 40 mm koncentrációban került oldásra 20 mm-os nátriumfoszfátnátriumtetraborát pufferben ph=8,0 mellett. 3.6 Minták 3.6.1 MDR-peptidek A peptidek oldására acetonitril-víz = 1:1 elegyében került sor, 1 mg/ml koncentrációval. Az peptidet tartalmazó oldatok szűrve lettek, egyszerhasználatos szűrőfeltétek segítségével (Spartan 13 (Schleicher and Schuell, Dassel, Németország). A szudán-iii oldása acetonitrilben történt, 1 mg/ml koncentrációban, ami a micelláris marker. 3.6.2 Tesztanyagok A tesztvegyületek 2 mg/ml koncentrációban kerültek oldásra metanolban, ami egyben áramlás marker is, és kb. 2 mg/ml koncentrációban dodekafenont is tartalmaz, ami micelláris marker -ként funkcionál. Minden oldat szűrésre került, 0,45 μm-es szűrő felhasználásával (Albet). 3.7 Hidrofobicitás Az egyes vegyületekhez tartozó hidrofobicitás értékeket egy interneten keresztül elérhető számítógépes program segítségével számoltam ki. (www.daylight.com/daycgi/clogp) A program a Hansch-Leo fragmens konstans módszer alapján végzi a CLOGP értékek számítását, azaz a kémiai szerkezet alapján prediktálja a hidrofobicitás értékeket. 42