A tejelő tehenek szubklinikai ketózisának kimutatására szolgáló elektronikus istállópróba értékelése

J. Dairy Sci. 92: 1-7., doi: 10.3168/jds.2008-1795 American Dairy Science Association, 2009 A tejelő tehenek szubklinikai ketózisának kimutatására szolgáló elektronikus istállópróba értékelése M. Iwersen, U. Falkenberg, R. Voigtsberger, D. Forderung and W. Heuwieser 1,2 Szaporodásbiológiai Klinika, Állatorvos-tudományi Kar, Berlini Szabadegyetem, 14163 Berlin, Németország] ÖSSZEFOGLALÁS E vizsgálat célja az volt, hogy meghatározza egy, a béta-hidroxivajsav (bétahidroxibutirát, BHBA) mérésére szolgáló elektronikus kézi mérőműszer (Precision Xtra) diagnosztikai teljesítőképességét tejelő tehenekben. A specifikus célok között szerepelt az elektronikus BHBA-mérő eszközzel mért értékek összehasonlítása a vérsavó fotometriás módszerrel meghatározott BHBA-koncentrációival és két gyakran használt kémiai istállópróbával (Ketostix, Ketolac) kapott eredményekkel, valamint a mérés pontosságának értékelése egy 35 vizsgáló személy bevonásával végzett üzemi vizsgálat során. Az 1. kísérlet során gyűjtött 196 vérminta közül 17 (8,7%) tartalmazott 1200 µmol/liter vér BHBA-t, 10 vérminta (5,1%) pedig 1400 µmol/liter vér BHBA-t. A Pearson-féle korrelációs koefficiensek minden teszt esetében erősen szignifikánsak voltak. A legmagasabb korrelációs koefficiens (0,95) a teljes vér Precision Xtra teszttel meghatározott BHBA-koncentrációi és a fotometriásan meghatározott vérsavóbeli BHBA-koncentrációk között adódott. A Precision Xtra teszttel a vérsavóban és a Ketostix próbával a vizeletben, illetve a Ketolac próbával a tejben talált BHBAkoncentrációk között alacsonyabb korrelációs koefficienseket kaptunk. A Precision Xtra teszt a 1400 µmol/liter vér BHBA-koncentrációk esetén 100%-os érzékenységet és specificitást mutatott. A tej- és vizeletmintákon végzett mérések során a pozitív és a negatív prediktív (előrejelző) értékek jelentősen alacsonyabbak voltak a két kémiai próba, valamint az elektronikus mérőeszköz alkalmazása esetén egyaránt. A második, összesen 35 szarvasmarhapraxis bevonásával végzett vizsgálat során 926 vérmintát gyűjtöttünk. Ebben a vizsgálatban a Precision Xtra teszt érzékenysége 1200 µmol/liter vér BHBA-koncentrációnál 88%-os, 1400 µmol/liter vér BHBA-koncentrációnál pedig 96%-os volt, specificitása pedig a fenti koncentrációk esetében 96%-osnak, illetve 97%-osnak bizonyult. A több vizsgáló bevonásával végzett második vizsgálatban az egyezés szintje alacsonyabb volt. Az egyes vizsgáló személyek között jelentős különbségek mutatkoztak a variancia tekintetében. Eredményeinkből arra következtetünk, hogy az elektronikus kézi BHBA-mérő rendszer teljes vér alkalmazása esetén hasznos és gyakorlatias eszköz a szubklinikai ketózis diagnosztizálására. Érzékenysége és specificitása kitűnő ahhoz képest, hogy istállópróbáról van szó, és nagyobb, mint két gyakran alkalmazott kémiai tesztcsíkos módszeré (Ketostix és Ketolac). Kulcsszavak: Szubklinikai ketózis, béta-hidroxivajsav, diagnosztikai teszt, teljes vér Közlésre érkezett 2008. október 8., közlésre elfogadva 2009. január 21. 1 Levelező szerző: wolfgang.heuwieser@ubc.ca 2 Jelenlegi cím: Animal Welfare Program, Faculty of Land and Food Systems, The University of British Clumbia, Vancouver, BC, V6T 1Z4, Kanada

BEVEZETÉS Szubklinikai ketózisról akkor beszélünk, ha a keringő vérben megemelkedett a ketonanyagok koncentrációja, ketózisra utaló klinikai tünetek viszont nincsenek (Andersson, 1988). A szubklinikai ketózisos és az attól mentes tehenek megkülönböztetésére a vér 1400 µmol/literes BHBA-koncentrációját javasolták küszöbértékként (Duffield, 1997; Geishauser és munkatársai, 2001; Oetzel, 2004). A szubklinikai ketózis a tejtermelés csökkenése, a szaporodási mutatók romlása, az oltógyomor-helyzetváltozás fokozott kockázata és a klinikai ketózis kialakulásának nagyobb valószínűsége révén okozhat gazdasági veszteségeket. A szubklinikai ketózis diagnosztizálásának aranyszabvány módszere a béta-hidroxivajsav (béta-hidroxibutirát, BHBA) vérsavóban vagy vérplazmában történő mérése (Duffield, 2000). A vérsavó BHBA-koncentrációjának mérése jól használható az egyes tehenek vizsgálatára, valamint az állomány egészségének értékelésére és a takarmányozási gyakorlat megfelelőségének nyomon követésére. A BHBA mennyiségi meghatározásához azonban speciális laboratóriumi felszerelések szükségesek, és e módszer alkalmazása vérminták vételét, centrifugálását, a vérplazma- vagy vérsavóminták lefagyasztását, és a fagyasztott minták laboratóriumba szállítását igényli. Az irodalomban hasznos ajánlások jelentek meg, melyek célja, hogy a szubklinikai ketózissal küzdő állományok vizsgálata során biztosítani lehessen az optimális eredményeket (Stokol és Nydam, 2005). Több gyors istállópróbát fejlesztettek ki a fenti nehézségek kiküszöbölése, a laboratóriumi költségek csökkentése és a közvetlenül a mintavétel utáni eredményközlés biztosítása érdekében (a tehén mellett végezhető istállópróbák ). A ketózis kimutatására több (a tehén mellett végezhető) istállópróba kapható a kereskedelemben (tesztcsíkok, porok, tabletták). E próbákat elsősorban az acetecetsav és kisebb mértékben az aceton - vizeletben történő kimutatására (pl. Ketostix csík, Bayer, Leverkusen, Németország) vagy a BHBA tejben történő kimutatására (pl. Ketolac, Biolab, München, Németország) fejlesztették ki: a kimutatás a megfigyelhető színváltozás mértéke alapján történik. A tesztek szemikvantitatív módszerekként is használhatók, mivel a színváltozás a ketonanyagok magasabb szintjének jelenlétében intenzívebb. A kereskedelemben kapható istállópróbák részletes összehasonlításáról korábban több összefoglaló közlemény is megjelent (Geishauser és munkatársai, 1998, 2000; Carrier és munkatársai, 2004). Ezeknek az istállópróbáknak a tesztjellemzői tesztenként és vizsgálatonként változnak. A szakemberek egyetértenek abban, hogy az istállópróbák hasznos eszközök a szubklinikai ketózis egyedi eseteinek diagnosztizálására és az állomány egészségi állapotának figyelemmel kísérésére. E vizsgálati módszerek hátrányaként a következőket írták le: költségek, a tejmintákkal végzett tesztek nem megfelelő érzékenysége, a vizeletmintákkal végzett vizsgálatok nem megfelelő specificitása, valamint a vizeletminták vételének szükségessége (Carrier és munkatársai, 2004). A tejminták vizsgálata előtt emellett tanácsos megvizsgálni a magas szomatikus sejtszám esetleges jelenlétét, mivel a tej magas szomatikus sejtszáma hamis pozitív eredményeket okozhat (Jeppesen és munkatársai, 2006). A humán gyógyászatban a cukorbetegség ellenőrzésére széles körben alkalmazzák az elektronikus kézi glükóz- és ketonanyag-mérési rendszereket (Guerci és munkatársai, 2005). Az első beszámoló, amely egy elektronikus humán BHBA-mérő (MediSense Precision, Abbott, Abingdon, Egyesült Királyság) tejelő teheneken való alkalmazását írta le, magas korrelációt (r 2 = 0,99) írt le a spektrofotometriásan (az arany szabvány módszerrel) meghatározott BHBA-koncentrációkkal, és alkalmasnak minősítette a tesztet a tejelő tehenek szubklinikai ketózisának kimutatására (Jeppesen és munkatársai, 2006). Más vizsgálatokban ugyanezt a mérőeszközt használták arra, hogy meghatározzák a glükogén prekurzorok hatékonyságát 45 hústehén szubklinikai ketózisának megelőzésére (Endecott és munkatársai, 2004), illetve a szubklinikai ketózis Peru nagy tejtermelő tehenészeteiben való előfordulási Journal of Dairy Science 92. kötet, 6. szám, 2009 2

gyakoriságának meghatározására (Bryk-Lucy és munkatársai, 2008). E vizsgálatok közül azonban egy sem közölt semmilyen adatot a teszt jellemzőiről. A jelen vizsgálat célja az volt, hogy meghatározza, milyen diagnosztikai teljesítményt nyújt egy elektronikus BHBA-mérő rendszer (Precision Xtra, Abbott Diabetes Care, Abingdon, Egyesült Királyság) tejelő teheneken való használat esetén. A vizsgálat konkrét célja kettős volt: (1) összehasonlítani az elektronikus BHBA-szenzort a vérsavó BHBAszintjének vizsgálatával ( arany szabvány módszer) és 2 gyakran alkalmazott kémiai istállópróbával (Ketostix és Ketolac), valamint (2) értékelni a Precision Xtra teszt pontosságát egy nagyszámú vizsgáló személyt foglalkoztató üzemi vizsgálat keretében. ANYAG ÉS MÓDSZER Két kísérletet végeztünk, az egyiket 2007 májusa és júliusa között (1. kísérlet), a másikat pedig 2008 januárja és áprilisa között (2. kísérlet). Mindkét kísérletben egy elektronikus BHBA-mérő rendszert használtunk a gyártó használati utasításainak megfelelően. A rendszer egy kézi mérőműszerből és elektrokémiai tesztcsíkokból áll. Miután a tesztcsíkot beillesztik a mérőeszköz megfelelő nyílásába, ugyanabba a kamrába viszik be a vérmintát is. A mintában lévő BHBA a hidroxibutirát-dehidrogenáz enzim jelenlétében acetecetsavvá oxidálódik, a NAD + NADH-vá történő egyidejű redukciója mellett. A NADH ezt követően egy redox mediátor segítségével újból oxidálódik, így NAD + jön létre. Az eközben generált áram egyenesen arányos a minta BHBA-koncentrációjával. Tíz másodperc elteltével a BHBA koncentrációja (mmol/liter értékegységben kifejezve) megjelenik a mérőeszköz kijelzőjén. Az 1. kísérletben kutatási helyszínként két, egyenként körülbelül 1200 Holstein tejelő tehenet tartó árutermelő tehenészet szerepelt. A tehenek kötetlen tartásos, gumiszőnyegekkel és rácspadozattal ellátott istállókban voltak elhelyezve. Az ellés várható ideje előtt mintegy 7 nappal a teheneket szalmával almozott szabadtartásos istállókba telepítették át. A két gazdaság esetében az állomány átlagos tejhozama laktációnként 10.200, illetve 10.400 kg tej volt. A vizsgálatba összesen 196 tejelő tehenet vontunk be, melyek az ellés utáni 4. és 40. nap közötti időszakban voltak. Az állatoktól maximum 15 perces időközzel egyedi vér-, tej- és vizeletmintákat vettünk. Egyes tehenektől nem sikerült vizeletmintákat (n = 10; 5,1%) vagy tejmintákat (n = 2; 1,0%) gyűjteni. A vérmintákat a farokvénából és/vagy a farokartériából vettük vákuumcsövek (Venoject II, Terumo Europe NV, Leuven, Belgium) segítségével. A tejmintákat egy tőgynegyedből vettük, a vizeletmintákat pedig a péra alatti terület masszírozását követően ürített vizeletsugárból gyűjtöttük. A teljesvér-mintákat úgy juttattuk a tesztcsík szenzorára (Precision Xtra β-ketone, Abbott Diabetes Care), hogy a szenzort közvetlenül a vérrel telt csőben lévő vér felülete alá merítettük, közvetlenül a vérminta levétele után. A kézi mérőeszköz által kijelzett értékeket feljegyeztük az adatrögzítő lapra. A tejben és a vizeletben mért BHBA-koncentrációkat meghatároztuk az elektronikus rendszerrel és szemikvantitatív módon egy kémiai teszttel (Ketostix, illetve Ketolac) egyaránt. A vérmintákat lecentrifugáltuk (10 perc, 4 C, 1000 g), majd a vérsavót két egyenlő részre osztva -25 C hőmérsékleten tároltuk az analízis elvégzéséig. A béta-hidroxibutirát koncentrációit kolorimetriás enzimatikus reakciókkal (Ranbut D-3-hidroxibutirát kit, Randox Laboratories, Antrim, Egyesült Királyság) mértük egy automata nedves kémiai analizátor (Olympus AU 400, Olympus, Hamburg, Németország) segítségével. A laboratóriumot korábban a Guelphi Egyetem eljárása szerint validálták (Pearson-féle korreláció r = 0,91, n = 200). Minden eljárást a Berlini Szabadegyetem Állat-szaporodásbiológiai Klinikájának három kutatója végzett, a gyártó utasításai szerint. Az 1. kísérletben minden BHBA-méréshez ugyanazt a Precision Xtra mérőeszközt használták. A 2. kísérletben 35 szarvasmarha-egészségügyi állatorvosi praxis bevonásával egy multicentrikus vizsgálatra került sor. Ennek keretében 77 különböző gazdaságban összesen Journal of Dairy Science 92. kötet, 6. szám, 2009 3

926 tejelő tehéntől vettek mintákat (gazdaságonként átlagosan 12 mintát). A vizsgálatban részt vevő praxisok egy csomagot kaptak, amely tartalmazta az összes szükséges felszerelést és fogyóeszközt (pl. egy elektronikus mérőeszközt, tesztcsíkokat, előre felcímkézett vákuumcsöveket, tűket, előre felcímkézett vérsavós csöveket, habszivacs konténereket, valamint jégakkukat a szállításhoz). A praxisok kaptak egy, az alkalmazandó eljárásokat elmagyarázó kézikönyvet is. A vizsgálókat arra kértük, hogy szabad választásuk szerint maximum 3 gazdaságot jelöljenek ki a mintavételre. A mintaméret tekintetében gazdaságonként 10-15 tehén, a laktációs állapot tekintetében pedig a laktáció 0. és 42. nap közötti időszak volt a kitűzött cél. A vérmintákat ebben az esetben is a farokvénából és/vagy a farokartériából vettük vákuumcsövekbe. A teljes vért a fentebb leírt módon vittük fel a tesztcsík szenzorára. A BHBAkoncentrációkat, a tehén azonosító adatait, az ellés utáni heteket, valamint a vizsgáló személyére vonatkozó információkat feljegyeztük az adatrögzítő lapon, majd faxon eljuttattok az Állat-szaporodásbiológiai Klinikára. A vérsavóminták BHBA-koncentrációit fotometriás módszerrel ugyanabban a laboratóriumban határoztuk meg, mint az 1. kísérletben. Egy adott vizsgáló mindig ugyanazt a Precision Xtra mérőeszközt használta az összes BHBA méréshez. Statisztikai elemzések Az adatokat az SPSS for Windows (15.0 verzió; SPSS Inc., München, Németország) segítségével elemeztük. A vérsavó laboratóriumban meghatározott BHBA-koncentrációit tekintettük arany szabványnak. Az 1. kísérletben korrelációs koefficienseket (Pearson) számoltunk a vérsavó laboratóriumban mért BHBA-koncentrációi, valamint a mérőeszköz kijelzőjén a teljesvér-, a tej- és a vizeletminták vizsgálatakor megjelenő értékek között. A különböző istállópróbák esetében kiszámítottuk a tesztjellemzők (érzékenység, specificitás, pozitív és negatív előrejelző érték) átlagait és binomiális konfidencia-intervallumait (KI 95 ). Az érzékenység kiszámításához azoknak az 1400 µmol/liter vérsavóbeli BHBA-koncentrációt elérő vagy meghaladó teheneknek az arányát vettük figyelembe, melyeket a teszt helyesen pozitívnak diagnosztizált. A specificitás kiszámításához azoknak az 1400 µmol/liter vérsavóbeli BHBA-koncentrációt el nem érő teheneknek az arányát vettük figyelembe, melyeket a teszt helyesen negatívnak diagnosztizált. A pozitív előrejelző értéket azoknak a pozitív teszteredményű állatoknak az aránya alapján határoztuk meg, amelyeknél valóban szubklinikai ketózis állt fenn. A negatív előrejelző értéket azoknak a negatív teszteredményű állatoknak az aránya alapján határoztuk meg, amelyek valóban egészségesek voltak. A számított előrejelző értékek csak a két vizsgálati populációban kapott látszólagos előfordulási gyakoriságokra vonatkoznak. A 2. vizsgálatban (Pearson-féle) korrelációs koefficienseket számítottunk a laboratóriumban mért vérsavóbeli BHBA-koncentrációk és a Precision Xtra teszttel a teljes vérben mért értékek között. Kiszámítottuk a tesztjellemzők értékeit. Az 1400 µmol/literes vérsavóbeli BHBA-koncentráció értékeket elérő vagy meghaladó teheneket szubklinikai ketózisosnak minősítettük. Tekintettel arra, hogy egy klinikai méréseken alapuló, korrelációs koefficienseket alkalmazó összehasonlítás nem mindig ad megfelelő eredményeket, a Precision Xtra teszt és az arany szabvány módszer közötti egyezést mindkét kísérlet esetében grafikusan is elemeztük Bland és Altman (1986) módszerének alkalmazásával. A két teszt eredménye közötti különbséget minden egyes minta esetében kiszámítottuk és az egyes tesztek eredményének átlagához viszonyítva feltüntettük. A multicentrikus vizsgálat (2. kísérlet) esetében a két teszt eredményei közötti különbségek megoszlását minden egyes vizsgáló boxplot (dobozdiagram) formájában tüntette fel. A két teszt variancia-értékeit 3 BHBA-kategória (<1000 µmol, 1000-1400 µmol, illetve >1400 µmol/liter vér) alkalmazásával számítottuk ki. Journal of Dairy Science 92. kötet, 6. szám, 2009 4

EREDMÉNYEK 1. kísérlet A gyűjtött 196 vérminta közül 17 (8,7%; KI 95 = 5,1, 13,5) tartalmazott 1200 µmol/liter, 10 vérminta (5,1%; KI 95 = 2,4, 9,1) pedig 1400 µmol/liter vér BHBA-t. A különböző istállópróbákkal és különböző szubsztrátok alkalmazásával meghatározott BHBAkoncentrációk és az arany szabványként használt vérsavóbeli BHBA-koncentrációk összehasonlításával kapott korrelációs koefficienseket az 1. táblázat foglalja össze. A Pearson-féle korrelációs koefficiensek erősen szignifikánsak voltak mind az 5 istállópróba esetében. A legmagasabb korrelációs koefficienst (0,95) a Precision Xtra mérőeszközzel a teljes vérben meghatározott BHBA-koncentráció esetében számítottuk. A Precision Xtra, illetve a vizeletmintákkal végzett Ketostix és a tejmintákkal végzett Ketolac közötti korrelációs koefficiensek hasonlóak, de az előzőeknél alacsonyabbak voltak. A 2. táblázat bemutatja az összes istállópróba tesztjellemzőit, különböző küszöbértékek figyelembevételével. A Precision Xtra teszt 1400 µmol/liter teljes vér BHBA-koncentráció mellett nagyon érzékenynek és nagyon specifikusnak bizonyult. Ha a Precision Xtra tesztet tej- vagy vizeletminták vizsgálatára használtuk, annak érzékenysége és specificitása jelentősen csökkent. A Ketostix 4000 µmol/liter vizelet, a Ketolac pedig 100 µmol/liter tej BHBA-koncentráció mellett nagyon érzékeny volt. A két kémiai próba specificitása 4000 µmol/liter vizelet, illetve 200 µmol/liter tej BHBAkoncentráció mellett volt a legnagyobb. A két teszt közötti egyezés szintjére vonatozó paramétereket a 3. táblázat foglalja össze. A kézi mérőeszköz alacsonyabb értékeket adott, mint a vérsavó BHBA-koncentrációi (-32,4 ± 152,7 µmol BHBA/liter vér, P<0,05). 2. kísérlet Vizsgálónként átlagosan 27 mintát, gazdaságonként pedig 12 mintát gyűjtöttünk. A vizsgálatba vont összes tehén közül 81,7% volt az ellés és a laktáció 42. napja közötti időszakban. A minták egy részét szárazonálló tehenektől (n = 106; 11,4%), illetve ismeretlen laktációs státuszú tehenektől (n = 64; 6,9%) vettük. A multicentrikus vizsgálatban a 1200 µmol/liter vérsavóbeli BHBA-koncentrációk aránya összességében 15,7% (KI 95 = 13,4-18,2%), a 1400 µmol/liter szérum BHBA-koncentrációk aránya pedig 11,0% (KI 95 = 9,1-13,2%) volt (n = 926). A Precision Xtra teszttel a vérsavóban és a teljes vérben meghatározott BHBA-koncentrációk közötti korrelációs koefficiens 0,94 volt (1. ábra; r 2 = 0,88, P<0,001). A Precision Xtra teszt érzékenysége 1200 µmol/liter teljes vér BHBA-koncentráció esetén 88%-os (KI 95 = 82-93%), 1400 µmol/liter teljes vér BHBA-koncentráció esetén pedig 96%-os (KI 95 = 95-98%) volt. A specificitás az előbbi két küszöbszint esetén 96%-nak (KI 95 = 95-98%), illetve 97%-nak (KI 95 = 96-98%) adódott. A pozitív előrejelző érték mindkét küszöbszint esetében 82% (KI 95 = 75-87%; 74-89%) volt, míg a negatív előrejelző érték az 1200 µmol/liter teljes vér BHBA-koncentráció esetében 98% (KI 95 = 96-99%), az 1400 µmol/liter teljes vér BHBA-koncentráció esetében pedig 100% (KI 95 = 99-100%) volt (3. táblázat). A kézi mérőeszköz ez esetben is alacsonyabb értékeket mért, mint a vérsavó BHBAkoncentrációja (-48,2 ± 261,7 µmol/l, P<0,001). Amikor a Precision Xtra teszttel mért BHBA-koncentrációk és az arany szabvány közötti különbségeket az átlagértékekhez viszonyítva ábrázoltuk, a két teszt között nagyobb egyezést kaptunk az 1. kísérletben, mint a 2. kísérletben (2. ábra). A két teszt varianciája összességében a 2. kísérletben jelentősen nagyobb mértékű (9,7%) volt, mint az 1. kísérletben (4,2%). A 20%-os varianciát mutató minták százalékos aránya az 1. kísérletben 1,5%, a 2. kísérletben pedig 19,0% volt; a >20%-os varianciát mutató minták aránya azonban nem nőtt a BHBA-koncentráció tartományok emelkedésével (4. táblázat). A legtöbb vizsgáló személy esetében viszonylag csekély variancia adódott a két teszt között (3. ábra). Journal of Dairy Science 92. kötet, 6. szám, 2009 5

1. táblázat: A különböző istállópróbákkal és különböző szubsztrátokban meghatározott BHBA-koncentrációk és az arany szabványként használt vérsavóbeli BHBA-koncentrációk összehasonlításával kapott Pearson-féle korrelációs koefficiensek Teszt 1 Szubsztrát Tesztek (n) 2 Pearson-féle Szignifikancia-szint korreláció Precision Xtra Teljes vér 196 0,95 P < 0,001 Precision Xtra Tej 194 0,53 P < 0,001 Precision Xtra Vizelet 186 0,66 P < 0,001 Ketostix Vizelet 186 0,64 P < 0,001 Ketolac Tej 194 0,63 P < 0,001 1 Precision Xtra, Abbott Diabetes Care (Abingdon, Egyesült Királyság); Ketostix, Bayer (Leverkusen, Németország); Ketolac, Biolab (München, Németország) 2 Az egy vérsavóbeli BHBA méréssel párba állított megfigyelések száma az egyes istállópróbák esetében 2. táblázat: A három különböző istállópróba teljesítménye a 1400 µmol/literes vérsavóbeli BHBAkoncentrációként meghatározott szubklinikai ketózis kimutatásában (1. kísérlet) 1 Teszt 2 Szubsztrát Küszöbszint (µmol/l) Tesztek (n) 3 Érzékenység (%) (KI 95 ) Specificitás (%) (KI 95 ) + Prediktív érték (%) (KI 95) - Prediktív érték (%) (KI 95 ) Precision Xtra Teljes vér 1400 196 100 (69-100) 100 (94-100) 100 (69-100) 100 (98-100) Precision Xtra Tej 200 194 60 (26-88) 89 (83-93) 22 (9-42) 98 (94-99) Precision Xtra Tej 300 194 40 (12-74) 97 (94-99) 44 (14-79) 97 (93-99) Ketolac Tej 100 194 90 (56-100) 94 (90-97) 45 (23-68) 99 (97-100) Ketolac Tej 200 194 30 (7-65) 98 (95-100) 50 (12-88) 96 (93-99) Precision Xtra Vizelet 1000 186 100 (66-100) 25 (19-32) 6 (3-14) 100 (92-100) Precision Xtra Vizelet 2000 186 67 (30-93) 86 (80-91) 19 (7-37) 98 (95-100) Precision Xtra Vizelet 3000 186 56 (21-86) 98 (94-99) 56 (21-86) 98 (94-99) Ketostix Vizelet 500 186 8 (40-98) 92 (87-96) 33 (15-57) 99 (96-100) Ketostix Vizelet 1500 186 67 (30-93) 97 (94-99) 36 (23-83) 100 (95-100) Ketostix Vizelet 4000 186 67 (30-93) 100 (98-100) 100 (54-100) 98 (95-100) Ketostix Vizelet 8000 186 44 (14-79) 100 (98-100) 100 (40-100) 97 (94-99) Ketostix Vizelet 16.000 186 22 (3-60) 100 (98-100) 100 (16-100) 98 (92-98) 1 Érzékenység: a pozitív teszteredményt adó beteg tehenek aránya; Specificitás: a negatív teszteredményt adó nem beteg tehenek aránya; + prediktív érték: a pozitív teszteredményt adó beteg tehenek aránya; - prediktív érték: a negatív teszteredményt adó nem beteg tehenek aránya; KI 95 = 95%-os konfidencia-intervallum. 2 Precision Xtra, Abbott Diabetes Care (Abingdon, Egyesült Királyság); Ketostix, Bayer (Leverkusen, Németország); Ketolac, Biolab (München, Németország) 3 Az egy vérsavóbeli BHBA méréssel párba állított megfigyelések száma az egyes istállópróbák esetében MEGBESZÉLÉS A > 1400 µmol/liter szérum BHBA-koncentrációk aránya összességében 5,1% volt az 1. kísérletben és 11,0% a 2. kísérletben. Az ugyanezt a küszöbszintet alkalmazó korábbi vizsgálatokban kapott előfordulási gyakorisági arányokkal (Carrier és munkatársai, 2004: 7,6%; Geishauser és munkatársai, 2000: 12,0%) történő közvetlen összehasonlítás kulcsfontosságú, mivel az idézett vizsgálatok kényelmes (vegyes) mintákat is használtak (az állatok válogatás nélkül a mintába kerülhettek). Különbségek voltak továbbá egyes fontos változók tekintetében, például a laktációban töltött napok száma vagy a tejtermelés tekintetében, illetve egyes fontos változók nem kerültek leírásra. Mivel a 2. kísérletben arra kértük a vizsgálókat, hogy saját belátásuk szerint válasszanak ki három vizsgálati helyszínt ( kényelmes minta), valószínűleg előszelekció történt az anyagcsere-rendellenességek gyakoribb előfordulását mutató gazdaságok javára. Valószínűleg Journal of Dairy Science 92. kötet, 6. szám, 2009 6

ez a szelekciós folyamat is hozzájárult ahhoz, hogy a 2. kísérletben összességében nagyobb volt a szubklinikai ketózisos tehenek aránya. A Ketostix és a Ketolac tesztek jelen vizsgálatban észlelt diagnosztikai teljesítménye különbözött a korábbi beszámolókban leírttól. Csaknem azonos küszöbszinteket (vagyis 490, 1470, 3920, 7840 és 15.700 µmol acetecetsav/liter vizelet) figyelembe véve, a korábbi beszámolók sokkal alacsonyabb érzékenységi értékeket (90, 78, 49, 12, illetve 4%) közöltek a Ketostix teszt esetében, míg a specificitási értékek (90-100%) hasonlók voltak az általunk megfigyeltekhez (Carrier és munkatársai, 2004). Azonos küszöbszint (vagyis 100 µmol BHBA/liter tej) alkalmazása mellett korábban az általunk kapott értékeknél alacsonyabb érzékenységet (80%) és specificitást (76%) írtak le a Ketolac teszt esetében (Geishauser és munkatársai, 2000). A 200 µmol BHBA/liter tej küszöbszint mellett az e vizsgálatban kapott érzékenység számottevően alacsonyabb volt, mint a fent idézett vizsgálatban kapott 59%-os érték. E különbségek oka nem világos. A különbségeket okozhatják a mintavétellel vagy a tesztcsíkok színváltozásának értelmezésével kapcsolatos különbségek (Carrier és munkatársai, 2004). Kimutatták továbbá azt is, hogy a tej magas szomatikus sejtszáma (SCC) és a rosszul fermentálódott szilázs etetése megemelheti a tejminták ketonanyag-tartalmára irányuló vizsgálatok eredményeit. Az egyes beszámolók közötti eltérések azt mutatják, hogy a színváltozáson alapuló istállópróbák esetében fennáll a szubjektív értelmezés lehetősége, ezért ezeket a teszteken nehéz standardizálni (Carrier és munkatársai, 2004). 3. táblázat: A Precision Xtra teszt eredményei és a vérsavó BHBA-koncentrációi közötti különbségek a két kísérletben Paraméter 1. kísérlet 2. kísérlet A minták száma 196 926 Átlag ± szórás (µmol/l) Precision Xtra 723,0 ± 468,4 836,1 ± 742,3 Vérsavó BHBA 755,4 ± 474,9 884,3 ± 732,0 Különbség, átlag ± szórás (µmol/l) 32,4 ± 152,7 48,2 ± 261,7 Variancia (%) 1 4,2 9,7 A különböző varianciájú párok százalékos aránya <10%-os variancia 76,0 51,4 <20%-os variancia 98,5 81,0 20%-os variancia 1,5 19,0 1 A vérsavó BHBA-koncentráció és a Precision Xtra teszt eredményének átlaga alapján. Precision Xtra, Abbott Diabetes Care (Abingdon, Egyesült Királyság) Ez az első vizsgálat, amely a tejelő tehenekben az ellés utáni időszakban előforduló szubklinikai ketózis kimutatására szolgáló elektronikus, kézi ketonanyag-mérő műszert validált. Korábban hasonlóan erős korrelációkról számoltak be a vérsavó BHBA-szintje és a teljes vérben a Precision Xtra teszttel mért BHBA-koncentrációk között (Jeppesen és munkatársai, 2006; Heuwieser és munkatársai, 2007). A Precision Xtra tesztet már korábbi vizsgálatokban is alkalmazták eltérő körülmények között, és annak használhatóságát üzemi viszonyok között igazolták (Endecott és munkatársai, 2004; Bryk-Lucy és munkatársai, 2008), jóllehet e vizsgálatokban az összefüggés erősségét vagy az arany szabvánnyal való egyezés szintjét nem tanulmányozták. A Precision Xtra teszt jellemzőinek részletes értékelését korábban még nem közölték. Az 1. kísérletben az összes vizsgált teszt közül a Precision Xtra teszt érte el a legnagyobb érzékenységet és specificitást, amikor küszöbértékként 1400 µmol/liter teljes vér BHBA-koncentrációt alkalmaztunk. Az 1. kísérlet adatai világosan mutatják, hogy a Precision Xtra teszt jobb diagnosztikai teljesítményt nyújt, mint a két szemikvantitatív kémiai istállópróba, és hogy a teljes vér szubsztrátként való használata nagyobb pontosságot biztosít, mint a Journal of Dairy Science 92. kötet, 6. szám, 2009 7

vizeleté vagy a tejé. További előny, hogy a Precision Xtra teszt nem szubjektív, mivel az eredmények kijelzése digitálisan történik. 4. táblázat: A Precision Xtra teszt és a vérsavó BHBA-koncentrációi közötti variancia 3 különböző BHBA koncentráció-tartományban a 2. kísérletben Az alábbi varianciaértékeket mutató párok 1 BHBA-koncentráció tartományok (µmol/liter) <1000 1000-1400 >1400 Összesen n % n % n % n % <5% 200 27,3 32 37,6 43 39,8 275 29,7 10% 150 20,5 19 22,4 33 30,6 202 21,8 20% 219 29,9 27 31,8 27 25,0 273 29,5 >20% 164 22,4 7 8,2 5 4,6 176 19,0 Összesen 733 100,0 85 100,0 108 100,0 926 100,0 1 Az átlagos vérsavóbeli BHBA-koncentráció és a Precision Xtra teszt eredményei alapján. Precision Xtra, Abbott Diabetes Care (Abingdon, Egyesült Királyság). A vérsavó BHBA-koncentrációja (µmol/l) 1. ábra: A vérsavóban (automata nedves kémiai analizátorral) és a teljes vérben (Precision Xtra teszttel; Abbott Diabetes Care, Abingdon, Egyesült Királyság) meghatározott BHBAkoncentrációk közötti korreláció a 2. kísérletben (r 2 = 0,88, n = 926, P < 0,001). A teljes vér BHBA-koncentrációja A BHBA-koncentráció különbsége (µmol/liter) A két teszttel kapott átlagos BHBA-koncentrációk a 2. kísérletben (µmol/l) A BHBA-koncentráció különbsége (µmol/liter) A két teszttel kapott átlagos BHBA-koncentrációk a z 1. kísérletben (µmol/l) 2. ábra: A Precision Xtra teszttel (Abbott Diabetes Care, Abindgon, Egyesült Királyság) és az arany szabvány módszerrel mért BHBA-koncentrációk különbsége az átlaghoz viszonyítva (µmol/l-ben) az 1. kísérletben (bal oldali ábra) és a 2. kísérletben (jobb oldali ábra). Journal of Dairy Science 92. kötet, 6. szám, 2009 8

A BHBA-értékek különbsége a két tesztben (µmol/l) 1-35. vizsgáló 3. ábra: A Precision Xtra teszttel (Abbott Diabetes Care, Abingdon, Egyesült Királyság) a teljes vérben mért BHBA-koncentrációk és az arany szabvány közötti különbség a 35 vizsgáló esetében (2. kísérlet). A körök a kiugró értékeket jelzik (1,5-3,5 interkvartilis tartomány); a csillagok a szélsőségesen kiugró értékeket jelölik (>3,0 interkvartilis tartomány). A második kísérletben, amelyben 35 vizsgáló és 77 vizsgálati helyszín szerepelt, a teszt teljesítménye ugyancsak nagyon jó volt (96%-os érzékenység és 97%-os specificitás). A Precision Xtra teszt és az arany szabvány közötti egyezés szintje azonban a 2. kísérletben alacsonyabb volt, mint az 1. kísérletben (2. ábra; 3. táblázat). Ez a megfigyelés annak a ténynek lehet betudható, hogy az első kísérletben minden eljárást az Állat-szaporodásbiológiai Klinika 3 egyformán képzett vizsgálatvezetője végzett egy szabványműveleti eljárás gondos betartásával. A 2. kísérletben viszont a vizsgálók (n = 35) csak egy rövid, az eljárásokat ismertető kézikönyvet kaptak. Logisztikai megfontolásokból szabványos képzés nem történt. A 3. ábrából nyilvánvalóan kitűnik, hogy a legtöbb vizsgáló magas szintű egyezést ért el a két teszt között, még mások (például a 11. és a 29. számú vizsgáló) esetében alacsony volt az egyezés szintje. Feltételezhető, hogy a mintavétel és a vérminták feldolgozásának különbözősége okozta ezeket a magas variabilitási értékeket. Továbbra sem világos, hogy az említett vizsgálók által a két teszt között elért viszonylag alacsony egyezési szintet a Precision Xtra teszt nem megfelelő alkalmazása okozta-e, vagy az abból adódott, hogy a vért a kézikönyv előírásaitól eltérő módon vagy nem egyöntetűen dolgozták-e fel szérumgyűjtés céljából, ami zavaró hatást fejtett ki a kapott eredményekre. A szubklinikai ketózisra utaló (vagyis 1400 µmol/liter vér BHBA-t tartalmazó) minták aránya az egyes vizsgálók esetében széles körben változott, valószínűleg az állományok eltérő szelekciója következtében. A >20%-os varianciát mutató minták aránya azonban nem nőtt a BHBA-koncentrációk emelkedésével párhuzamosan. További kutatásokra van szükség azoknak a tényezőknek az azonosítása érdekében, amelyek befolyásolhatják a BHBA-koncentrációk laboratóriumban és a Precision Xtra teszttel történő mérését. Journal of Dairy Science 92. kötet, 6. szám, 2009 9

KÖVETKEZTETÉSEK A Precision Xtra teszt egy, a ketonanyagok kimutatására jól használható istállópróba, amellyel kimutatható a frissen ellett tejelő tehenek szubklinikai ketózisa. Teljesvér-minták és 1400 µmol BHBA/liter vér küszöbérték alkalmazása esetén a Precision Xtra teszt kitűnő tesztjellemzőket ért el, és diagnosztikai teljesítménye meghaladta a két kémiai tesztcsíkos módszerét. További kutatásokra van szükség azoknak a pre- és intra-analitikai tényezőknek az értékelése céljából, amelyek esetleg befolyásolhatják a teszt eredményeit. A Precision Xtra teszt érzékenysége és specificitása tej- és a vizeletminták vizsgálata esetén jelentősen alacsonyabb volt. Figyelembe véve a mintavétel egyszerűségét, meg kell azonban vizsgálni, hogy a szubsztrátként tejjel végzett Precision Xtra teszt diagnosztikai teljesítménye javítható-e. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS A szerzők hálás köszönetet mondanak a vizsgálatban részt vevő 35 németországi állatorvosi praxis és 77 tejelő tehenészet személyzetének. IRODALOM Andersson, L. 1988. Subclinical ketosis in dairy cows. Metabolic diseases of ruminant livestock. Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract. 4:233 251. Bland, J. M., and D. G. Altman. 1986. Statistical methods for assessing agreement between two methods of clinical measurement. Lancet 338:307 310. Bryk-Lucy, J., D. Nydam, A. Delgado Castro, A. Gonzales Zariquiey, and M. Montenegro Vega. 2008. Prevalence of subclinical metabolic disease in transition dairy cows on large dairies in Peru. Hungarian Vet. J. 130(Suppl. 2):72. Carrier, J., S. Stewart, S. Godden, J. Fetrow, and P. Rapnicki. 2004. Evaluation and use of three cowside tests for detection of subclinical ketosis in early postpartum cows. J. Dairy Sci. 87:3725 3735. Duffield, T. F. 1997. Effects of a monensin controlled release capsule on energy metabolism, health, and production in lactating dairy cattle. DVSc Thesis. University of Guelph, Ontario, Canada. Duffield, T. F. 2000. Subclinical ketosis in lactating dairy cattle: Metabolic disorders of ruminants. Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract. 16:231 253. Endecott, R.L., C. M. Black, K. A. Notah, and M. K. Petersen. 2004. Blood ketone levels of young postpartum range cows increased after supplementation ceased. J. Anim. Sci. 82 (Suppl. 1):114. Geishauser, T., K. Leslie, D. Kelton, and T. Duffield. 1998. Evaluation of five cowside tests for use with milk to detect subclinical ketosis in dairy cows. J. Dairy Sci. 81:438 443. Geishauser, T., K. Leslie, D. Kelton, and T. Duffield. 2001. Monitoring for subclinical ketosis in dairy herds. Compend. Contin. Educ. Pract. Vet. 23:65 71. Geishauser, T., K. Leslie, J. Tenhag, and A. Bashiri. 2000. Evaluation of eight cow-side ketone tests in milk for detection of subclinical ketosis in dairy cows. J. Dairy Sci. 83:296 299. Guerci, B., N. Tubiana-Rufi, B. Bauduceau, R. Bresson, A. Cuperlier, C. Delcroix, D. Durain, C. Fermon, J. P. Le Floch, C. LeDevehat, V. Melki, L. Monnier, H. Mosnier-Pudar, P. Taboulet, and H. Hanaire-Broutin. 2005. Advantages to using capillary blood betahydroxybutyrate determination for the detection and treatment of diabetic ketosis. Diabetes Metab. 31:401 440. Heuwieser, W., U. Falkenberg, M. Iwersen, R. Voigtsberger, and W. Padberg. 2007. Evaluation and use of an automated human β-hydroxybutyrate (BHBA) test for cowside detection of subclinical ketosis in dairy cattle. Page 253 in Proc. 40th Annu. Conv. Am. Assoc. Bov. Pract., Vancouver, BC. Am. Assoc. Bov. Pract., Stillwater, OK. Jeppesen, R., J. M. D. Enemark, and C. Enevoldsen. 2006. Ketone body measurement in dairy cows. Reference OS43 2 in Proc. 24th World Buiatrics Congress, Nice, France. World Assoc. Buiatrics, Vienna, Austria. Oetzel, G. R. 2004. Monitoring and testing dairy herds for metabolic disease. Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract. 20:651 674. Stokol, T., and D. V. Nydam. 2005. Effect of anticoagulant and storage conditions on bovine nonesterified fatty acids and β-hydroxybutyrate concentrations in blood. J. Dairy Sci. 88:3139 3144. Journal of Dairy Science 92. kötet, 6. szám, 2009 10