!HU0000076T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 007 6 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 0 7280 (22) A bejelentés napja: 0. 06. 22. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 07280 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 178469 A2 0. 12. 29. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 178469 B1 09.. 28. (1) Int. Cl.: A23L 1/ (06.01) A23L 1/8 (06.01) A61K 31/1 (06.01) A61K 31/2 (06.01) A61K 31/702 (06.01) A61K /06 (06.01) A61P 31/18 (06.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 0122791 PCT/NL 0/0001 () Elsõbbségi adatok: PCT/NL04/000444 04. 06. 22. WO 0327 0. 04. 21. EP 032 0. 04. 21. EP (72) Feltalálók: VAN TOL, Eric, Alexander, Franciscus, NL-6824 MZ Arnhem (NL); WILLEMSEN, Linette, Eustachia, Maria, NL-22 AJ Utrecht (NL); KOETSIER, Marleen, Antoinette, NL-8161 DW EPE (NL); BEERMANN, Christopher, 61267 Neu-Anspach (DE); STAHL, Bernd, 61191 Rosbach (DE) (73) Jogosult: N. V. Nutricia, 2712 HM Zoetermeer (NL) (74) Képviselõ: dr. Gyõrffy Béla, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest (4) Az intestinalis gát integritásának javítása HU 007 6 T2 A leírás terjedelme 14 oldal (ezen belül 4 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 199. évi XXXIII. törvény 84/H. -a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1 HU 007 6 T2 2 A találmány területe A találmány tárgya HIV-páciensek intestinalis gátja ( intestinal barrier ) integritásának javítására szolgáló készítmény alkalmazása gyógyszer elõállítására és az ilyen eljárásban történõ alkalmazásra megfelelõ készítmény. A találmány háttere A gastrointestinalis epithelium normálisan szelektív gátként mûködik, lehetõvé teszi a tápanyagok, elektrolitok és víz abszorpcióját és meggátolja az élelmezési és mikrobiális antigéneknek, ideértve a táplálék allergéneket, való kitettséget. A gastrointestinalis epithelium korlátozza az olyan antigének átjutását a szisztémás keringésbe, amelyek gyulladásos reakciókat, pl. allergiás reakciókat válthatnak ki. Ahogy az allergia, különösen a táplálékallergia elõfordulása növekszik, számos kutatócsoport keres (megelõzõ) gyógymódokat ezen betegségekre. A 1278 számú európai szabadalom egy készítményt ismertet, amely emészthetetlen oligoszacharidokat tartalmaz, a szoros sejtkapcsolat javítására, hogy ezzel csökkentsék az intestinalis permeabilitást és csökkentsék az allergiás reakciókat. A készítmény tartalmazhat LC¹PUFA-kat ( long chain-polyunsaturated faty acids, hosszláncú többszörösen telítetlen zsírsavak). A 7001 számú európai szabadalom emészthetetlen oligoszacharidok kombinációját ismerteti és n 3 és n 6 zsírsavakat az ulcerativ colitis kezelésére. Usami és munkatársai [Clinical Nutrition 01, (4): 1 9] ismertették az eikozapentaén-sav (EPA) hatását a szoros sejtkapcsolatok permeabilitására az intestinalis egysejtrétegben. Az õ kezükben az EPA-ról azt találták, hogy növeli a permeabilitást, ami azt jelezte, hogy az EPA nem megfelelõ az intestinalis gát integritásának javítására. A technika állása szerinti készítmények nem optimálisan megfelelõek a gátegység javítására. A találmány összefoglalása A találmány tárgya válogatott hosszú láncú többszörösen telítetlen zsírsavak (LC-PUFA¹k) és válogatott oligoszacharidok kombinációja. A találmány szerinti LC¹PUFA és oligoszacharid kombináció hatásosan javítja a gát integritását az inestinalis permeabilitás és a nyálkatermelés szinergisztikus javítása révén és az intestinalis gát épségét sértõ gyulladásos mediátorok nyálkahártya általi termelésének csökkentése révén. Ezen vegyületek kombinációja egy táplálék vagy gyógyászati készítményben különösen alkalmas a gát integritásának javítására HIV és AIDS páciensekben. Meglepetésre azt találtuk, hogy egyes LC¹PUFA¹k hatásosan csökkentették az epithelialis paracelluláris permeabilitást. Szemben azzal, amirõl Usami és munkatársai [Clinical Nutrition (4) 1 9 (01)] számoltak be, azt találtuk, hogy a C18 és C többszörösen telítetlen zsírsavak, különösen az eikozapentaénsav (EPA), dokozahexaénsav (DHA) és arachidonsav (ARA) képes hatásosan csökkenteni az intestinalis szoros sejtkapcsolat permeabilitását. 1 2 Az LC¹PUFA-kon kívül a találmány szerinti készítmény tartalmaz oligoszacharidokat. A kiválasztott oligoszacharidok javítják a gát integritását a nyálkatermelés serkentése révén, amely megnövelt nyálkarétegvastagságot eredményez. Úgy gondoljuk, hogy ezt a hatást a különbözõ oligoszacharidoknak a rövid láncú zsírsav (SCFA) termelésre kifejtett hatása okozza. Ennek megfelelõen, amennyiben jelen LC¹PUFA és emészthetetlen oligoszacharidok kombinációja enterálisan kerül beadásra emlõsnek, akkor szinergisztikusan javítja a gát integritását és/vagy szinergisztikusan csökkenti az intestinalis permeabilitást, a szoros sejtkapcsolat permeabilitásra és a nyálkatermelés serkentésére kifejtett szimultán hatása révén. A találmány egy további szempontja szerint a készítmény javítja az intestinalis nyálkaréteg minõségét. A nyálkaréteg mucinokat tartalmaz. A mucinok nagy molekulatömegû glikoproteinek, amelyeket kehelysejtek szintetizálnak és választanak ki. Gélszerû réteget alakítanak ki a nyálkás felületen, ezzel javítják a gát integritását. A nyálkaréteg különbözõ típusú mucinokat tartalmaz, például savas, semleges és szulfonált mucinokat. A nyálkaréteg megnövekedett heterogenitásáról azt gondoljuk, hogy javítja a gát mûködését. A találmány szerinti készítmény elõnyösen legalább kettõ különbözõ oligoszacharidot tartalmaz, amely befolyásolja a nyálka felépítését és elõnyös módon befolyásolja a mucinheterogenitást a nyálkarétegben, vagy közvetlenül vagy a bélflóra megváltoztatásával. Véleményünk szerint minden egyes különbözõ kiválasztott oligoszacharid a nyálka mennyiségére különbözõ hatást gyakorol. Továbbá két különbözõ oligoszacharid szintén képes a nyalka minõségének javítására, ahogy ez a szulfonálás mértékében tükrözõdik, az SCFA-termelés szinergisztikus stimulálásával. Meglepetésünkre azt találtuk, hogy a találmány szerinti két különbözõ oligoszacharid keveréke szinergisztikusan serkenti az acetáttermelést. Azt is felismertük, hogy a nyálkatermelés függ az acetáttermeléstõl. Azt találtuk továbbá, hogy az ARA prekurzora, a gamma-linolénsav (GLA), elõnyösen kombinálható a jelen készítményben HIV-páciensek kezelésére. Az HIV-páciensek gyakran szenvednek intestinalis gyulladásos rendellenességektõl, amely elõnytelenné teszi nagy mennyiségû ARA bevitelét, mivel az ARA növeli a gyulladásos választ. Azt találtuk, hogy az ARA egy része helyettesíthetõ GLA alkalmazásával anélkül, hogy negatív hatása lenne a zsírkeverék hatásosságára. Ezért egy további szempont szerint a találmány tárgya EPA, DHA, ARA és GLA oligoszacharidokat tartalmazó készítmény és alkalmazásuk HIV vagy AIDS kezelésére és/vagy megelõzésére. Jelen készítményt elõnyösen tovább javítjuk mind hosszú, mind rövid láncú oligoszacharidok hozzáadásával. A különbözõ lánchosszok hozzáadása az ileum (csipõbél) és a vastagbél különbözõ részein eredményezi a nyálkahártya serkentését. A rövid láncú oligoszacharidok [jellemzõen a 2, 3, 4 vagy polimerizációs fokúak (DP)] a proximális vastagbélben és/vagy a disztális ileumban serkentik a mucintermelést, míg a 2
1 HU 007 6 T2 2 hosszabb láncú oligoszacharidokról [elõnyösen ¹as polimerizációs fokú (DP)] azt gondoljuk, hogy a vastagbél ( colon ) disztálisabb részén serkentik a mucintermelést. Még további javítások érhetõek el legalább kettõ különbözõ oligoszacharid mind rövid láncú, mind hosszú láncú oligoszacharid hozzáadásával. Ezen elõnyös megvalósítási módok mind hozzájárulnak a gát integritásának további javításához az ileum és/vagy a vastagbél teljes hosszában. Továbbá meglepetésre azt találtuk, hogy az EPA, DHA és ARA képes volt csökkenteni az interleukin 4 (IL 4) káros hatását az intestinalis permeabilitásra. Az IL 4 egy citokin, amelyet bizonyos betegekben a nyálkahártya T¹sejtjei megnövekedett mennyiségben választanak ki, és amely kiváltja az intestinalis permeabilitást. Ennek megfelelõen a találmány tárgya eljárás olyan betegségek kezelésére és/vagy megelõzésére, amelyekben az intestinalis IL 4-koncentráció megemelkedett, mint amilyen az allergia, különösen az atopiás dermatitis. A találmány részletes ismertetése A találmány tárgya táplálékkészítmény, amely tartalmaz a) eikozapentaénsavat (EPA), dokozahexaénsavat (DHA) és arachidonsavat (ARA), ahol a és 22 szénatomos hosszú láncú többszörösen telítetlen zsírsavak aránya a teljes zsírtartalom legalább 1 tömeg%¹a és legfeljebb 8 tömeg%¹a; és b) legalább két különbözõ oligoszacharidot, ahol a két különbözõ oligoszacharid homológiája monoszacharidegységekben kifejezve 90% alatti. Ezen készítményt elõnyösen lehet alkalmazni intestinalis gát integritását javító eljárásban, amely eljárás tartalmazza a készítmény beadását emlõsnek. Egy további szempont szerint a találmány tárgya többszörösen telítetlen zsírsavak alkalmazása Humán Immunhiány Vírus (HIV) fertõzött páciensek kezelésére szolgáló eljárásban történõ alkalmazásra szolgáló készítmény elõállítására, amely eljárás tartalmazza a Humán Immunhiány Vírus (HIV) fertõzött páciensek a következõket tartalmazó készítmény beadását: a) eikozapentaénsavat (EPA), dokozahexaénsavat (DHA) és arachidonsavat (ARA), ahol a és 22 szénatomos hosszú láncú többszörösen telítetlen zsírsavak aránya a teljes zsírtartalom legalább 1 tömeg%¹a és legfeljebb 8 tömeg%¹a; és b) legalább két különbözõ oligoszacharidot, ahol a két különbözõ oligoszacharid homológiája monoszacharidegységekben kifejezve 90% alatti. A HIV-fertõzött páciens kezelésének egy egyedi megvalósítási módja a táplálékkal történõ kezelés. A találmány további megvalósítási módjai a fent definiált készítmény alkalmazása HIV-fertõzött páciensnek történõ táplálék szolgáltatásra, amely a HIV-fertõzött páciensnek a készítmény beadásával történik továbbá a fent definiált készítmény alkalmazását is HIV-fertõzött páciens intestinalis gátja épségének serkentésére, amely a HIV-fertõzött páciensnek a készítmény beadásával történik. 1 2 Többszörösen telítetlen zsírsavak Meglepetésünkre azt találtuk, hogy az eikozapentaénsav (EPA, n 3), dokozahexaénsav (DHA, n 3) és arachidonsav (ARA, n 6) hatásosan csökkentik az intestinalis szoros sejtkapcsolat permeabilitását. A GLA (n 6) szintén hatásosan csökkenti a gát permeabilitását. Ennek megfelelõen a találmány szerinti készítmény, amely különösen alkalmas az intestinalis gát integritásának javítására, tartalmaz EPA¹t, DHA¹t és ARA¹t adott esetben GLA-val kombinációban. Azt találtuk, hogy LC¹PUFA¹k alacsonyabb koncentrációja, hatásos volt a szoros sejtkapcsolat permeabilitás csökkentésére (lásd a Példákat az Usami és munkatársai közleményével szemben). Ennek megfelelõen a és 22 szénatomos LC¹PUFA-tartalom a találmány szerinti készítményben, elõnyösen nem haladja meg a teljes zsírtartalom 8 tömeg%¹át, elõnyösen nem haladja meg a tömeg%¹át a teljes zsírtartalomnak. A találmány szerinti készítmény legalább 1 tömeg% és legelõnyösebben legalább 2 tömeg% és 22 szénatomos LC¹PUFA¹t tartalmaz a teljes zsírtartalomban. Ugyanezen okból az EPA-tartalom elõnyösen nem haladja meg a teljes zsírtartalom tömeg%¹át, még elõnyösebben nem haladja meg a teljes zsírtartalom 2 tömeg%¹át, de elõnyösen a teljes zsírtartalomnak legalább 0,0 tömeg%¹a, még elõnyösebben legalább 0,1 tömeg%¹a és legelõnyösebben legalább 1 tömeg%¹a. A DHA-tartalom elõnyösen nem haladja meg a teljes zsírtartalom 1 tömeg%¹át, még elõnyösebben nem haladja meg a tömeg%¹át, de legalább 0,1 tömeg%¹a. Mivel az ARA¹t különösen hatásosnak találtuk a szoros sejtkapcsolat permeabilitásának csökkentésére, ezért a találmány szerinti készítmény viszonylag nagy mennyiségben tartalmazza, elõnyösen a teljes zsírtartalomnak legalább 0,1 tömeg%-ában, elõnyösebben legalább 0,2 tömeg%-ában, legelõnyösebben legalább 0, tömeg%-ában. Az ARA-tartalom elõnyösen nem haladja meg a teljes zsírtartalom 1 tömeg%¹át, elõnyösebben nem haladja meg az tömeg%¹át, még elõnyösebben nem haladja meg az 1 tömeg%¹át. A jelen ARA-tartalmú enterális készítményhez elõnyösen EPA¹t és DHA¹t adtunk, hogy kiegyensúlyozzuk az ARA hatását, például hogy csökkentsük az ARA metabolitok lehetséges gyulladáskeltõ hatását. Az ARA metabolitok túlzott mennyisége gyulladást okozhat. A találmány szerinti táplálék készítmény elõnyösen tartalmaz gamma-linolénsavat (GLA, C18) is. A GLA az ARA prekurzoraként hat, hogy helyettesítse legalább részben a készítmény ARA-tartalmát annak érdekében, hogy tovább csökkentse az ARA gyulladásserkentõ hatását. Ennek megfelelõen a találmány szerinti készítmény elõnyösen tartalmaz ARA¹t, GLA¹t, EPA¹t és DHA¹t, amelyben az (ARA+GLA)/DHA tömegarány elõnyösen 0,1 feletti, elõnyösebben 0,2 feletti, és még elõnyösebben 0, feletti. Az arány elõnyösen 2 alatt van és legelõnyösebben 3 alatt van. A találmány szerinti készítmény elõnyösen a teljes zsírtartalomra vetítve 1 és 7 tömeg% közötti mennyiségben tartalmaz többszörösen telítetlen zsírsavakat, elõnyösen 1 és tömeg% között. 3
1 HU 007 6 T2 2 A és 22 szénatomos LC¹PUFA lehet szabad zsírsavakként, triglicerid formában, foszfolipid formában jelen, vagy az elõzõk valamelyikének vagy többjének a keveréke formájában. A találmány szerinti készítmény elõnyösen legalább az ARA vagy DHA egyikét foszfolipid formában tartalmazza. A találmány szerinti táplálékkészítmény elõnyösen tartalmaz omega¹9 (n 9) zsírsavat (elõnyösen oleinsavat, 18:1) a megfelelõ táplálás nyújtása érdekében. Elõnyösen a találmány szerinti készítmény a teljes zsírtartalomra vetítve legalább 1 tömeg% n 9 zsírsavat ad, elõnyösebben legalább tömeg%¹ot ad. Az n 9 zsírsavtartalom elõnyösen 80 tömeg% alatti. Megfelelõ napi mennyiség lehet legalább 0,1 gramm EPA és 0,0 gramm ARA vagy ARA+GLA, vagy 0,1 gramm és gramm közötti EPA és 0,0 gramm és 2, gramm közötti ARA vagy ARA+GLA, vagy 0, gramm és 2, gramm közötti EPA és 0,2 gramm és 1,2 gramm közötti ARA vagy ARA+GLA, vagy 0,7 gramm és 1, gramm közötti EPA és 0,37 gramm és 0,7 gramm közötti ARA vagy ARA+GLA. A megfelelõ DHA napi mennyiségek kiszámolhatóak a fent megadott (ARA+GLA)/DHA arányból. Oligoszacharidok A találmány szerinti megfelelõ oligoszacharidok az olyan szacharidok, amelyek polimerizációs foka (DP) legalább 2 monoszacharidegység, amelyek nem vagy csak részlegesen emésztõdnek meg a belekben az emberi felsõ emésztési szakaszban (vékonybél és gyomor) jelen lévõ savak vagy emésztõenzimek hatására, de amelyeket az emberi bélflóra képes fermentálni. A monoszacharidegység kifejezés olyan egységeket jelöl, amelyek zárt gyûrûszerkezettel bírnak, elõnyösen hexóz, pl. piranóz vagy furanóz formájúak. Az oligoszacharid polimerizációs foka jellemzõen monoszacharidegység alatti, elõnyösen alatti, még elõnyösebben alatti. A találmány szerinti készítmény legalább két különbözõ oligoszacharidot tartalmaz, ahol az oligoszacharidok homológiája a monoszacharidegységekben körülbelül 90% alatti, elõnyösen % alatti, még elõnyösebben 2% alatti, még elõnyösebben % alatt. A homológia kifejezés, a találmány szerinti értelemben a különbözõ oligoszacharidokban az azonos monoszacharidegységek százalékának kumulatív értéke. Például az 1¹es oligoszacharid (OL1) szerkezete a következõ: fruktóz-fruktóz-glukóz-galaktóz, és így % fruktózt, 2% galaktózt és 2% glukózt tartalmaz. A 2¹es oligoszacharid (OL2) szerkezete a következõ: fruktóz-fruktóz-glukóz, és így 66% fruktózt és 33% glukózt tartalmaz. A különbözõ oligoszacharidok homológiája így 7% (% fruktóz+2% glukóz). Egy elõnyös megvalósítási mód szerint a találmány szerinti készítmény tartalmaz galaktooligoszacharidokat és a következõk legalább egyet: fruktooligoszacharidok vagy inulin. Minden egyes találmány szerinti oligoszacharid a benne található monoszacharidegységek összes számának elõnyösen legalább 66%-ban, elõnyösebben 1 2 legalább 90%-ban olyan monoszacharidegységet tartalmaz, amely a következõk bármelyike: mannóz, arabinóz, fruktóz, fukóz, ramnóz, galaktóz, ¹D-galaktopiranóz, ribóz, glukóz, xilóz, uronsav vagy ezek származékai. Egy további megvalósítási mód szerint a találmány szerinti oligoszacharidok közül legalább egy a következõk bármelyike: fruktánok, fruktooligoszacharidok, emészthetetlen dextrinek galaktooligoszacharidok (ideértve a transzgalaktooligoszacharidokat), xilooligoszacharidok, arabinooligoszacharidok, glukooligoszacharidok, mannooligoszacharidok, fukooligoszacharidok, savas oligoszacharidok (lásd alább például uronsav oligoszacharidok, mint amilyen a pektinhidrolizátum) vagy ezek keverékei. Elõnyösen a találmány szerinti készítmény tartalmaz legalább egyet, elõnyösen legalább kettõt a következõ oligoszacharidok közül: fruktooligoszacharidok vagy inulin, galaktooligoszacharidok vagy pektinhidrolizátum. A jó nyálkamennyiség és ¹minõség érdekében a találmány szerinti készítmény elõnyösen legalább egy oligoszacharidot tartalmaz, amely legalább 66% galaktózt vagy fruktózt tartalmaz monoszacharidegységként. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint a készítmény tartalmaz legalább egy oligoszacharidot, amely legalább 66% galaktózt tartalmaz monoszacharidegységként, és legalább egy oligoszacharidot, amely legalább 66% fruktózt tartalmaz monoszacharidegységként. Egy különösen elõnyös megvalósítási mód szerint a találmány szerinti készítmény tartalmaz galaktooligoszacharidot és a következõ oligoszacharidok bármelyikét: fruktooligoszacharid vagy inulin. A fruktooligoszacharidok serkentik a szulfomucintermelést a distalis vastagbélben az emberiflóra-kapcsolt patkányokban [Kleessen és munkatársai, (03) Brit J. Nutr 89: 97 6] és a galaktooligoszacharidok serkentik a savas mucintermelést [Meslin és mtsai., (1993) Brit. J. Nutr 69: 903 912]. A nyálkaréteg vastagságának a további javításához a teljes vastagbélben, a találmány szerinti készítményben az oligoszacharidoknak legalább tömeg%-ának a DP¹je 2 és közötti (például 2, 3, 4, és/vagy ) és legalább tömeg%-ának a DP¹je és közötti. Elõnyösen az oligoszacharidoknak legalább tömeg%- ának, még elõnyösebben legalább 7 tömeg%-ának a DP¹je 2 és 9 közötti (például 2, 3, 4,, 6, 7, 8, és/vagy 9), mivel ezekrõl úgy gondoljuk, hogy a csípõbél (ileum) teljes hosszában és a vastagbél proximális és középsõ részein mûködnek, és mert a kívánt hatás eléréséhez a készítményhez hozzáadni szükséges oligoszacharidok tömegszázalékai csökkentettek. Elõnyösen a tömegarányok: a) (2 és közötti DP¹jû oligoszacharidok): (6, 7, 8 és/vagy 9 DP¹jû oligoszacharidok) >1; b) ( és közötti DP¹jû oligoszacharidok): (6, 7, 8 és/vagy 9 DP¹jû oligoszacharidok) >1; vagy mindkettõ nagyobb, mint 1. Elõnyösen mindkét tömegarány 2 feletti, még elõnyösebben feletti. A nyálkaréteg vastagságának és minõségének még további javításához a teljes vastagbél területén, elõ- 4
1 HU 007 6 T2 2 nyösen a legalább kettõ különbözõ oligoszacharid mindegyike különbözõ lánchosszúságúként kerül hozzáadásra, elõnyösen a megfelelõ oligoszacharid teljes tömegének legalább tömeg%¹a minden egyes oligoszacharid esetében 2 és közötti DP¹jû (például 2, 3, 4, és/vagy ) és legalább tömeg%¹a és közötti DP¹jû. Elõnyösen az adott oligoszacharid össztömegének legalább tömeg%-ának, elõnyösebben legalább 7 tömeg%-ának DP¹je 2 és közötti, mivel ezekrõl úgy véljük, hogy az ileum teljes hosszában és a vastagbél középsõ részein mûködnek. Savas oligoszacharidok A gát integritásának további javításához a találmány szerinti készítmény tartalmaz 2 és közötti DP¹jû savas oligoszacharidokat. A savas oligoszacharid olyan oligoszacharidot jelöl, amely legalább egy savas csoportot tartalmaz a következõk közül: N¹acetilneuraminsav, N¹glikoloil-neuraminsav, szabad vagy észterezett karbonsav, kénsavcsoport vagy foszforsavcsoport. A savas oligoszacharid elõnyösen tartalmaz uronsavegységeket (például uronsavpolimer), még elõnyösebben galakturonsavegységeket. A savas oligoszacharid lehet homogén vagy heterogén szénhidrát. Megfelelõ példák a pektin- és/vagy algináthidrolizátumok. Az intestinalis szakaszban az uronsavpolimerek uronsavmonomerekké hidrolizálódnak, amely serkenti az intestinalis acetáttermelést, amely serkenti az intestinalis nyálkakiválasztást (Barcelo és munkatársai, Gut 00; 46:218 224). Elõnyösen a savas oligoszacharidok az alábbi I¹es szerkezettel bírnak, amelyben a terminális hexóz (bal) elõnyösen tartalmaz kettõs kötést. A terminális hexózegységen kívüli hexózegységek elõnyösen uronsavegységek, még elõnyösebben galakturonsavegységek. A karbonsavcsoportok ezeken az egységeken lehetnek szabadok vagy (részlegesen) észterezettek, és elõnyösen legalább %-ban metilezettek (lásd alább). I¹es szerkezet: Savas oligoszacharidpolimer ahol: R elõnyösen a következõk bármelyike: hidrogén, hidroxi- vagy savcsoport, elõnyösen oxi; és az R 2,R 3,R 4 és R -bõl álló csoport legalább egyike N¹acetil-neuraminsavat, N¹glikoloil-neuraminsavat, szabad vagy észterezett karbonsavat, kénsavcsoportot vagy foszforsavcsoport jelöl, és a többi R 2,R 3,R 4 vagy R jelentése hidroxi és/vagy hidrogén. Elõnyösen az R 2,R 3,R 4 vagy R -bõl álló csoport bármelyike N¹acetil-neuraminsavat, N¹glikoloil-neuraminsavat, szabad vagy észterezett karbonsavat, kénsavcsoportot vagy foszforsavcsoport jelöl, és a többi R 2,R 3,R 4 vagy R jelentése hidroxi és/vagy hidrogén. Még elõnyösebben 1 2 az R 2,R 3,R 4 és R -bõl álló csoport egyike szabad vagy észterezett karbonsavat jelöl, és a többi R 2,R 3, R 4 vagy R jelentése hidroxi és/vagy hidrogén; és n egész szám és a hexózegységek számát jelöli (lásd még a polimerizációs fokot az alábbiakban), ami bármilyen hexózegység lehet. Megfelelõen n egy 1 és 00 közötti egész szám. Elõnyösen a hexózegység(ek) uronsavegységek. Legelõnyösebben R1, R2 és R3 jelentése hidroxi, R4 jelentése hidrogén, R jelentése karbonsav, n 1 és 2 közötti egész szám, elõnyösen 1 és közötti, és a hexózegység galakturonsav. A találmányban alkalmazott elõnyös savas oligoszacharidok detektálását, mérését és analízisét ismertetik korábbi szabadalmi beadványok, amelyek tárgya a savas oligoszacharid, például WO 0/1378 számú nemzetközi közzétételi irat. A vastagbél teljes területén a nyálkaréteg vastagságának serkentéses javításához, a találmány szerinti készítmény elõnyösen legalább tömeg% 2 és közötti (például 2, 3, 4 és/vagy ) DP¹jû savas oligoszacharidot tartalmaz és legalább tömeg% és közötti DP¹jû savas oligoszacharidot tartalmaz, amely tömeg% az oligoszacharidok teljes tömegén alapszik. A találmány szerinti alkalmazott savas oligoszacharidokat pektinbõl, pektátból, alginátból, chondroitinbõl, hialuronsavakból, heparinból, heparánból, szialoglikánokból, fukodiánból, fukooligoszacharidokból vagy karragenánból állítjuk elõ, elõnyösen pektinbõl és/vagy alginátból. Oligoszacharidtartalom Amennyiben etetésre kész folyadék formában van, akkor a találmány szerinti készítmény 0,1 0 gramm emészthetetlen oligoszacharidokat tartalmaz literenként, elõnyösebben 0, grammot literenként, még elõnyösebben 1 2 grammot literenként. A túl magas oligoszacharidtartalom kellemetlen érzéseket válthat ki a jelentõs fermentáció miatt, míg a nagyon alacsony tartalom elégtelen nyálkaréteget eredményezhet. A legalább kettõ különbözõ oligoszacharid tömegaránya elõnyösen 1 és közötti, még elõnyösebben 1 és közötti. Ezen tömegarányok optimálisan serkentik a különbözõ típusú mucinok termelését, különbözõ helyeken a belekben. A találmány szerinti készítményhez az oligoszacharidot 0,1 tömeg%-nál nagyobb mennyiségben adjuk, elõnyösen 0,2 tömeg%-nál nagyobban, még elõnyösebben 0, tömeg%-nál nagyobban és még elõnyösebben 1 tömeg%-nál nagyobban, a készítmény teljes száraz tömegére vetítve. A készítmény oligoszacharidtartalma elõnyösen tömeg% alatti, elõnyösebben tömeg% alatti, még elõnyösebben tömeg% alatti. A találmány szerinti készítményhez nukleotidok és/vagy nukleozidok hozzáadása tovább javítja a bélnyálka gátfunkcióját, különösen, mivel gátolja és/vagy csökkenti a bakteriális transzlokáció elõfordulását és csökkenti a belek sérülését. Ennek megfelelõen a találmány szerinti készítmény tartalmaz továbbá 1 és 0 mg közötti mennyiségben nukleozidokat és/vagy
1 HU 007 6 T2 2 nukleotidokat a száraz tápszer 0 grammjára vetítve, még elõnyösebben és 0 mg közötti mennyiségben. 1 2 Alkalmazás A találmány szerinti készítményt elõnyösen alkalmazhatjuk emlõsökben, különösen emberekben a gát integritásának javítására szolgáló eljárásban. A találmány szerinti készítményt továbbá elõnyösen alkalmazhatjuk a csökkent gátintegritással asszociált betegségek kezelésére vagy megelõzésére. A találmány szerinti készítmény beadása elõnyösen szájon át történik. A betegeknek és csecsemõknek a találmány szerinti készítmény elõnyösen kombinálva van teljes táplálékkal, ideértve a fehérjét, szénhidrátot és zsírt. A találmány szerinti készítmény elõnyösen 0 és 2 év közötti csecsemõknek kerül beadásra. A készítmény beadható olyan pácienseknek, akik a gát integritásának sérülésében szenvednek és egészséges pácienseknek. A találmány szerinti készítményt elõnyösen koraszülött csecsemõ (olyan csecsemõ, aki 37 hét gesztációs idõ elõtt születik) táplálékszükségleteit adó eljárásban alkalmazhatjuk. A találmány szerinti készítményt elõnyösen alkalmazhatjuk továbbá intestinalis sérülés kezelésére és/vagy megelõzésére, melynek során a találmány szerinti készítményt az intestinalis sérülést kiváltható orvosi kezelést megelõzõen vagy azt követõen adjuk be. Ilyen orvosi kezelés lehet például a sebészet vagy az enterális gyógyszeres kezelés (például antibiotikumos, analgéziás, NSAID, kemoterápiás vegyületek stb.). A találmány szerinti készítményt elõnyösen alkalmazhatjuk továbbá olyan betegségek kezelésére és/vagy megelõzésére, amelyekben az intestinalis gát sérülése határozza meg a betegség elõrehaladását, például krónikus gyulladásos megbetegedések, különösen a gyulladásos bélbetegség (IBD), irritábilis bél szindróma (IBS), coeliákia, pankreatitisz, hepatitisz, arthritis vagy cukorbetegség megelõzésére vagy kezelésére. Továbbá a találmány alkalmazható olyan páciensek táplálására, akik abdominális sebészeti beavatkozáson estek át vagy fognak átesni és olyan pácienseknek, akiknél a belek posztoperatív mûködési zavarait tapasztalják és/vagy rosszul táplált pácienseknek. A találmány egy megvalósítási módja szerint a találmány szerinti készítményt olyan pácienseknek adjuk be, akik szerzett immunhiány szindrómában (AIDS) szenvednek és/vagy olyan pácienseknek, akik emberi immunhiányvírussal (HIV) fertõzöttek, például AIDSés/vagy HIV-fertõzés kezelésére alkalmas eljárásban. A kezelés tartalmazza a találmány szerinti készítmény beadását, elõnyösen a következõ tápanyagok bármelyikével együtt: szénhidrát, zsír vagy fehérje. A találmány szerinti készítmények különösen alkalmasak olyan páciensekre, akiknek a CD4 + T¹sejt-számuk a kritikus 700 sejt/ l vérérték alatt van, ha általánosan még nem szükséges nagyon hatásos retrovírus elleni terápia ( Highly Active Antiretroviral Therapy, HAART), de ha a páciensek esetében az intestinalis gát épségéhez, különösen az intestinalis gát épségének mûködészavarához kapcsolódó problémák kialakulásának kockázata már fennáll vagy azok már ki is alakultak. Tehát egy további szempont szerint a találmány segíti a CD4+ T¹sejtek száma csökkenésének lassítását vagy megállítását vagy javítja a CD4+ T¹sejtek számát HIV-ben és/vagy AIDS-ben szenvedõ páciensek esetében. Egy megvalósítási mód szerint a találmány magában foglalja a találmány szerinti készítmény beadását páciensnek, amely páciens olyan humán alany, akinek a CD4+ T¹limfocita-sejtszáma 0 700 sejt/ l vér. Egy még további megvalósítási mód szerint a találmány magában foglalja a találmány szerinti készítmény beadását páciensnek, amely páciens nincs nagyon hatásos retrovírus elleni terápiával kezelve. Egy különös megvalósítási mód szerint a páciens CD4+ T¹limfocita-sejtszáma 0 700 sejt/ l vér és a páciens nincs nagyon hatásos retrovírus elleni terápiával kezelve. Továbbá a találmányt alkalmazhatjuk a gát integritásának csökkenése által okozott komplikációk megelõzésére vagy kezelésére, különösen a hasmenés, különösen a csecsemõhasmenés kezelésére és/vagy megelõzésére. A csecsemõhasmenés csökkent elõfordulási gyakorisága miatt a találmány szerinti készítmény elõnyösen alkalmazható a pelenka által okozott kiütések csökkentésére. A találmány szerinti készítmény beadása csökkenti a táplálék és mikrobiális antigének, különösen az élelmiszer-allergének átjutását az intestinalis lumenbõl a nyálkahártyába vagy a szisztémás keringésbe, és ennek megfelelõen elõnyösen alkalmazható allergia és/vagy allergiás reakció kezelésére vagy megelõzésére, különösen élelmiszer-allergia kezelésére vagy megelõzésére, például élelmiszer anyagok bevitele által kiváltott allergiás reakció. Azt is tapasztaltuk, hogy az EPA, DHA és/vagy ARA képesek az IL 4 hatását csökkenteni az intestinalis permeabilitáson. Ennek megfelelõen a találmány szerint készítmény alkalmazható olyan betegségek kezelésére és/vagy megelõzésére, amelyekben az intenstinalis IL 4-koncentráció megemelkedett (például allergiás betegségek), mint például atopiás dermatitisz. A találmány szerinti készítmény elõnyösen csomagolt por vagy etetésre kész tápszer. Annak érdekében, hogy megelõzzük a termék pazarlását, az etetésre kész tápszer csomagolási mérete nem haladja meg az egy adagot, például elõnyösen nem haladja meg az 0 ml¹t; és a por alakú találmány szerinti készítmény csomagolása elõnyösen nem haladja meg a 2 adagnyit. A por megfelelõ csomagolási mérete a 00 g¹os vagy ennél kisebb, elõnyösen az 00 g¹os vagy ennél kisebb. A találmány tárgyát képezik címkével ellátott csomagolt termékek, amelyek explicite vagy implicite utasítják a fogyasztót a termék alkalmazására a fenti vagy alábbi okoknak megfelelõen. Az ilyen címkék például hivatkozhatnak a találmány szerinti eljárásra, amely az élelmiszer allergének által kiváltott allergiás reakciók megelõzésére szolgál, olyan kifejezésekkel mint, csökkentett élelmiszer-érzékenység, az intestinalis tolerancia javí- 6
1 HU 007 6 T2 2 tása, javított tápláléktolerancia vagy hasonló kifejezések. Hasonló módon lehet hivatkozni jelen allergia kezelésére és/vagy megelõzésére szolgáló eljárásra a javított rezisztencia vagy csökkentett érzékenység kifejezésekkel ekvivalens terminológiával. Tápszerek Azt találtuk, hogy a találmány szerinti készítményt elõnyösen lehet alkalmazni élelmiszerekben, mint amilyen a csecsemõ-élelmiszer és a klinikai élelmiszer. Az ilyen élelmiszer elõnyösen tartalmaz lipidet, fehérjét és szénhidrátot és elõnyösen folyadék formában kerül beadásra. A folyékony élelmiszer kifejezés a találmány szerinti értelemben száraz élelmiszert tartalmaz (például porokat), amelyekhez utasításokat mellékelünk arra vonatkozóan, hogy a száraz élelmiszer-keveréket megfelelõ folyadékkal (például vízzel) kell elkeverni. Ennek megfelelõen a találmány tárgyát képezi továbbá táplálékkészítmény, amely tartalmaz és en% közötti lipidet, és en% közötti fehérjét, 1 és 90 en% közötti szénhidrátot és oligoszacharidok és LC¹PUFA¹k jelen kombinációját. Elõnyösen jelen táplálékkészítmény elõnyösen tartalmaz és en% közötti lipidet, 7, és en% közötti fehérjét, 2 és 7 en% közötti szénhidrátot (az en% az energiaszázalék rövidített formája, és az egyes összetevõknek a készítmény teljes kalorikus értékéhez való hozzájárulását képviseli). Elõnyösen növényi lipidek kombinációját és a következõk közül legalább egyet alkalmazunk: halolaj, omega¹3 növényi, alga- vagy baktériumolaj. A táplálékkészítményben alkalmazott fehérjék elõnyösen a következõk bármelyike: nem emberi állati fehérjék (mint amilyenek a tejfehérjék, húsfehérjék vagy tojásfehérjék), növényi fehérjék (mint amilyen a szójafehérje, búzafehérje, rizsfehérje vagy borsófehérje), szabad aminosavak vagy ezek keverékei. Tehéntej eredetû nitrogénforrás, különösen tehéntejfehérjék, mint amilyen a kazein és a savófehérjék különösen elõnyösek. A széklet rendszertelenségek (például kemény székletek, nem megfelelõ széklettérfogat, hasmenés) sok folyadék-élelmiszert kapó csecsemõ és beteg alanyok esetében fontos problémák. Azt találtuk, hogy a székletproblémák csökkenthetõk jelen oligoszacharidok folyékony élelmiszerként történõ beadásával, amelyeknek az ozmolaritása és 0 mosm/kg közötti, elõnyösebben 0 és 0 mosm/kg közötti. A fentiek fényében, az is fontos, hogy a folyékony tápláléknak ne legyen túlzott kalorikus sûrûsége, azonban az alany táplálásához még elégséges kalóriát adjon. Ennek megfelelõen a folyékony élelmiszer kalorikus sûrûsége 0,1 és 2, kcal/ml közötti, még elõnyösebben 0, és 1, kcal/ml közötti a kalorikus sûrûsége, legelõnyösebben 0,6 és 0,8 kcal/ml közötti. Példák 1. példa: Az LC¹PUFA hatása a gát integritásra Intestinalis T84¹es epitélsejtvonalak [American Type Culture Collection (ATTC), Manassas, Amerikai 1 2 Egyesült Államok] egysejtrétegeit ( monolayer, MC) tenyésztettük Transwell szûrõkön (Corning, Costar BV, Hollandia) amely lehetõvé tette mind a nyálka, mind a szerológiai mintavételt és az emberi intestinalis epithelsejtek serkentését. A konfluencia elérését követõen két héttel az egy sejtrétegeket inkubáltuk az üreges rekeszekben többszörösen telítetlen zsírsavakkal, ARA-val (arachidonsav;,8,11,14-eikozatetraénsav), DHA-val (cisz-4,7,,13,16,19 dokozahexaénsav), EPA-val (eikozapentaénsav) vagy kontroll palmitinsavval (C 16:0) (Palm) (Sigma, St. Louis, Amerikai Egyesült Államok). Az utóbbi eljárást azért választottuk, hogy utánozza a táplálék vegyületek in vivo beadási útvonalát. A sejteket inkubáltuk ARA-val, DHA-val, EPA-val, vagy palmitinsavval 0, 24, 48 és 72 óráig különbözõ koncentrációkban ( M és0 M). A kísérleteket az alap integritás értékelésére végeztük. Az epithelialis gát funkciót a transzepithelialis ellenállás (TER. cm 2 ) megmérésével határoztuk meg, epithelialis volt-ohm mérõ készülékkel (EVOM; World Precision Instruments, Németország) és 4 kd FITC dextránpermeabilitással (paracelluláris permeabilitási jel, Sigma, Amerikai Egyesült Államok). Rezisztancia (Az epitheliumpermeabilitást a 4 kda FITC-dextránra a következõ módon határoztuk meg. A dextránfluxusokat megelõzõen a tápközeget felfrissítettük egy óráig fenolvörös nélküli tenyésztõközeggel, amit l (0 mg/ml törzs) 4 kda FITC-dextrán hozzáadása követett az üreges rekeszbe. perc inkubáció eltelte után 0 l mintát vettünk a szerológiai rekeszbõl és mértük a fluoreszcens jelet 48 nm¹es excitációs hullámhosszon nm¹es emisszión (FLUOstarGalaxy, BMG Labtechnologies. Amerikai Egyesült Államok). A FITC-dextrán fluxusokat pmol FITC-dextrán/cm 2 /h¹ként számoltuk ki. A statisztikai elemzéseket ANOVA alkalmazásával végeztük (SPSS ¹es verzió). A zsírsavak (0 M) hatásának eredményeit a spontán gátintegritásra 72 órás inkubációt követõen adtuk meg az 1. táblázatban. Az 1. táblázat azt mutatja, hogy az ARA, EPA és DHA LC¹PUFA¹k csökkentik a molekuláris fluxust és javítják az epithelialis ellenállást. Ezzel szemben a kontroll kísérletek azt mutatják, hogy a palmitinsavnak ellentétes hatása van, azaz elrontja a gát integritását. Ezek az eredmények mutatják az EPA, DHA és ARA, és különösen az ARA elõnyös alkalmazását a találmány szerinti készítményben és a találmány szerinti eljárásban, azaz a gát integritásának javítására szolgáló eljárásban. Ezen eredmények továbbá alátámasztják a jelen zsírsav és emészthetetlen oligoszacharid kombináció szinergisztikus hatásait. Az 1. ábra különbözõ zsírsavaknak (palmitinsav, DHA, GLA, és AA) idõ- és dózisfüggõ ( M és 0 M) hatásait mutatja az alap gátintegritásra (TER). Az 1. ábra azt mutatja, hogy az AA, DHA, és GLA LC¹PUFA¹k javítják az epitéliális gát integritását, ahogy ez a megnövekedett ellenállásból (TER) tükrözõdik. Ezek az eredmények jellemzik az EPA, DHA, GLA és ARA, különösen az ARA elõnyös alkalmazását a találmány szerinti készítményben a gát integritásának javítására. Ezek az eredmények továbbá alátámasztják a 7
1 HU 007 6 T2 2 jelen zsírsav és emészthetetlen oligoszacharid kombináció szinergisztikus hatásait. Összetevõ (LC-PUFA) 1. táblázat Fluxus Ellenállás (TER) Kontroll 79 90 Palmitinsav 161 831 DHA 72 174 ARA 28 1816 EPA 6 1493 1 2 2. példa: Az LC¹PUFA hatása az IL 4 által kiváltott gátsérülésre Intenstinalis T84¹es epitélsejtvonalak (ATTC, Amerikai Egyesült Államok) egysejtrétegeit ( mono-layer, MC) tenyésztettük Transwell filter (Corning, Costar BV, Hollandia) amely lehetõvé tette mind a nyálka, mind a szerológiai mintavételt és az emberi intestinalis epitélsejtek serkentését. A konfluencia elérését követõen két héttel az egysejtrétegeket inkubáltuk IL 4 (2 ng/ml, szerológiai kompartment, Sigma, Amerikai Egyesült Államok) jelenlétében ARA, DHA, EPA vagy kontroll palmitinsavval többszörösen telítetlen zsírsavakkal, vagy ezek nélkül ( M vagy 0 M, nyálkarekesz, Sigma, St. Louis, Amerikai Egyesült Államok). A sejteket 48 órát elõ inkubáltuk ARA-val, DHA-val, EPA-val vagy palmitinsavval az IL 4¹es inkubációt megelõzõen. A PUFA¹k és a palmitinsav együttes inkubációját az IL 4-gyel további 48 óráig végeztük; miközben a tenyésztõközeget és az adalékokat minden 24 órában cseréltük. Az epitéliális gátfunkciót a transzepithelialis ellenállás és a permeabilitás megmérésével határoztuk meg az 1. példában ismertetett módon. Az ARA, DHA, EPA és palmitinsav (0 M) hatásának eredményeit az IL 4 által kiváltott gátsérülésre a 2. táblázatban adtuk meg. A 2. táblázat azt mutatja, hogy az ARA, DHA és EPA LC¹PUFA¹k gátolják az IL 4 által kiváltott megnövekedett fluxust. Ezzel szemben a palmitinsavnak káros hatása volt és csökkentette a gát sérülését a kontrollal összehasonlítva. Ezek az eredmények jellemzõek az ARA, DHA és EPA elõnyös alkalmazására klinikai vagy csecsemõtáplálék kiszerelésekben az IL 4 által kiváltott gátsérülés megelõzésére vagy csökkentésére, például ahogy ez élelmiszervagy tehéntej-allergia esetén történik. Ezen eredmények további alátámasztást adnak a jelen zsírsav és emészthetetlen oligoszacharid kombináció szinergisztikus hatásainak. A 2. ábra adja meg az idõ és dózis ( M vagy 0 M) függõ védõ hatásait a különbözõ FA¹knak (palmitinsav, DHA, GLA, és AA) az IL 4 által kiváltott gátsérülésre (Fluxus). A 2. ábra azt mutatja, hogy az ARA, DHA és GLA védenek az IL 4 által kiváltott gátsérüléssel szemben, ahogy ez a lecsökkent 4 kd dextránfluxusból tükrözõdik. Ezek az eredmények jellemzõek az ARA, DHA és GLA elõnyös alkalmazására klinikai és csecsemõtáplálék-kiszerelésekben az IL 4 által kiváltott gátsérülés megelõzésére vagy csökkentésére, például ahogy ez élelmiszer- vagy tehéntej-allergia esetén történik. Ezen eredmények további alátámasztást adnak a jelen zsírsav és emészthetetlen oligoszacharid kombináció szinergisztikus hatásainak. Összetevõ (LC-PUFA) 2. táblázat IL 4 Fluxus IL 4 TER Kontroll 73 281 GLA 3 331 ARA 273 337 EPA 236 37 DHA 4 328 =PUFA által csökkentett permeabilitás; =PUFA által növelt ellenállás 3. példa: Oligoszacharidok hatása az acetáttermelésre Mikroorganizmusokat vettünk tápszerrel táplált csecsemõk friss székletébõl. Friss székletanyagot gyûjtöttünk 1 4 hónapos korú csecsemõktõl és két órán belül tartósítóközegbe tettük. Szubsztrátként vagy prebiotikumot [TOS; TOS/inulin (HP) 9/1 (tömeg/tömeg) arányú keverék: inulin; oligofruktóz(os)/inulin 1/1 (tömeg/tömeg) arányú keverékben], vagy semmit sem (üres) alkalmaztunk. A transzgalaktooligoszacharidokat (TOS) a Vivinal GOS, Borculo Domo Ingredients, Zwolle, Hollandia cégtõl szereztük be és emészthetetlen oligoszacharidként a következõket tartalmazta: 33 tömeg% diszacharidok, 39 tömeg% triszacharidok, 18 tömeg% tetraszacharidok, 7 tömeg% pentaszacharidok és 3 tömeg% hexa¹, hepta- és oktaszacharidok. Az inulin (HP) Orafti active food ingredients, Tienen, Belgium, például RaftilineHP, 23¹as átlagos DP¹vel. Tápközeg: McBain & MacFarlane tápközeg: pufferezett pepton víz 3,0 g/l, élesztõkivonat 2, g/l, mucin [kefeszegély ( brush border )] 0,8 g/l, tripton 3,0 g/l, L¹cisztein-HCl 0,4 g/l, epesavas sók 0,0 g/l, K 2 HPO 4.3H 2 O 2,6 g/l, NaHCO 3 0,2 g/l, NaCl 4, g/l, MgSO 4.7H 2 O 0, g/l, CaCl 2 0,228 g/l, FeSO 4.7H 2 O 0,00 g/l. 0 ml¹es Scott üvegeket töltöttünk meg a tápközeggel és 1 percig sterilizáltuk 121 C¹on. Pufferezett tápközeg: K 2 HPO 4.3H 2 O 2,6 g/l, NaHCO 3 0,2 g/l, NaCl 4, g/l, MgSO 4.7H 2 O 0, g/l, CaCl 2 0,228 g/l, FeSO 4.7H 2 O 0,00 g/l. A ph=6,3±0,1¹re állítva K 2 HPO 4 -gyel vagy NaHCO 3 -tal. 0 ml¹es Scott-üvegeket töltöttünk meg a tápközeggel és 1 percig sterilizáltuk 121 C¹on. Tartósító tápközeg: Pufferezett pepton,0 g/l, L¹cisztein-HCl 0, g/l, nátrium-tioglikolát 0, g/l, resazurin tabletta literenként 1, a ph¹t 6,7±0,1¹re állítottuk 1 M NaOH-lal vagy HCl-dal. Mikrohullámban fõzve. Szérumüvegeket töltöttünk meg 2 ml tápközeggel és 1 percig sterilizáltuk 121 C¹on. Friss székletmintákat kevertünk össze tartósító tápközeggel és több óráig tároltuk 4 C¹on. A székletek 8
1 HU 007 6 T2 2 tartósított oldatát 13 000 rpm¹en centrifugáltuk 1 percig, a felülúszót eltávolítottuk és McBain & Mac Farlane közeggel összekevert székletet kevertünk hozzá 1: tömegarányban. Ebbõl a székletoldatból 3 ml¹t kevertünk össze 8 mg glukózzal vagy prebiotikummal vagy semmivel (üres) egy üvegben és teljesen elkevertük. t=0 mintát vettünk (0, ml). Az eredményül kapott 2, ml szuszpenziót dialízis csõbe tettük egy ml¹es üvegbe, amely ml pufferezett tápközeget tartalmazott. Az üveget jól lezártuk és 37 C¹on inkubáltuk. A dialíziscsövekbõl (0,2 ml) vagy a dialízispufferbõl (1,0 ml) mintákat vettünk hipodermiás fecskendõvel 3, 24, és 48 órát követõen és azonnal jégre tettük a fermentáció megállításához. A kísérletet a következõ minták alkalmazásával végeztük: 1) 8 mg TOS, 2) 8 mg inulin, 3) 8 mg TOS/inulin 9/1 (tömeg/tömeg) arányban, és 4) 8 mg OS/inulin 1/1 (tömeg/tömeg) arányban. SCFA¹t (acetát, propionát, butirát) határoztunk meg Varian 3800 gázkromatográf (GC) (Varian Inc., Walnut Creek, Amerikai Egyesült Államok) alkalmazásával, amely lángionizációs detektorral volt ellátva. A mintákból 0, l¹t injektáltunk 80 C¹on az oszlopba (Stabilwax, 1 0,3 mm, 1,00 m filmvastagság, Restek Co., Amerikai Egyesült Államok) hélium hordozógáz alkalmazása mellett [,7 KPa (3,0 psi)]. A minta injektálását követõen a kemencét 1 C¹ra hevítettük 16 C/perc sebességgel, amelyet 2 C¹ra történõ melegítés követett C/perc sebességgel és végül 2 C¹on tartottuk 1, percig. Az injektor és a detektor hõmérséklete 0 C volt. 2¹etil-butirsavat alkalmaztunk standardként. A 3. ábra mutatja az abszolút (3A. ábra) és a relatív SCFA profilt (3B. ábra), amely a különbözõ oligoszacharidok fermentációja révén keletkezett. A 3A. ábra azt mutatja, hogy két különbözõ oligoszacharid keveréke (TOS/inulin), amelyben a két különbözõ oligoszacharid homológiája a monoszacharidegységekben 90 alatti, és a különbözõ lánchosszúság azt eredményezi, hogy az SCFA (különösen az acetát) mennyisége egy gramm rostra vetítve szignifikánsan és szinergisztikusan nagyobb, mint az egyedi komponenseké. A 3B. ábra azt mutatja, hogy a TOS/inulin kombináció hozzáadása az elõnyös acetát nagyobb arányának kedvezett (B). Az in vivo acetáttermelés a kehelysejtek általi javított nyálkatermelést és intestinalis nyálkaréteg-vastagodást vált ki (lásd 4. példa). Ezen eredmények jellemzik a találmány szerinti készítmény elõnyös alkalmazását. 1 2 4. példa: Az SCFA hatásai a nyálkatermelésre Intenstinalis T84¹es epithelsejtek (ATTC, Amerikai Egyesült Államok) egysejtrétegeit tenyésztettük 24 vagy 96 lyukú szövettenyészet lemezeken (Corning B. V.). A T84¹et inkubáltuk a rövid láncú zsírsavak acetátjával, propionátjával és butirátjával (SCFA, Merck, Amerikai Egyesült Államok) 24 órát 0,02 4,0 mm koncentrációtartományban. Felülúszót és/vagy sejteket gyûjtöttünk és meghatároztuk a MUC¹2- (mucin) termelést. Pontblottolásos technikát alkalmaztunk a sejttenyészetekben a MUC-2-expresszió meghatározásához, mivel a mucinok különösen nagyméretû glikoproteinek (0 kda felettiek), amely nehézzé teszi a kezelésüket Western-blottolásos technikákban. Az eljárást validáltuk preimmunszérum (T84-gyel festve negatív), CCD 18¹Co (ATTC. Amerikai Egyesült Államok) negatív kontrollsejtek és marhaszérum-albumin (BSA) alkalmazásával. Sejtmintákat gyûjtöttünk Laemmliben (fehérjeizolációs puffer) és fehérjemeghatározást végeztünk mikrofehérjevizsgálat (Biorad, Amerikai Egyesült Államok) alkalmazásával, a gyártó protokollja szerint. Mintákat (0,3 0,7 1,0 g/2 l) pöttyöztünk nitro-cellulóz-membránokra (Schleicher & Schuell, Németország). A membránokat blokkoltuk TBST/% Protivarban (Nutricia, Hollandia) melyet 1 órás inkubáció követett anti- MUC 2 antitesttel (Dr. Einerhand kedves adománya, Erasmus University, Rotterdam, Hollandia). A mosást követõen a blottokat kecske nyúl elleni-hrp-vel inkubáltuk (Santacruz Biotechnology, Amerikai Egyesült Államok) és a szubsztrátdetektáláshoz ECL¹t (Roche Diagnostics, Hollandia) alkalmaztunk. Denzitometriát végeztünk Lumi-Imager (Boehringer Mannheim B. V., Hollandia) alkalmazásával és a jelet fényegységekben fejeztük ki (BLU). A BLU-kat kifejeztük relatíve a kontroll inkubációkhoz is (%BLU). Az SCFA-nak a MUC-2-expresszióra kifejtett serkentõhatásának összehasonlításához az alap MUC 2 expressziós szinteket levontuk. A 4. ábra mutatja az SCFA (acetát, propionát, butirát) különbözõ hatásait a MUC-2-expresszióra intestinalis epithelialis sejtekben (MC T84) és epithelialis-mesenchymalis közös sejttenyészetekben (CC T84). A 4. ábra azt is mutatja, hogy az acetát hatásosabb a MUC-2-serkentésre (nyálkatermelés) a propionáttal és a butiráttal összehasonlítva. Ennek megfelelõen oligoszacharidok jelen kombinációja [amelyrõl bemutattuk, hogy növeli az acetáttermelést (lásd 3. példa)] különösen alkalmas a nyálkatermelés serkentésére és elõnyösen alkalmazható a gát integritásának javítására szolgáló eljárásban.. példa: Csecsemõ tejtápszer I Összetevõk (egy literben), energia 672 Kcal; fehérje 1 g; tejsavó:kazein arány : ; zsír 36 g; szénhidrát 72 g; A¹vitamin 7 RE; kevert természetes karotinoidok 0 IU; D¹vitamin,6 mcg; F¹vitamin 7,4 mg; K¹vitamin 67,0 mcg; B1¹vitamin (thiamin) 00 mcg; B2¹vitamin (riboflavin) mcg; B6¹vitamin (piridoxin) 0 mcg; B12-vitamin (cianokobalamin) 2,0 mcg; niacin 9,0 mcg; folsav 80 mcg; pantoténsav 00 mcg; biotin 90 mcg; C¹vitamin (aszkorbinsav) 90 mg; kolin 0 mg; inozitol 33 mg; kalcium 4 mg; foszfor 333 mg; magnézium 64 mg; vas 8,0 mg; cink 6,0 mg; mangán mcg; réz mcg; jód 0 mcg; nátrium 1 mg; kálium 6 mg; klorid 433 mg és szelén 14 mcg; amelyben a zsírtartalom tartalmaz 3 gramm halolajat és 3 gramm %¹os arachidonsav-olajat (DSM Food Specialties, Delft, Hollandia); tartalmaz továbbá 4 gramm transzgalaktooligoszacharidot Elix or (Borculo Domo Ingredients, Hollandia) és 4 gramm Raftiline ¹et (Orafti Active Food Ingredients, Belgium). 9
1 HU 007 6 T2 2 6. példa: HIV/AIDS rokon tünetek csökkentésére szolgáló táplálékrúd összetétele Nyersanyag g/nap Fehérje Szénhidrát Zsír g/0 g Tejfehérje,00 1,00 2, 0,80 21,04 Tojásfehérje 21,09 16,87 0,00 0,00 22,19 Borágóolaj 4,00 0,00 0,00 4,00 4,21 EPA-DHA olaj 6,00 0,00 0,00 6,00 6,31 Galaktooligoszacharidok 1,38 0,00 4,78 0,00 16,18 Inulin 0,79 0,00 0,00 0,00 0,83 Pektin-hidrol 8,4 0,11 0,09 0,00 8,98 Fructosestroop 1, 0,00 11,92 0,00 16, Glicerin 3,8 0,00 3,83 0,00 4,0 Összesen 9,0 31,98 22,72,80 0,00 Naponta kcal En% 0 g¹ban kcal Energia fehérje 128, 1 Energia szénhidrát 91 28,8 96 Energia zsír 97,8 2 SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Többszörösen telítetlen zsírsavak alkalmazása humán immunhiányvírussal (HIV) fertõzött páciens kezelésére szolgáló készítmény elõállítására, amely készítmény tartalmaz: a) eikozapentaénsavat (EPA), dokozahexaénsavat (DHA) és arachidonsavat (ARA), ahol a és 22 szénatomos hosszú láncú, többszörösen telítetlen zsírsavak aránya a teljes zsírtartalom legalább 1 tömeg%¹a és legfeljebb 8 tömeg%¹a; és b) legalább két különbözõ oligoszacharidot (OL1 és OL2), ahol a két különbözõ oligoszacharid homológiája monoszacharidegységekben kifejezve 90% alatti. 2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a készítmény továbbá gamma-linolénsavat (GLA) is tartalmaz. 3. Táplálékkészítmény, amely tartalmaz: a) eikozapentaénsavat (EPA), dokozahexaénsavat (DHA) és arachidonsavat (ARA), ahol a és 22 szénatomos hosszú láncú, többszörösen telítetlen zsírsavak aránya a teljes zsírtartalom legalább 1 tömeg%¹a és legfeljebb 8 tömeg%¹a; és b) legalább két különbözõ oligoszacharidot (OL1 és OL2), ahol a két különbözõ oligoszacharid homológiája monoszacharidegységekben kifejezve 90% alatti, c) pektinbõl, pektátból, alginátból, chondroitinbõl, hialuronsavakból, heparinból, heparánból, szialoglikánokból, fukodiánból, fukooligoszacharidokból vagy karragenánból elõállított savas oligoszacharidot, elõnyösen 2 és közötti polimerizációs fokú (DP) uronsavpolimert. 4. A 3. igénypont szerinti készítmény, amely fruktooligoszacharidok, inulin és ezek keverékei közül választott fruktánt és galaktooligoszacharidot tartalmaz.. A 3. vagy 4. igénypont szerinti készítmény, ahol az oligoszacharid legalább tömeg%¹a 2 polimerizációs fokú (DP) és legalább tömeg%-ának polimerizációs foka. 6. A 3. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amely 7, 12, energia% fehérjét; energia% szénhidrátokat; és energia% zsírt tartalmaz, ahol a fehérje hidrolizált tejfehérje, növényi fehérje és/vagy aminosavak alkotta csoportból választott tagot foglal magában. 7. A 3 6. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amely készítmény kalóriatartalma 0,6 0,8 kcal/ml; ozmolaritása 0 mosm/kg; és viszkozitása mpa s alatti. 8. A 3 7. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amely készítmény továbbá GLA¹t is tartalmaz. 9. A 3 8. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, gyógyszerként történõ alkalmazásra.. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a páciens olyan humán alany, akinek a CD4+ T¹limfocitasejtszáma 0 és 700 sejt/ l vér közötti, és ahol a páciens nincs kezelve nagyon hatásos, retrovírus elleni terápiával ( Highly Active Retroviral Therapy ). 11. A 3 9. igénypontok bármelyike szerinti készítmény alkalmazása emlõsben hasmenés kezelésére vagy megelõzésére szolgáló gyógyszer gyártására.
HU 007 6 T2 Int. Cl.: A23L 1/ 11
HU 007 6 T2 Int. Cl.: A23L 1/ 12
HU 007 6 T2 Int. Cl.: A23L 1/ 13
HU 007 6 T2 Int. Cl.: A23L 1/ Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest