!HU0000076T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 007 6 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 07 8969 (22) A bejelentés napja: 04. 06. 22. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 0708969 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1817 A1 07. 08. 08. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1817 B1 09. 04. 22. (1) Int. Cl.: A23L 1/29 (06.01) A23L 1/ (06.01) (72) Feltalálók: Van Tol, Eric Alexander Franciscus, 6824 MZ, Arnhem (NL); Willemsen, Linette Eustachia Maria, 322 AJ, Utrecht (NL); Koetsier, Marleen Antoinette, 8161 XJ, Epe (NL); Beermann, Christopher, D-61267, Neu-Anspach (DE); Stahl, Bernd, D-61191, Rosbach-Rodheim (DE) (73) Jogosult: N. V. Nutricia, 2712 HM Zoetermeer (NL) (74) Képviselõ: dr. Gyõrffy Béla, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest (4) Az intestinalis gát integritásának javítása (7) Kivonat A találmány tárgya csecsemõtápszer-készítmény, továbbá a készítmény alkalmazása allergia kezelésére vagy megelõzésére szolgáló eljárásban alkalmazható gyógyszer elõállítására. HU 007 6 T2 A leírás terjedelme 14 oldal (ezen belül 4 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 199. évi XXXIII. törvény 84/H. -a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1 HU 007 6 T2 2 A találmány területe A találmány tárgya eljárás az intestinalis gát ( intestinal barrier ) integritásának javítására és az ilyen eljárásban történõ alkalmazásra megfelelõ készítmény. A találmány háttere A gastrointestinalis epithelium normálisan szelektív gátként mûködik, lehetõvé teszi a tápanyagok, elektrolitok és víz abszorpcióját és meggátolja az élelmezési és mikrobiális antigéneknek, ideértve a táplálék allergéneket, való kitettséget. A gastrointestinalis epithelium korlátozza az olyan antigének átjutását a szisztémás keringésbe, amelyek gyulladásos reakciókat, például allergiás reakciókat válthatnak ki. Ahogy az allergia, különösen a táplálékallergia elõfordulása növekszik, számos kutatócsoport keres (megelõzõ) gyógymódokat ezen betegségekre. A 1278 számú európai szabadalom egy készítményt ismertet, amely emészthetetlen oligoszacharidokat tartalmaz, a szoros sejtkapcsolat javítására, hogy ezzel csökkentsék az intestinalis permeabilitást és csökkentsék az allergiás reakciókat. A készítmény tartalmazhat LC¹PUFA-kat ( long chain-polyunsaturated faty acids, hosszláncú többszörösen telítetlen zsírsavak). A 701 számú európai szabadalom emészthetetlen oligoszacharidok kombinációját ismerteti és n¹3 és n¹6 zsírsavakat az ulcerativ colitis kezelésére. Usami és munkatársai (Clinical Nutrition 01, (4): 31 39) ismertették az eikozapentaénsav (EPA) hatását a szoros sejtkapcsolatok permeabilitására az intestinalis egysejtrétegben. Az õ kezükben az EPA-ról azt találták, hogy növeli a permeabilitást, ami azt jelezte, hogy az EPA nem megfelelõ az intestinalis gát integritásának javítására. A technika állása szerinti készítmények nem optimálisan megfelelõek a gátegység javítására. 1 2 3 4 0 A találmány összefoglalása A találmány tárgya válogatott hosszú láncú többszörösen telítetlen zsírsavak (LC-PUFA¹k) és válogatott oligoszacharidok kombinációja. A találmány szerinti LC¹PUFA és oligoszacharid kombináció hatásosan javítja a gát integritását az inestinalis permeabilitás és a nyálkatermelés szinergisztikus javítása révén, és különösen alkalmas a gát integritásának javítására csecsemõkben. Meglepetésre azt találtuk, hogy egyes LC¹PUFA¹k hatásosan csökkentették az epithelialis paracelluláris permeabilitást. Szemben azzal, amirõl Usami és munkatársai [Clinical Nutrition (4) 31 39 (01)] számoltak be, azt találtuk, hogy a C18 és C többszörösen telítetlen zsírsavak, különösen az eikozapentaénsav (EPA), dokozahexaénsav (DHA) és arachidonsav (ARA) képes hatásosan csökkenteni az intestinalis szoros sejtkapcsolat permeabilitását. Az LC¹PUFA-kon kívül a találmány szerinti készítmény tartalmaz oligoszacharidokat. A kiválasztott oligoszacharidok javítják a gát integritását a nyálkatermelés serkentése révén, amely megnövelt nyálkaréteg¹vastagságot eredményez. Úgy gondoljuk, hogy ezt a hatást a különbözõ oligoszacharidoknak a rövid láncú zsírsav (SCFA) termelésre kifejtett hatása okozza. Ennek megfelelõen, amennyiben jelen LC¹PUFA és emészthetetlen oligoszacharidok kombinációja enterálisan kerül beadásra emlõsnek, akkor szinergisztikusan javítja a gát integritását és/vagy szinergisztikusan csökkenti az intestinalis permeabilitást, a szoros sejtkapcsolat permeabilitásra és a nyálkatermelés serkentésére kifejtett szimultán hatása révén. A találmány egy további szempontja szerint a készítmény javítja az intestinalis nyálkaréteg minõségét. A nyálkaréteg mucinokat tartalmaz. A mucinok nagy molekulatömegû glikoproteinek, amelyeket kehelysejtek szintetizálnak és választanak ki. Gélszerû réteget alakítanak ki a nyálkás felületen, ezzel javítják a gát integritását. A nyálkaréteg különbözõ típusú mucinokat tartalmaz, például savas, semleges és szulfonált mucinokat. A nyálkaréteg megnövekedett heterogenitásáról azt gondoljuk, hogy javítja a gát mûködését. A találmány szerinti készítmény elõnyösen legalább kettõ különbözõ oligoszacharidot tartalmaz, amely befolyásolja a nyálka felépítését és elõnyös módon befolyásolja a mucin heterogenitást a nyálkarétegben, vagy közvetlenül vagy a bélflóra megváltoztatásával. Véleményünk szerint minden egyes különbözõ kiválasztott oligoszacharid a nyálka mennyiségére különbözõ hatást gyakorol. Továbbá két különbözõ oligoszacharid szintén képes a nyálka minõségének javítására, ahogy ez a szulfonálás mértékében tükrözõdik, az SCFA termelés szinergisztikus stimulálásával. Meglepetésünkre azt találtuk, hogy a találmány szerinti két különbözõ oligoszacharid keveréke szinergisztikusan serkenti az acetáttermelést. Azt is felismertük, hogy a nyálkatermelés függ az acetáttermeléstõl. Jelen készítményt elõnyösen tovább javítjuk mind hosszú, mind rövid láncú oligoszacharidok hozzáadásával. A különbözõ lánchosszok hozzáadása az ileum (csípõbél) és a vastagbél különbözõ részein eredményezi a nyálkahártya serkentését. A rövid láncú oligoszacharidok (jellemzõen a 2, 3, 4 vagy polimerizációs fokúak [DP]) a proximális vastagbélben és/vagy a disztális ileumban serkentik a mucintermelést, míg a hosszabb láncú oligoszacharidokról (elõnyösen ¹as polimerizációs fokú [DP]) azt gondoljuk, hogy a vastagbél ( colon ) disztálisabb részén serkentik a mucintermelést. Még további javítások érhetõek el legalább kettõ különbözõ oligoszacharid mind rövid láncú, mind hosszú láncú oligoszacharid hozzáadásával. Ezen elõnyös megvalósítási módok mind hozzájárulnak a gát integritásának további javításához az ileum és/vagy a vastagbél teljes hosszában. Továbbá meglepetésre azt találtuk, hogy az EPA, DHA és ARA képes volt csökkenteni az interleukin 4 (IL 4) káros hatását az intestinalis permeabilitásra. Az IL 4 egy citokin, amelyet bizonyos betegekben a nyálkahártya T¹sejtjei megnövekedett mennyiségben választanak ki, és amely kiváltja az intestinalis permeabilitást. Ennek megfelelõen a találmány tárgya eljárás 2
1 HU 007 6 T2 2 olyan betegségek kezelésére és/vagy megelõzésére, amelyekben az intestinalis IL 4 koncentráció megemelkedett, mint amilyen az allergia, különösen az atopiás dermatitis. A találmány részletes ismertetése A találmány tárgya csecsemõtápszer készítmény, amely tartalmaz 7, 12, energia% fehérjét; energia% szénhidrátokat; és 3 0 energia% zsírt, ahol a fehérje hidrolizált tejfehérje, növényi fehérje és aminosavak alkotta csoportból választott fehérjerészt tartalmaz, és a) eikozapentaénsavat (EPA), dokozahexaénsavat (DHA) és arachidonsavat (ARA), ahol a és 22 szénatomos hosszú láncú többszörösen telítetlen zsírsavak aránya nem haladja meg a teljes zsírtartalom 1 tömeg%¹át; és b) legalább két különbözõ oligoszacharidot (OL1 és OL2), ahol a két különbözõ oligoszacharid homológiája monoszacharidegységekben kifejezve 90% alatti; és c) 1 00 mg nukleozidot és/vagy nukleotidot 0 g tápszer-szárazanyagra vetítve. Ezen készítményt elõnyösen lehet alkalmazni intestinalis gát integritását javító eljárásban, amely eljárás tartalmazza a készítmény beadását emlõsnek. 1 2 3 4 0 Többszörösen telítetlen zsírsavak Meglepetésünkre azt találtuk, hogy az eikozapentaénsav (EPA, n¹3), dokozahexaénsav (DHA, n¹3) és arachidonsav (ARA, n¹6) hatásosan csökkentik az intestinalis szoros sejtkapcsolat permeabilitását. Ennek megfelelõen a találmány szerinti készítmény, amely különösen alkalmas az intestinalis gát integritásának javítására, tartalmaz EPA¹t, DHA¹t és ARA¹t. Azt találtuk, hogy LC¹PUFA¹k alacsonyabb koncentrációja hatásos volt a szoros sejtkapcsolat permeabilitás csökkentésére (lásd a példákat az Usami és munkatársai közleményével szemben). Ennek megfelelõen a és 22 szénatomos LC¹PUFA-tartalom a találmány szerinti készítményben elõnyösen nem haladja meg a teljes zsírtartalom 1 tömeg%¹át, elõnyösen nem haladja meg a tömeg%¹át, még elõnyösebben nem haladja meg a teljes zsírtartalom tömeg%¹át. Elõnyösen a találmány szerinti készítmény a teljes zsírtartalomnak legalább 0,1 tömeg%-ában, elõnyösen legalább 0,2 tömeg%-ában, még elõnyösebben legalább 0, tömeg%-ában, még elõnyösebben legalább 0,7 tömeg%-ában tartalmaz és 22 szénatomos LC¹PUFA¹t. Ugyanezen okból az EPA-tartalom elõnyösen nem haladja meg a teljes zsírtartalom tömeg%¹át, még elõnyösebben nem haladja meg a teljes zsírtartalom 1 tömeg%¹át, de elõnyösen a teljes zsírtartalomnak legalább 0,0 tömeg%¹a, még elõnyösebben legalább 0,1 tömeg%¹a. A DHA-tartalom elõnyösen nem haladja meg a teljes zsírtartalom tömeg%¹át, még elõnyösebben nem haladja meg az 1 tömeg%¹át, de legalább 0,1 tömeg%¹a. Mivel az ARA¹t különösen hatásosnak találtuk a szoros sejtkapcsolat permeabilitásának csökkentésére, ezért a találmány szerinti készítmény viszonylag nagy mennyiségben tartalmazza, elõnyösen a teljes zsírtartalomnak legalább 0,1 tömeg%-ában, elõnyösebben legalább 0,2 tömeg%- ában, legelõnyösebben legalább 0, tömeg%-ában. Az ARA-tartalom elõnyösen nem haladja meg a teljes zsírtartalom tömeg%¹át, még elõnyösebben nem haladja meg az 1 tömeg%¹át. A jelen ARA-tartalmú enterális készítményhez elõnyösen EPA¹t és DHA¹t adtunk, hogy kiegyensúlyozzuk az ARA hatását, például hogy csökkentsük az ARA-metabolitok lehetséges gyulladáskeltõ hatását. Az ARA-metabolitok túlzott mennyisége gyulladást okozhat. Ennek megfelelõen a találmány szerinti készítmény elõnyösen tartalmaz ARA¹t, EPA¹t és DHA¹t, amelyben az ARA/DHA tömegarány elõnyösen 0,2 feletti, elõnyösebben 0, feletti, még elõnyösebben 1 feletti. Az arány elõnyösen 2 alatt van. Az ARA/EPA tömegarány elõnyösen 1 és 0 közötti, elõnyösebben és közötti. A találmány szerinti készítmény elõnyösen a teljes zsírtartalomra vetítve és 7 tömeg% közötti mennyiségben tartalmaz többszörösen telítetlen zsírsavakat, elõnyösen és 0 tömeg% között. Amennyiben a találmány szerinti készítményt csecsemõtápszerként alkalmazzuk (például eljárás csecsemõ táplálására, amely eljárás tartalmazza a találmány szerinti készítmény beadását csecsemõnek), akkor az LC¹PUFA¹tartalom, különösen a és 22 szénatomos LC¹PUFA nem haladja meg a teljes zsírtartalom 3 tömeg%¹át, mivel kívánatos az emberi tej utánzása, amennyire csak lehetséges. Ugyanezen okból, az omega¹3 LC¹PUFA-tartalom elõnyösen nem haladja meg a teljes zsírtartalom 1 tömeg%¹át; az omega¹6 LC¹PUFA-tartalom elõnyösen nem haladja meg a teljes zsírtartalom 2 tömeg%¹át; az ARA (omega¹6) tartalom elõnyösen a teljes zsírtartalom 1 tömeg%¹a alatt van; és/vagy az EPA/DHA tömegarány elõnyösen 1 vagy kisebb, még elõnyösebben 0,-nél kisebb. A és 22 szénatomos LC¹PUFA lehet szabad zsírsavakként, triglicerid formában, foszfolipid formában jelen, vagy az elõzõk valamelyikének vagy többjének a keveréke formájában. A találmány szerinti készítmény elõnyösen legalább az ARA vagy DHA egyikét foszfolipid formában tartalmazza. A találmány szerinti táplálékkészítmény elõnyösen tartalmaz omega¹9 (n¹9) zsírsavat (elõnyösen oleinsavat, 18:1) a megfelelõ táplálás nyújtása érdekében. Elõnyösen a találmány szerinti készítmény a teljes zsírtartalomra vetítve legalább 1 tömeg% n¹9 zsírsavat ad, elõnyösebben legalább 2 tömeg%¹ot. Az n¹9 zsírsavtartalom elõnyösen 80 tömeg% alatti. Oligoszacharidok A találmány szerinti megfelelõ oligoszacharidok az olyan szacharidok, amelyek polimerizációs foka (DP) legalább 2 monoszacharidegység, amelyek nem vagy csak részlegesen emésztõdnek meg a belekben az emberi felsõ emésztési szakaszban (vékonybél és gyomor) jelen lévõ savak vagy emésztõenzimek hatására, de amelyeket az emberi bélflóra képes fermentálni. A monoszacharidegység kifejezés olyan egységeket 3
1 HU 007 6 T2 2 1 2 3 4 0 jelöl, amelyek zárt gyûrûszerkezettel bírnak, elõnyösen hexóz, például piranóz vagy furanóz formájúak. Az oligoszacharid polimerizációs foka jellemzõen monoszacharidegység alatti, elõnyösen alatti, még elõnyösebben alatti. A találmány szerinti készítmény legalább két különbözõ oligoszacharidot tartalmaz, ahol az oligoszacharidok homológiája a monoszacharidegységekben körülbelül 90% alatti, elõnyösen 0% alatti, még elõnyösebben 2% alatti, még elõnyösebben % alatt. A homológia kifejezés, a találmány szerinti értelemben a különbözõ oligoszacharidokban az azonos monoszacharidegységek százalékának kumulatív értéke. Például az 1¹es oligoszacharid (OL1) szerkezete a következõ: fruktóz-fruktóz-glukóz-galaktóz, és így 0% fruktózt, 2% galaktózt és 2% glukózt tartalmaz. A 2¹es oligoszacharid (OL2) szerkezete a következõ: fruktóz-fruktóz-glukóz, és így 66% fruktózt és 33% glukózt tartalmaz. A különbözõ oligoszacharidok homológiája így 7% (0% fruktóz+2% glukóz). Egy elõnyös megvalósítási mód szerint a találmány szerinti készítmény tartalmaz galaktooligoszacharidokat és a következõk közül legalább egyet: fruktooligoszacharidok vagy inulin. Minden egyes találmány szerinti oligoszacharid a benne található monoszacharidegységek összes számának elõnyösen legalább 66%-ban, elõnyösebben legalább 90%-ban olyan monoszacharidegységet tartalmaz, amely a következõk bármelyike: mannóz, arabinóz, fruktóz, fukóz, ramnóz, galaktóz, ¹D-galaktopiranóz, ribóz, glukóz, xilóz, uronsav vagy ezek származékai. Egy további megvalósítási mód szerint a találmány szerinti oligoszacharidok közül legalább egy a következõk bármelyike: fruktánok, fruktooligoszacharidok, emészthetetlen dextrinek galaktooligoszacharidok (ideértve a transzgalaktooligoszacharidokat), xilooligoszacharidok, arabinooligoszacharidok, glukooligoszacharidok, mannooligoszacharidok, fukooligoszacharidok, savas oligoszacharidok (lásd alább például uronsavoligoszacharidok, mint amilyen a pektinhidrolizátum) vagy ezek keverékei. Elõnyösen a találmány szerinti készítmény tartalmaz legalább egyet, elõnyösen legalább kettõt a következõ oligoszacharidok közül: fruktooligoszacharidok vagy inulin, galaktooligoszacharidok vagy pektinhidrolizátum. A jó nyálkamennyiség és ¹minõség érdekében a találmány szerinti készítmény elõnyösen legalább egy oligoszacharidot tartalmaz, amely legalább 66% galaktózt vagy fruktózt tartalmaz monoszacharidegységként. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint a készítmény tartalmaz legalább egy oligoszacharidot, amely legalább 66% galaktózt tartalmaz monoszacharidegységként, és legalább egy oligoszacharidot, amely legalább 66% fruktózt tartalmaz monoszacharidegységként. Egy különösen elõnyös megvalósítási mód szerint a találmány szerinti készítmény tartalmaz galaktooligoszacharidot és a következõ oligoszacharidok bármelyikét: fruktooligoszacharid vagy inulin. A fruktooligoszacharidok serkentik a szulfomucin-termelést a distalis vastagbélben az emberiflóra-kapcsolt patkányokban [Kleessen és munkatársai, (03) Brit J. Nutr 89: 97 6] és a galaktooligoszacharidok serkentik a savas mucintermelést [Meslin és munkatársai, (1993) Brit. J. Nutr 69: 903 912]. A nyálkaréteg vastagságának a további javításához a teljes vastagbélben, a találmány szerinti készítményben az oligoszacharidoknak legalább tömeg%-ának a DP¹je 2 és közötti (például 2, 3, 4, és/vagy ) és legalább tömeg%-ának a DP¹je és közötti. Elõnyösen az oligoszacharidoknak legalább 0 tömeg%- ának, még elõnyösebben legalább 7 tömeg%-ának a DP¹je 2 és 9 közötti (például 2, 3, 4,, 6, 7, 8, és/vagy 9), mivel ezekrõl úgy gondoljuk, hogy a csípõbél (ileum) teljes hosszában és a vastagbél proximális és középsõ részein mûködnek, és mert a kívánt hatás eléréséhez a készítményhez hozzáadni szükséges oligoszacharidok tömegszázalékai csökkentettek. Elõnyösen a tömegarányok: a) (2 és közötti DP¹jû oligoszacharidok): (6, 7, 8 és/vagy 9 DP¹jû oligoszacharidok) >1; b) ( és közötti DP¹jû oligoszacharidok): (6, 7, 8 és/vagy 9 DP¹jû oligoszacharidok) >1; vagy mindkettõ nagyobb, mint 1. Elõnyösen mindkét tömegarány 2 feletti, még elõnyösebben feletti. A nyálkaréteg vastagságának és minõségének még további javításához a teljes vastagbél területén, elõnyösen a legalább kettõ különbözõ oligoszacharid mindegyike különbözõ lánchosszúságúként kerül hozzáadásra, elõnyösen a megfelelõ oligoszacharid teljes tömegének legalább tömeg%¹a minden egyes oligoszacharid esetében 2 és közötti DP¹jû (például 2, 3, 4, és/vagy ) és legalább tömeg%¹a és közötti DP¹jü. Elõnyösen az adott oligoszacharid össztömegének legalább 0 tömeg%-ának, elõnyösebben legalább 7 tömeg%-ának DP¹je 2 és közötti, mivel ezekrõl úgy véljük, hogy az ileum teljes hosszában és a vastagbél középsõ részein mûködnek. Savas oligoszacharidok A gát integritásának további javításához a találmány szerinti készítmény tartalmaz 2 és közötti DP¹jû savas oligoszacharidokat. A savas oligoszacharid olyan oligoszacharidot jelöl, amely legalább egy savas csoportot tartalmaz a következõk közül: N¹acetilneuraminsav, N¹glikoloilneuraminsav, szabad vagy észterezett karbonsav, kénsavcsoport vagy foszforsavcsoport. A savas oligoszacharid elõnyösen tartalmaz uronsavegységeket (például uronsavpolimer), még elõnyösebben galakturonsavegységeket. A savas oligoszacharid lehet homogén vagy heterogén szénhidrát. megfelelõ példák a pektin és/vagy alginát hidrolizátumok. Az intestinalis szakaszban az uronsavpolimerek uronsavmonomerekké hidrolizálódnak, amely serkenti az intestinalis acetáttermelést, amely serkenti az intestinalis nyálkakiválasztást (Barcelo és munkatársai, Gut 00; 46:218 224). Elõnyösen a savas oligoszacharidok az alábbi l¹es szerkezettel bírnak, amelyben a terminális hexóz (bal) 4
1 HU 007 6 T2 2 elõnyösen tartalmaz kettõs kötést. A terminális hexózegységen kívüli hexózegységek elõnyösen uronsavegységek, még elõnyösebben galakturonsavegységek. A karbonsavcsoportok ezeken az egységeken lehetnek szabadok vagy (részlegesen) észterezettek, és elõnyösen legalább %-ban metilezettek (lásd alább). l¹es szerkezet: Savas oligoszacharidpolimer ahol: R elõnyösen a következõk bármelyike: hidrogén, hidroxi- vagy savcsoport, elõnyösen hidroxi; és az R 2,R 3,R 4 és R -bõl álló csoport legalább egyike N¹acetilneuraminsavat, N¹glikoloilneuraminsavat, szabad vagy észterezett karbonsavat, kénsavcsoportot vagy foszforsavcsoport jelöl, és a többi R 2,R 3,R 4 vagy R jelentése hidroxi és/vagy hidrogén. Elõnyösen az R 2,R 3,R 4 vagy R -bõl álló csoport bármelyike N¹acetilneuraminsavat, N¹glikoloilneuraminsavat, szabad vagy észterezett karbonsavat, kénsavcsoportot vagy foszforsavcsoport jelöl, és a többi R 2,R 3,R 4 vagy R jelentése hidroxi és/vagy hidrogén. Még elõnyösebben az R 2,R 3,R 4 és R -bõl álló csoport egyike szabad vagy észterezett karbonsavat jelöl, és a többi R 2,R 3, R 4 vagy R jelentése hidroxi és/vagy hidrogén; és n egész szám és a hexózegységek számát jelöli (lásd még a polimerizációs fokot az alábbiakban), ami bármilyen hexózegység lehet. Megfelelõen n egy 1 és 000 közötti egész szám. Elõnyösen a hexózegység(ek) uronsavegységek. Legelõnyösebben R 1,R 2 és R 3 jelentése hidroxi, R 4 jelentése hidrogén, R jelentése karbonsav, n 1 és közötti egész szám, elõnyösen 1 és közötti, és a hexózegység galakturonsav. A találmány szerinti eljárásban alkalmazott elõnyös savas oligoszacharidok detektálását, mérését és analízisét ismertetik korábbi szabadalmi beadványok, amelyek tárgya a savas oligoszacharid, például WO 0/1378 számú nemzetközi közzétételi irat. A vastagbél teljes területén a nyálkaréteg vastagságának serkentéses javításához, a találmány szerinti készítmény elõnyösen legalább tömeg% 2 és közötti (például 2, 3, 4 és/vagy ) DP¹jû savas oligoszacharidot tartalmaz és legalább tömeg% és közötti DP¹jû savas oligoszacharidot tartalmaz, amely tömeg% az oligoszacharidok teljes tömegén alapszik. A találmány szerinti alkalmazott savas oligoszacharidokat elõnyösen pektinbõl, pektátból, alginátból, chondroitinbõl, hialuronsavakból, heparinból, heparánból, bakteriális szénhidrátokból, szialoglikánokból, fukodiánból, fukooligoszacharidokból vagy karragenánból állítjuk elõ, elõnyösen pektinbõl és/vagy alginátból. 1 2 3 4 0 Oligoszacharidtartalom Amennyiben etetésre kész folyadék formában van, akkor a találmány szerinti készítmény 0,1 0 gramm emészthetetlen oligoszacharidokat tartalmaz literenként, elõnyösebben 0, 0 grammot literenként, még elõnyösebben 1 2 grammot literenként. A túl magas oligoszacharidtartalom kellemetlen érzéseket válthat ki a jelentõs fermentáció miatt, míg a nagyon alacsony tartalom elégtelen nyálkaréteget eredményezhet. A legalább kettõ különbözõ oligoszacharid tömegaránya elõnyösen 1 és közötti, még elõnyösebben 1 és közötti. Ezen tömegarányok optimálisan serkentik a különbözõ típusú mucinok termelését, különbözõ helyeken a belekben. A találmány szerinti készítményhez az oligoszacharidot 0,1 tömeg%-nál nagyobb mennyiségben adjuk, elõnyösen 0,2 tömeg%-nál nagyobban, még elõnyösebben 0, tömeg%-nál nagyobban és még elõnyösebben 1 tömeg%-nál nagyobban, a készítmény teljes száraz tömegére vetítve. A készítmény oligoszacharidtartalma elõnyösen tömeg% alatti, elõnyösebben tömeg% alatti, még elõnyösebben tömeg% alatti. A találmány szerinti készítményhez nukleotidok és/vagy nukleozidok hozzáadása tovább javítja a bélnyálka gátfunkcióját, különösen, mivel gátolja és/vagy csökkenti a bakteriális transzlokáció elõfordulását és csökkenti a belek sérülését. Ennek megfelelõen a találmány szerinti készítmény tartalmaz továbbá 1 és 00 mg közötti mennyiségben nukleozidokat és/vagy nukleotidokat a száraz tápszer 0 grammjára vetítve, még elõnyösebben és 0 mg közötti mennyiségben. Alkalmazás A találmány szerinti készítményt elõnyösen alkalmazhatjuk emlõsökben, különösen emberekben a gát integritásának javítására szolgáló eljárásban. A találmány szerinti készítményt továbbá elõnyösen alkalmazhatjuk a csökkent gátintegritással asszociált betegségek kezelésére vagy megelõzésére szolgáló eljárásban, amely eljárás tartalmazza a találmány szerinti készítmény beadását emlõsnek. A találmány szerinti készítmény elõnyösen szájon át kerül beadásra. A betegeknek és csecsemõknek a találmány szerinti készítmény elõnyösen kombinálva van teljes táplálékkal, ideértve a fehérjét, szénhidrátot és zsírt. A találmány szerinti készítmény elõnyösen 0 és 2 év közötti csecsemõknek kerül beadásra. A készítmény beadható olyan pácienseknek, akik a gát integritásának sérülésében szenvednek és egészséges pácienseknek. A találmány szerinti készítményt elõnyösen koraszülött csecsemõ (olyan csecsemõ, aki 37 hét gesztációs idõ elõtt születik) táplálékszükségleteit adó eljárásban alkalmazhatjuk. A találmány szerinti készítményt elõnyösen alkalmazhatjuk továbbá intestinalis sérülés kezelésére és/vagy megelõzésére szolgáló eljárásban, melynek során a találmány szerinti készítményt az intestinalis sérülést kiváltható orvosi kezelést megelõzõen vagy azt követõen adjuk be. Ilyen orvosi kezelés lehet például a sebészet vagy az enterális gyógyszeres kezelés
1 HU 007 6 T2 2 (például antibiotikumos, analgéziás, NSAID, kemoterápiás vegyületek stb.). A találmány szerinti készítményt elõnyösen alkalmazhatjuk továbbá olyan betegségek kezelésére és/vagy megelõzésére, amelyekben az intestinalis gát sérülése határozza meg a betegség elõrehaladását, például krónikus gyulladásos megbetegedések, különösen a gyulladásos bélbetegség (IBD), irritábilis bél szindróma (IBS), coeliákia, pankreatitisz, hepatitisz, arthritis vagy cukorbetegség megelõzésére vagy kezelésére szolgáló eljárásban. Továbbá a találmány alkalmazható olyan páciensek táplálását adó eljárásokban, akik abdominális sebészeti beavatkozáson estek át vagy fognak átesni és olyan pácienseknek, akiknél a belek posztoperatív mûködési zavarait tapasztalják és/vagy rosszul táplált pácienseknek. A találmány egy további megvalósítási módja szerint a találmány szerinti készítményt olyan pácienseknek adjuk be, akik szerzett immunhiány szindrómában (AIDS) szenvednek és/vagy olyan pácienseknek, akik emberi immunhiány vírussal (HIV) fertõzöttek, például AIDS és/vagy HIV-fertõzés kezelésére alkalmas eljárásban. Az eljárás tartalmazza a találmány szerinti készítmény beadását, elõnyösen a következõ tápanyagok bármelyikével együtt: szénhidrát, zsír vagy fehérje. Továbbá a találmányt alkalmazhatjuk a gát integritásának csökkenése által okozott komplikációk megelõzésére vagy kezelésére, különösen a hasmenés, különösen a csecsemõhasmenés kezelésére és/vagy megelõzésére szolgáló eljárás során. A csecsemõhasmenés csökkent elõfordulási gyakorisága miatt a találmány szerinti készítmény elõnyösen alkalmazható a pelenka által okozott kiütések csökkentésére. A találmány szerinti készítmény beadása csökkenti a táplálék és mikrobiális antigének, különösen az élelmiszer-allergének átjutását az intestinalis lumenbõl a nyálkahártyába vagy a szisztémás keringésbe, és ennek megfelelõen elõnyösen alkalmazható allergia és/vagy allergiás reakció kezelésére vagy megelõzésére szolgáló eljárásban, különösen élelmiszer-allergia kezelésére vagy megelõzésére szolgáló eljárásban, például élelmiszeranyagok bevitele által kiváltott allergiás reakció. Azt is tapasztaltuk, hogy az EPA, DHA és/vagy ARA képesek az IL 4 hatását csökkenteni az intestinalis permeabilitáson. Ennek megfelelõen a találmány egy szempontja eljárás olyan betegségek kezelésére és/vagy megelõzésére, amelyekben az intestinalis IL 4 koncentráció megemelkedett (például allergiás betegségek), amely eljárás tartalmazza LC¹PUFA beadását, amely elõnyösen a következõk bármelyike: EPA, DHA vagy ARA, elõnyösen kombináltan a jelen kiválasztott oligoszacharidokkal. Ennek megfelelõen a találmány szerinti készítmény elõnyösen alkalmazható atópiás dermatitisz kezelésére szolgáló eljárásban. Mivel az újszülöttek gátfunkciója még nem fejlõdött ki teljesen, ezért a találmány szerinti készítmény elõnyösen adható fiatal csecsemõknek, azaz 0 és 6 hónap közötti korú csecsemõknek. A készítményt be lehet adni a csecsemõnek csecsemõtápszer formájában 1 2 3 4 0 emberi tej nélkül vagy emberi tejjel elõkeverten. Ennek megfelelõen a találmány tárgya továbbá olyan csecsemõtápszer, amely emberi tejet és a találmány szerinti készítményt tartalmazza. Emberi tejet és a találmány szerinti készítményt tartalmazó készítmények különösen megfelelõek koraszülött csecsemõk táplálására. A találmány szerinti készítmény elõnyösen csomagolt por vagy etetésre kész tápszer. Annak érdekében, hogy megelõzzük a termék pazarlását, az etetésre kész tápszer csomagolási mérete nem haladja meg az egy adagot, például elõnyösen nem haladja meg az 00 ml¹t; és a por alakú találmány szerinti készítmény csomagolása elõnyösen nem haladja meg a adagnyit. A por megfelelõ csomagolási mérete a 00 g¹os vagy ennél kisebb, elõnyösen az 00 g¹os vagy ennél kisebb. A találmány tárgyát képezik címkével ellátott csomagolt termékek, amelyek explicite vagy implicite utasítják a fogyasztót a termék alkalmazására a fenti vagy alábbi okoknak megfelelõen. Az ilyen címkék például hivatkozhatnak a találmány szerinti eljárásra, amely az élelmiszer allergének által kiváltott allergiás reakciók megelõzésére szolgál, olyan kifejezésekkel mint, csökkentett élelmiszer-érzékenység, az intestinalis tolerancia javítása javított tápláléktolerancia vagy hasonló kifejezések. Hasonló módon lehet hivatkozni jelen allergia kezelésére és/vagy megelõzésére szolgáló eljárásra a javított rezisztencia vagy csökkentett érzékenység kifejezésekkel ekvivalens terminológiával. Tápszerek Azt találtuk, hogy a találmány szerinti készítményt elõnyösen lehet alkalmazni élelmiszerekben, mint amilyen a csecsemõ élelmiszer és a klinikai élelmiszer. Az ilyen élelmiszer elõnyösen tartalmaz lipidet, fehérjét és szénhidrátot és elõnyösen folyadék formában kerül beadásra. A folyékony élelmiszer kifejezés a találmány szerinti értelemben száraz élelmiszert tartalmaz (például porokat), amelyekhez utasításokat mellékelünk arra vonatkozóan, hogy a száraz élelmiszer keveréket megfelelõ folyadékkal (például vízzel) kell elkeverni. Ennek megfelelõen a találmány tárgyát képezi továbbá táplálékkészítmény, amely tartalmaz és 0 en% közötti lipidet, és 0 en% közötti fehérjét, 1 és 90 en% közötti szénhidrátot és oligoszacharidok és LC¹PUFA¹k jelen kombinációját. Elõnyösen jelen táplálékkészítmény elõnyösen tartalmaz és en% közötti lipidet, 7, és en% közötti fehérjét, 2 és 7 en% közötti szénhidrátot (az en% az energia százalék rövidített formája, és az egyes összetevõknek a készítmény teljes kalorikus értékéhez való hozzájárulását képviseli). Elõnyösen növényi lipidek kombinációját és a következõk közül legalább egyet alkalmazunk: halolaj, omega¹3 növényi, alga- vagy baktériumolaj. A táplálékkészítményben alkalmazott fehérjék elõnyösen a következõk bármelyike: nem emberi állati fehérjék (mint amilyenek a tejfehérjék, húsfehérjék vagy tojásfehérjék), növényi fehérjék (mint amilyen a szójafehérje, búzafehérje, rizsfehérje vagy borsófehérje), sza- 6
1 HU 007 6 T2 2 bad aminosavak vagy ezek keverékei. Tehéntej-eredetû nitrogénforrás, különösen tehéntejfehérjék, mint amilyen a kazein és a savófehérjék különösen elõnyösek. A táplálék tápszerhez adható emészthetõ szénhidrátforrás. Ez elõnyösen a táplálékkészítmény energiájának körülbelül % körülbelül 80% közötti részét adja. Bármilyen megfelelõ szénhidrát (forrás) alkalmazható, például szacharóz, laktóz, glukóz, fruktóz, kukoricaszirup szárazanyag, vagy maltodextrinek vagy ezek keverékei. A találmány szerinti készítményt elõnyösen csecsemõtápszerként alkalmazzuk és elõnyösen 7, 12, energia% fehérjét, energia% szénhidrátot, és 3 0 energia% zsírt tartalmaz. Mivel a találmány szerinti készítmény megfelelõen alkalmazható az allergiás reakciók csökkentésére csecsemõkben, ezért a csecsemõtápszer fehérjéje elõnyösen a következõk bármelyike: hidrolizált tejfehérje (például hidrolizált kazein vagy hidrolizált savófehérje), növényi fehérje és/vagy aminosavak. Ezen fehérjék alkalmazása tovább csökkentette a csecsemõ allergiás reakcióit. A széklet rendszertelenségek (például kemény székletek, nem megfelelõ széklettérfogat, hasmenés) sok folyadék élelmiszert kapó csecsemõ és beteg alanyok esetében fontos problémák. Azt találtuk, hogy a székletproblémák csökkenthetõk jelen oligoszacharidok folyékony élelmiszerként történõ beadásával, amelyeknek az ozmolaritása 0 és 00 mosm/kg közötti, elõnyösebben 0 és 0 mosm/kg közötti. A fentiek fényében az is fontos, hogy a folyékony tápláléknak ne legyen túlzott kalorikus sûrûsége, azonban az alany táplálásához még elégséges kalóriát adjon. Ennek megfelelõen a folyékony élelmiszer kalorikus sûrûsége 0,1 és 2, kcal/ml közötti, még elõnyösebben 0, és 1, kcal/ml közötti a kalorikus sûrûsége, legelõnyösebben 0,6 és 0,8 kcal/ml közötti. Példák 1 2 3 4 0 1. példa: Az LC¹PUFA hatása a gátintegritásra Intestinalis T84¹es epithel sejtvonalak [American Type Culture Collection (ATTC), Manassas, Amerikai Egyesült Államok] egysejtrétegeit ( monolayer, MC) tenyésztettük Transwell (filter) szûrõkön (Corning, Costar BV, Hollandia) amely lehetõvé tette mind a nyálka, mind a szerológiai mintavételt és az emberi intestinalis epithelsejtek serkentését. A konfluencia elérését követõen két héttel az egysejtrétegeket inkubáltuk az üreges rekeszekben többszörösen telítetlen zsírsavakkal, ARAval (arachidonsav;,8,11,14-eikozatetraénsav), DHAval (cis¹4,7,,13,16,19-dokozahexaénsav), EPA-val (eikozapentaénsav) vagy kontrollpalmitinsavval (C 16: 0) (Palm) (Sigma, St. Louis, Amerikai Egyesült Államok). Az utóbbi eljárást azért választottuk, hogy utánozza a táplálékvegyületek in vivo beadási útvonalát. A sejteket inkubáltuk ARA-val, DHA-val, EPA-val, vagy palmitinsavval 0, 24, 48 és 72 óráig különbözõ koncentrációkban ( M és0 M). A kísérleteket az alap integritás értékelésére végeztük. Az epithelialis gát funkciót a transzepithelialis ellenállás (TER,.cm 2 ) megmérésével határoztuk meg, epithelialis volt-ohm mérõ készülékkel (EVOM; World Precision Instruments, Németország) és 4 kd FITC dextrán permeabilitással (paracelluláris permeabilitási jel, Sigma, Amerikai Egyesült Államok). Rezisztancia Az epithelium permeabilitást a 4 kda FITC-dextránra a következõ módon határoztuk meg. A dextrán fluxusokat megelõzõen a tápközeget felfrissítettük egy óráig fenolvörös nélküli tenyésztõközeggel, amit l (0 mg/ml törzs) 4 kda FITC-dextrán hozzáadása követett az üreges rekeszbe. perc inkubáció eltelte után 0 l mintát vettünk a szerológiai rekeszbõl és mértük a fluoreszcens jelet 48 nm¹es excitációs hullámhosszon nm¹es emisszión (FLUOstar- Galaxy, BMG Labtechnologies, Amerikai Egyesült Államok). A FITC-dextrán fluxusokat pmol FITC-dextrán/cm 2 /h¹ként számoltuk ki. A statisztikai elemzéseket ANOVA alkalmazásával végeztük (SPSS ¹es verzió). A zsírsavak (0 M) hatásának eredményeit a spontán gátintegritásra 72 órás inkubációt követõen adtuk meg az 1. táblázatban. Az 1. táblázat azt mutatja, hogy az ARA, EPA és DHA LC¹PUFA¹k csökkentik a molekuláris fluxust és javítják az epithelialis ellenállást. Ezzel szemben a kontrollkísérletek azt mutatják, hogy a palmitinsavnak ellentétes hatása van, azaz elrontja a gát integritását. Ezek az eredmények mutatják az EPA, DHA és ARA, és különösen az ARA elõnyös alkalmazását a találmány szerinti készítményben és a találmány szerinti eljárásban, azaz a gát integritásának javítására szolgáló eljárásban. Ezen eredmények továbbá alátámasztják a jelen zsírsav és emészthetetlen oligoszacharidkombináció szinergisztikus hatásait. Az 1. ábra különbözõ zsírsavaknak (palmitinsav, DHA, GLA, és AA) idõ- és dózisfüggõ ( M és 0 M) hatásait mutatja az alap gátintegritásra (TER). Az 1. ábra azt mutatja, hogy az AA, DHA és GLA LC¹PUFA¹k javítják az epithelialis gát integritását, ahogy ez a megnövekedett ellenállásból (TER) tükrözõdik. Ezek az eredmények jellemzik az EPA, DHA, GLA és ARA, különösen az ARA elõnyös alkalmazását a találmány szerinti készítményben és a találmány szerinti eljárásban, azaz a gát integritására szolgáló eljárásban. Ezek az eredmények továbbá alátámasztják a jelen zsírsav és emészthetetlen oligoszacharidkombináció szinergisztikus hatásait. 1. táblázat Összetevõ (LC-PUFA) Fluxus Ellenállás (TER) Kontroll 79 90 Palmitinsav 161 831 DHA 72 174 ARA 28 1816 EPA 6 1493 2. példa: Az LC¹PUFA hatása az IL 4 által kiváltott gátsérülésre Intestinalis T84¹es epithelsejtvonalak (ATTC, Amerikai Egyesült Államok) egysejtrétegeit ( monolayer, 7
1 HU 007 6 T2 2 MC) tenyésztettük Transwell filter (Corning, Costar BV, Hollandia) amely lehetõvé tette mind a nyálka, mind a szerológiai mintavételt és az emberi intestinalis epithelsejtek serkentését. A konfluencia elérését követõen két héttel az egysejtrétegeket inkubáltuk IL 4 (2 ng/ml, szerológiai kompartment, Sigma, Amerikai Egyesült Államok) jelenlétében ARA, DHA, EPA vagy kontroll palmitinsavval többszörösen telítetlen zsírsavakkal, vagy ezek nélkül ( M vagy 0 M, nyálka rekesz, Sigma, St. Louis, Amerikai Egyesült Államok). A sejteket 48 órát elõinkubáltuk ARA-val, DHA-val, EPA-val vagy palmitinsavval az IL¹4¹es inkubációt megelõzõen. A PUFA¹k és a palmitinsav együttes inkubációját az IL¹4-gyel további 48 óráig végeztük; miközben a tenyésztõközeget és az adalékokat minden 24 órában cseréltük. Az epithelialis gátfunkciót a transzepithelialis ellenállás és a permeabilitás megmérésével határoztuk meg az 1. példában ismertetett módon. Az ARA, DHA, EPA és palmitinsav (0 M) hatásának eredményeit az IL 4 által kiváltott gátsérülésre a 2. táblázatban adtuk meg. A 2. táblázat azt mutatja, hogy az ARA, DHA és EPA LC¹PUFA¹k gátolják az IL 4 által kiváltott megnövekedett fluxust. Ezzel szemben a palmitinsavnak káros hatása volt és csökkentette a gát sérülését a kontrollal összehasonlítva. Ezek az eredmények jellemzõek az ARA, DHA és EPA elõnyös alkalmazására klinikai vagy csecsemõtáplálék-kiszerelésekben az IL 4 által kiváltott gátsérülés megelõzésére vagy csökkentésére, például ahogy ez élelmiszervagy tehéntej-allergia esetén történik. Ezen eredmények további alátámasztást adnak a jelen zsírsav és emészthetetlen oligoszacharidkombináció szinergisztikus hatásainak. A 2. ábra adja meg az idõ és dózis ( M vagy 0 M) függõ védõ hatásait a különbözõ FA¹knak (palmitinsav, DHA, GLA, és AA) az IL 4 által kiváltott gátsérülésre (Fluxus). A 2. ábra azt mutatja, hogy az ARA, DHA és GLA védenek az IL 4 által kiváltott gátsérüléssel szemben, ahogy ez a lecsökkent 4 kd dextrán fluxusból tükrözõdik. Ezek az eredmények jellemzõek az ARA, DHA és GLA elõnyös alkalmazására klinikai és csecsemõtáplálék-kiszerelésekben az IL 4 által kiváltott gátsérülés megelõzésére vagy csökkentésére, például ahogy ez élelmiszer- vagy tehéntej-allergia esetén történik. Ezen eredmények további alátámasztást adnak a jelen zsírsav és emészthetetlen oligoszacharidkombináció szinergisztikus hatásainak. 2. táblázat Összetevõ (LC-PUFA) IL 4 Fluxus IL 4 TER Kontroll 82 374 Palmitinsav 777 321 DHA 271 47 ARA 218 636 EPA 228 39 1 2 3 4 0 3. példa: Oligoszacharidok hatása az acetáttermelésre Mikroorganizmusokat vettünk tápszerrel táplált csecsemõk friss székletébõl. Friss székletanyagot gyûjtöttünk 1 4 hónapos korú csecsemõktõl és két órán belül tartósítóközegbe tettük. Szubsztrátként vagy prebiotikumot (TOS; TOS/inulin (HP) 9/1 (tömeg/tömeg) arányú keverék; inulin; oligofruktóz(os)/inulin 1/1 (tömeg/tömeg) arányú keverékben), vagy semmit sem (üres) alkalmaztunk. A transzgalaktooligoszacharidokat (TOS) a Vivinal GOS, Borculo Domo Ingredients, Zwolle, Hollandia cégtõl szereztük be és emészthetetlen oligoszacharidként a következõket tartalmazta: 33 tömeg% diszacharidok, 39 tömeg% triszacharidok, 18 tömeg% tetraszacharidok, 7 tömeg% pentaszacharidok és 3 tömeg% hexa¹, hepta- és oktaszacharidok. Az inulin (HP) Orafti active food ingredients, Tienen, Belgium, például RaftilineHP, 23¹as átlagos DP¹vel. Tápközeg: McBain & MacFarlane tápközeg: pufferezett peptonvíz 3,0 g/l, élesztõkivonat 2, g/l, mucin [kefeszegély ( brush border )] 0,8 g/l, tripton 3,0 g/l, L¹cisztein-HCl 0,4 g/l, epesavas sók 0,0 g/l, K 2 HPO 4.3H 2 O 2,6 g/l, NaHCO 3 0,2 g/l, NaCl 4, g/l, MgSO 4.7H 2 O 0, g/l, CaCl 2 0,228 g/l, FeSO 4.7H 2 O 0,00 g/l. 00 ml¹es Scott-üvegeket töltöttünk meg a tápközeggel és 1 percig sterilizáltuk 121 C¹on. Pufferezett tápközeg: K 2 HPO 4.3H 2 O 2,6 g/l, NaHCO 3 0,2 g/l, NaCl 4, g/l, MgSO 4.7H 2 O 0, g/l, CaCl 2 0,228 g/l, FeSO 4.7H 2 O 0,00 g/l. A ph=6,3±0,1¹re állítva K 2 HPO 4 -gyel vagy NaHCO 3 -mal. 00 ml¹es Scott-üvegeket töltöttünk meg a tápközeggel és 1 percig sterilizáltuk 121 C¹on. Tartósító tápközeg: Pufferezett pepton,0 g/l, L¹cisztein-HCl 0, g/l, nátrium-tioglikolát 0, g/l, resazurin tabletta literenként 1, a ph¹t 6,7±0,1¹re állítottuk 1 M NaOH-val vagy HCl-lel. Mikrohullámban fõzve. Szérumüvegeket töltöttünk meg 2 ml tápközeggel és 1 percig sterilizáltuk 121 C¹on. Friss székletmintákat kevertünk össze tartósító tápközeggel és több óráig tároltuk 4 C¹on. A székletek tartósított oldatát 13 000 rpm¹en centrifugáltuk 1 percig, a felülúszót eltávolítottuk és McBain & Mac Farlane közeggel összekevert székletet kevertünk hozzá 1: tömegarányban. Ebbõl a székletoldatból 3 ml¹t kevertünk össze 8 mg glukózzal vagy prebiotikummal vagy semmivel (üres) egy üvegben és teljesen elkevertük. t=0 mintát vettünk (0, ml). Az eredményül kapott 2, ml szuszpenziót dialíziscsõbe tettük egy ml¹es üvegbe, amely ml pufferezett tápközeget tartalmazott. Az üveget jól lezártuk és 37 C¹on inkubáltuk. A dialíziscsövekbõl (0,2 ml) vagy a dialízispufferbõl (1,0 ml) mintákat vettünk hipodermiás fecskendõvel 3, 24 és 48 órát követõen, és azonnal jégre tettük a fermentáció megállításához. A kísérletet a következõ minták alkalmazásával végeztük: 1. 8 mg TOS 2. 8 mg inulin 3. 8 mg TOS/inulin 9/1 (tömeg/tömeg) arányban és 4. 8 mg OS/inulin 1/1 (tömeg/tömeg) arányban. SCFA¹t (acetát, propionát, butirát) határoztunk meg Varian 3800 gázkromatográf (GC) (Varian Inc., Walnut 8
1 HU 007 6 T2 2 Creek, Amerikai Egyesült Államok) alkalmazásával, amely lángionizációs detektorral volt ellátva. A mintákból 0, l¹t injektáltunk 80 C¹on az oszlopba (Stabilwax, 1 0,3 mm, 1,00 m filmvastagság, Restek Co., Amerikai Egyesült Államok) hélium hordozógáz alkalmazása mellett [,7 KPa (3,0 psi)]. A minta injektálását követõen a kemencét 1 C¹ra hevítettük 16 C/perc sebességgel, amelyet 2 C¹ra történõ melegítés követett C/perc sebességgel és végül 2 C¹on tartottuk 1, percig. Az injektor és a detektor hõmérséklete 0 C volt. 2¹etil-butirsavat alkalmaztunk standardként. A 3. ábra mutatja az abszolút (3A. ábra) és a relatív SCFA profilt (3B. ábra), amely a különbözõ oligoszacharidok fermentációja révén keletkezett. A 3A. ábra azt mutatja, hogy két különbözõ oligoszacharid keveréke (TOS/inulin), amelyben a két különbözõ oligoszacharid homológiája a monoszacharidegységekben 90 alatti, és a különbözõ lánchosszúság azt eredményezi, hogy az SCFA (különösen az acetát) mennyisége egy gramm rostra vetítve szignifikánsan és szinergisztikusan nagyobb, mint az egyedi komponenseké. A 3B. ábra azt mutatja, hogy a TOS/inulin kombináció hozzáadása az elõnyös acetát nagyobb arányának kedvezett (B). Az in vivo acetáttermelés a kehelysejtek általi javított nyálkatermelést és intestinalis nyálkaréteg vastagodást vált ki (lásd 4. példa). Ezen eredmények jellemzik a találmány szerinti készítmény elõnyös alkalmazását. 1 2 3 4 0 4. példa: Az SCFA hatásai a nyálkatermelésre Intestinalis T84¹es epithelsejtek (ATTC, Amerikai Egyesült Államok) egysejtrétegeit tenyésztettük 24 vagy 96 lyukú szövettenyészet lemezeken (Corning B. V.). A T84¹et inkubáltuk a rövid láncú zsírsavak acetátjával, propionátjával és butirátjával (SCFA, Merck, Amerikai Egyesült Államok) 24 órát 0,02 4,0 mm koncentrációtartományban. Felülúszót és/vagy sejteket gyûjtöttünk és meghatároztuk a MUC¹2 (mucin) termelést. Pontblottolásos technikát alkalmaztunk a sejttenyészetekben a MUC¹2 expresszió meghatározásához, mivel a mucinok különösen nagyméretû glikoproteinek (00 kda felettiek), amely nehézzé teszi a kezelésüket western blottolásos technikákban. Az eljárást validáltuk preimmunszérum (T84-gyel festve negatív), CCD-18¹Co (ATTC, Amerikai Egyesült Államok) negatív kontrollsejtek és marha-szérumalbumin (BSA) alkalmazásával. Sejtmintákat gyûjtöttünk Laemmliben (fehérje izolációs puffer) és fehérjemeghatározást végeztünk mikrofehérje vizsgálat (Biorad, Amerikai Egyesült Államok) alkalmazásával, a gyártó protokollja szerint. Mintákat (0,3 0,7 1,0 g/2 l) pöttyöztünk nitrocellulóz membránokra (Schleicher & Schuell, Németország). A membránokat blokkoltuk TBST/% Protivar-ban (Nutricia, Hollandia) melyet 1 órás inkubáció követett anti-muc¹2 antitesttel (dr. Einerhand kedves adománya, Erasmus University, Rotterdam, Hollandia). A mosást követõen a blottokat kecske nyúl elleni-hrp-vel inkubáltuk (Santacruz Biotechnology, Amerikai Egyesült Államok) és a szubsztrát detektáláshoz ECL¹t (Roche Diagnostics, Hollandia) alkalmaztunk. Denzitometriát végeztünk Lumi-Imager (Boehringer Mannheim B. V., Hollandia) alkalmazásával és a jelet fényegységekben fejeztük ki (BLU). A BLU-kat kifejeztük relatíve a kontroll inkubációkhoz is (%BLU). Az SCFA-nak a MUC¹2 expresszióra kifejtett serkentõ hatásának összehasonlításához az alap MUC¹2 expressziós szinteket levontuk. A 4. ábra mutatja az SCFA (acetát, propionát, butirát) különbözõ hatásait a MUC¹2 expresszióra intestinalis epithelialis sejtekben (MC T84) és epithelialis-mesenchymalis közös sejttenyészetekben (CC T84). A 4. ábra azt is mutatja, hogy az acetát hatásosabb a MUC¹2 serkentésre (nyálkatermelés)a propionáttal és a butiráttal összehasonlítva. Ennek megfelelõen oligoszacharidok jelen kombinációja [amelyrõl bemutattuk, hogy növeli az acetáttermelést (lásd 3. példa)] különösen alkalmas a nyálkatermelés serkentésére és elõnyösen alkalmazható a gát integritásának javítására szolgáló eljárásban.. példa: Csecsemõtejtápszer I Összetevõk (egy literben), energia 672 Kcal; fehérje 1 g; tejsavó: kazeinarány : ; zsír 36 g; szénhidrát 72 g; A¹vitamin 70 RE; kevert természetes karotinoidok 0 IU; D¹vitamin,6 mcg; F¹vitamin 7,4 mg; K¹vitamin 67,0 mcg; B1¹vitamin (thiamin) 00 mcg; B 2 ¹vitamin (riboflavin) 0 mcg; B 6 ¹vitamin (piridoxin) 0 mcg; B 12 -vitamin (cianokobalamin) 2,0 mcg; niacin 9,0 mcg; folsav 80 mcg; pantoténsav 00 mcg; biotin 90 mcg; C¹vitamin (aszkorbinsav) 90 mg; kolin 0 mg; inozitol 33 mg; kalcium 4 mg; foszfor 333 mg; magnézium 64 mg; vas 8,0 mg; cink 6,0 mg; mangán 0 mcg; réz mcg; jód 0 mcg; nátrium 1 mg; kálium mg; klorid 433 mg és szelén 14 mcg; amelyben a zsírtartalom tartalmaz 3 gramm halolajat és 3 gramm %¹os arachidonsav-olajat (DSM Food Specialties, Delft, Hollandia); tartalmaz továbbá 4 gramm transzgalaktooligoszacharidot Elix or (Borculo Domo Ingredients, Hollandia) és 4 gramm Raftiline ¹et (Orafti Active Food Ingredients, Belgium). SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Csecsemõtápszer-készítmény, amely tartalmaz 7, 12, energia% fehérjét; energia% szénhidrátokat; és 3 0 energia% zsírt, ahol a fehérje hidrolizált tejfehérje, növényi fehérje és aminosavak alkotta csoportból választott fehérjerészt tartalmaz, valamint a) eikozapentaénsavat (EPA), dokozahexaénsavat (DHA) és arachidonsavat (ARA), ahol a és 22 szénatomos hosszú láncú, többszörösen telítetlen zsírsavak aránya nem haladja meg a teljes zsírtartalom 1 tömeg%¹át; és b) legalább két különbözõ oligoszacharidot (OL1 és OL2), ahol a két különbözõ oligoszacharid homológiája monoszacharidegységekben kifejezve 90% alatti; és 9
1 HU 007 6 T2 2 c) 1 00 mg nukleozidot és/vagy nukleotidot 0 g tápszer-szárazanyagra vetítve. 2. Az 1. igénypont szerinti készítmény, ahol a fehérje hidrolizált tejfehérje. 3. A 2. igénypont szerinti készítmény, ahol a fehérje hidrolizált kazein és/vagy hidrolizált savófehérje. 4. Csecsemõtápszer-készítmény, amely tartalmaz 7, 12, energia% fehérjét; energia% szénhidrátokat; és 3 0 energia% zsírt, ahol a fehérje aminosavak és/vagy növényi fehérje, és a) eikozapentaénsavat (EPA), dokozahexaénsavat (DHA) és arachidonsavat (ARA), ahol a és 22 szénatomos hosszú láncú többszörösen telítetlen zsírsavak aránya nem haladja meg a teljes zsírtartalom 1 tömeg%¹át; és b) legalább két különbözõ oligoszacharidot (OL1 és OL2), ahol a két különbözõ oligoszacharid homológiája monoszacharidegységekben kifejezve 90% alatti.. Az 1 4. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amely fruktooligoszacharidok, inulin és ezek keverékei közül választott galaktooligoszacharidot és fruktánt tartalmaz. 1 6. Az 1. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, ahol az oligoszacharid legalább tömeg%¹a 2 polimerizációs fokú (DP) és legalább tömeg%- ának polimerizációs foka. 7. Az 1 6. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amely tartalmaz továbbá savas oligoszacharidot, elõnyösen 2 polimerizációs fokú uronsavpolimert. 8. Az 1 7. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amely készítmény kalóriatartalma 0,6 0,8 kcal/ml; az ozmolaritása 0 00 mosm/kg; és a viszkozitása 0 mpa s alatti. 9. Az 1 8. igénypontok bármelyike szerinti készítmény gyógyszerként történõ alkalmazásra.. Az 1 8. igénypontok bármelyike szerinti készítmény alkalmazása 0 és 2 év közötti korú csecsemõnek való beadásra szolgáló készítmény elõállítására. 11. Az 1 8. igénypontok bármelyike szerinti készítmény alkalmazása allergia kezelésére vagy megelõzésére, különösen ételallergia kezelésére vagy megelõzésére, szolgáló eljárásban való alkalmazásra szolgáló gyógyszer elõállítására, amely eljárás tartalmazza az 1 8. igénypontok bármelyike szerinti készítmény beadását emlõsnek.
HU 007 6 T2 Int. Cl.: A23L 1/29 11
HU 007 6 T2 Int. Cl.: A23L 1/29 12
HU 007 6 T2 Int. Cl.: A23L 1/29 13
HU 007 6 T2 Int. Cl.: A23L 1/29 Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest