Mi történhet, ha egy mintát fénnyel világítunk meg? Optikai spektroszkópiai módszerek megvilágító fény (elnyelt fény) minta átjutott fény Abszorpció UV-VIS, IR Smeller László kibocsátott fény Lumineszcencia (Fluoreszcencia és Foszforeszcencia) szórt fény Raman és Rayleigh szórás Abszorpciós és emissziós spektroszkópia Az átjutott vagy kibocsátott fény analizálása a hullámhossz függvényében. Információ: atomok, molekulák azonosítása, molekuláris szintű szerkezetváltozások (konformációváltozások) detektálása, koncentráció meghatározás Miért nyel el ill. bocsát ki fényt egy atom v. molekula? Energiaátmenet: ld. Jablonski diagram Gerjesztett elektron- és vibrációs állapot* Gerjesztett elektronállapot Vibrációsan gerjesztett áll.* Alapállapot S S 0 E *csak molekuláknál!
E Miért nyel el ill. bocsát ki fényt egy atom v. molekula? S S 0 UV-VIS IR abszorpció Raman Fluoreszcencia Foszforeszcencia T ΔEhfhc/λ Abszorpciós spektroszkópia (UV-VIS) Ismétlésül: abszorpciós tv: JJ 0 e -μx ahol μ(anyag,c,λ) Lambert-Beer törvény: J A lg 0 ε ( λ) cx spektrum: A(λ) J mérés: spektrofotométer (felépítése ld. gyakorlat) referencia oldat (J 0 ) információ: azonosítás, koncentráció. Infravörös spektroszkópia Infravörös fény: λ800 nm - mm közép infra tartomány:,5-50 μm abszorpciós spektroszkópia az elnyelt infravörös sugárzás molekularezgéseket kelt érzékeny a molekulaszerkezetre speciális detektálás: FT spektrométer Molekularezgések Az elektronok könnyűek, gyorsan követik az atommag mozgását, ezért az atommagok rezgéseit az elektronok nem befolyásolják. A klasszikus fizikai leírásban az atommagok közti kötést, egy rugóval vesszük figyelembe.
Molekularezgések: kétatomos molekula m a középiskolából ismert: f π m m D m l l l l D D F / D F / D Δl Δl l l F DΔl l + l l l l + m m + m + m m m + m D tehát:, amit az m D f π D m egyenletbe helyettesítve a rezgési frekvencia: D( m + m) f π mm az m mm mennyiséget redukált redukált m + m tömegnek is nevezik, ezzel a frekvencia: f π D m redukált A hullámhossz: c mredukált λ πc f D Az infravörös spektroszkópiában a λ reciprokát, a hullámszámot (ν) használják: ν: hány hullám fér D el egységnyi ν hosszúságon? [cm - ] λ πc m redukált Példa: CO A mért rezgési hullámszám: ν 43 cm - λ4,67μm f 6,43 0 3 Hz m C 0-6 kg, m O,7 0-6 kg D875 N/m Ha ν ismert, D számolható ha D ismert, ν számolható
Klasszikus fizikai rezgések és energianívók kapcsolata Klasszikus kép Energianívók A rezgési frekvencia függése a tömegtől és a kötéserősségtől Tömeg: Kötéserősség: S Infravörös rezgési frekvenciák (cm - ) B-H 400 C-H 3000 N-H 3400 O-H 3600 F-H 4000 C-N: 00 cm -, CN: 660 cm -, C N: 0 cm -. f π D m redukált S 0 ΔE Al-H 750 Si-H 50 Ge-H 070 P-H 350 As-H 50 S-H 570 Se-H 300 Cl-H 890 Br-H 650 rezonancia az f frekvenciájú fénnyel u.a.!!! ΔEhf Víz (O-H): 3600 > nehézvíz: 600 cm - Sokatomos molekulák rezgései N atomos molekula: 3N szabadsági fok, 3-3 a teljes molekula transzlációja ill. rotációja 3N-6 rezgési szabadsági fok (lineáris molekuláknál csak 3N-5) normálrezgések Normálrezgések Minden atom ugyanazzal a frekvenciával, de különböző amplitúdóval és irányban rezeg. Pl. víz: antiszimmetrikus
A víz normálrezgései Néhány tipikus rezgési frekvencia Nem rezgés, hanem gátolt forgás Példa: Formaldehid http://www.chemistry.msu.edu/faculty/reusch/virttxtjml/spectrpy/infrared/infrared.htm
Flavin Benzol Makromolekulák rezgései Globális rezgések (bonyolultak) Lokalizált rezgések, pl: CH rezgések a lipidekben amid rezgések a fehérjékben (acetamid rezgések)
Lipidek Alkalmazások fehérjedenaturáció lipid fázisátalakulás Symmetric Stretch Asymmetric Stretch Twisting Wagging Scissoring Rocking Types of Vibrational Modes. Figure from Wikipedia Meersman és mtsai. Biophys J. Gyógyszerészeti alkalmazások Gyógyszerészeti alkalmazás: molekula azonosítás szintézis: közti és végtermék azonosítás szerkezet bizonyítás metabolit kimutatás gyógyszerellenőrzés (tisztaság vizsgálat) C 4 H 8 O Megj.: Lambert-Beer tv. itt is igaz, koncentráció meghatározás is lehetséges. http://www.chemistry.msu.edu/faculty/reusch/virttxtjml/spectrpy/infrared/infrared.htm
A spektrum mérése: Fourier transzformációs spektrométer (FTIR) fényforrás FT tk 6.7 ábra tk 6.8 ábra Speciális IR módszerek:. IR Mikroszkópia A komponensek térbeli eloszlása S. Wartewiga, R. H.H. Neubert, Advanced Drug Delivery Reviews 57 (005) 44 70
Speciális IR módszerek:. ATR technika (Attenuated Totalreflexion) minta ATR technika Nagyon egyszerű minta-előkészítés minta ATR Kristály Lumineszcencia spektroszkópia Milyen molekulák fluoreszkálnak? E S T Aminosavak (triptofán, tirozin, fenilalanin) Fluoreszcens festékek GFP S 0 UV-VIS IR abszorpció Raman Fluoreszcencia Foszforeszcencia
Mérhető mennyiségek Aequorea victoria a gerjesztő fény hullámhossza az emittált fény hullámhossza (fluor., foszf) az emittált fény időbeli eloszlása az emittált fény polarizációja az emittált fény intenzitása A lumineszcens spektrométer felépítése gerjesztés Gerjesztési, és emissziós spektrumok E minta fényforrás gerjesztési monokromátor S T emissziós monokromátor detektor (pl fotoelektronsokszorozó) emisszió S 0 tk. 6.6 ábra kijelző (szgép) tk 6.5. ábra Stokes eltolódás Fluoreszcencia Foszforeszcencia
S S 0 E A fluoreszcencia kvantumhatásfok (Q) k nr k f T Kvantumhatásfok Q emittált fotonok száma elnyelt fotonok száma Q f k f k f + k k f fluoreszcens átmenet valószínűsége k nr nem sugárzásos átm. vsz. nr festékek, fl. jelzők Q S S 0 A gerjesztett állapot élettartama E Fluoreszcencia Fluoreszcencia N gerjesztett molekulából Δt idő alatt ΔN(k f +k nr )NΔt gerjesztődik le. Differenciálegyenlet: dn k k dt ( + f nr Megoldása: N τ ) N ( kf + knr ) t N0e N0 k + k f nr e t τ a gerjesztett állapot élettartama A fluoreszcencia intenzitás lecsengése Az emittált fotonok száma arányos ΔN-el, tehát N-el is, azaz a fotonszám is exponenciálisan csökken, τ időállandóval. Mérése: impulzusszerű megvilágítás (villanólámpa, v. impulzuslézer), fotonszámlálás az idő függvényében. Megj. Kvantumhatásfok és élettartam a foszforeszcencia esetén is hasonlóan definiálható ill. mérhető. Példa τ fluoreszcencia ns τ foszforeszcencia μs...s
Fluoreszcencia polarizáció Fényszórás polarizált fénnyel világítjuk meg a mintát mérjük, h. az emittált fény mennyire polarizált Rayleigh λ szórt λ megvil Raman szórás: λ szórt λ megvil f szórt f megvil E foton,szórt E foton,megvil Raman λ szórt λ megvil E S Chandrasekhra Venkata Raman elfordulhat a gerjesztett állapot élettartama alatt dinamikai információ hova lett az energia? Molekularezgést kelt (ld. IR) gyenge intenzitású S 0 tk 6.8 ábra IR Raman Raman spektrométer Raman Spektrometer Minta Filter Detektor Monokromator
Raman-szórás, Raman spektroszkópia A vibrációs állapotok jellemzőek a molekulákra Raman Spektroszkopia Tabletta hatóanyagtartalmának mérése http://www.igb.fraunhofer.de/de/kompetenzen/grenzflaechentechnik/oberflaechenanalytik/ausstattung/konfokale -mikroskopie-spektroskopie/raman-spektroskopie-tablette.html Hordozható Raman spektrométerek anyagok azonosítására Rayleigh szórás ha a részecske mérete: a << λ a szórt intenzitás: 6 a Jszórt ~ J 0N 4 λ információ: méret, mennyiség (pl. kolloidok) Kék égbolt
A Rayleigh szórás mérése ha J szórt <<J 0 J szórt -at mérjük (Nefelometria) ha J szórt J 0 Mie szórás Ha λ a a szórás hullámhossz-független. Részecskeméret Szürke égbolt J -t mérjük (turbidimetria) Technikailag ua. mint az abszorpciós spektroszkópia, csak most a J a szórás miatt kisebb, mint J 0 Rayleigh szórás Mie szórás!