A mikroszkópok felépítése és használata A mikroszkóp összetett optikai nagyító készülék, mely kicsiny objektumok láthatóvá tételére alkalmas, mint neve is mutatja; görögül mikrosz = kicsi, szkopeo = nézek. A mikroszkóp alapvetően két nagyítóból áll, a tárgy felé eső objektívből, és a vizsgáló szeme felé eső okulárból. A tárgy az objektív egyszeres és kétszeres fókusza között helyezkedik el (2F 1 >t>f 1 ), róla az objektív fordított állású, nagyított valódi képet hoz létre a kétszeres fókusztávolságán kívül (2F 1 <k). Az okulár elhelyezése az objektívhez képest olyan, hogy ez az elsődleges valódi kép az okulár fókuszán belül képződik. Az okulárba nézve az objektív által felnagyított, valódi kép okulár által tovább nagyított, egyenes állású látszólagos képét látjuk, mely a tárgyhoz képest fordított állású. Amennyiben a mikroszkóp által alkotott képet fényképezni kívánjuk akár hagyományos, akár digitális kamerával, az objektív által alkotott valódi képnek a fényérzékeny anyag (film, vagy chipre) síkjában kell keletkeznie. F 1 2F 1 F 2 2F 1 A mikroszkópok szerkezeti elemeit két csoportba oszthatjuk: (1) a megvilágítást és nagyítást szolgáló optikai berendezés és (2) a mechanikai berendezés, mely az előbbiek tartására és mozgatására szolgál. A hagyományos fénymikroszkóp felépítését lásd az alábbi ábrán. Fő optikai részei a kondenzor, az objektív és az okulár. Ehhez tartozhat még a két szemmel való megfigyelést elősegítendő a binokuláris tubus, mely az objektív által alkotott képet két okulár lencsére vetíti prizma segítségével. okulár objektív kondenzor lencse kondenzor rekesz revolver tárgyasztal kondenzor magasság állító megvilágítás er sség lámpa rekesz
Nagyítás, feloldóképesség, észlelhetőség A mikroszkóp nagyítását az alkalmazott optikai elemek nagyításának szorzata adja. Ezek a következők: objektív (tipikusan 10x és 100x között), okulár (tipikusan 5x és 20x között), valamint egyes mikroszkópokban a binokuláris tubusban található prizma (általában 1,5x). Az egyes optikai elemek nagyítása a kép- és tárgytávolság hányadosa. A feloldást, vagyis azt a legkisebb szakaszt, amelynek végpontjaiban elhelyezkedő két pont még különálló pontként jelenik meg a képben, elsősorban az objektív határozza meg. Amennyiben a pontok önálló fényforrásként viselkednek, ez az érték d=0.61λ/na, ahol NA=nsinφ az optikai elem ún. numerikus apertúrája, n az objektív és a minta közötti közeg törésmutatója, φ pedig az objektív félnyílásszöge. A feloldóképesség helyes logika szerint a legkisebb szeparálható távolság reciproka, D=1/d, azonban a d távolságot is gyakran (és helytelenül) nevezik feloldóképességnek. Amennyiben a tárgyat külső fényforrás világítja meg, a megvilágító optika numerikus apertúrája szintén behatárolja a feloldóképességet. Az Abbe féle képlet szerint: d=λ/(na objektív +NA kondenzor ). Eszerint 538 nm-es hullámhosszú zöld fényt alkalmazva NA=1,25 objektívvel és NA=0,9 kondenzorral a feloldás ~250 nm lehet. A gyakorlatban szokták a d=½λ/na objektív képletet is használni, feltételezve, hogy az objektív és a kondenzor numerikus apertúrája közel egyenlő. A feloldóképesség határt szab a nagyítás kihasználható mértékének is. Ez egy példán keresztül válik könnyen érthetővé: Alkalmazzunk 1000x-es nagyítást (pl. 100x objektív, 10x okulár). Ez a legkisebb feloldható távolságot (pl. 250 nm) 0,25 mm-re nagyítja. Szemünkkel a tisztánlátás távolságában keletkezett képben (a szem, mint optikai rendszer feloldóképességéből adódóan) milliméterenként kb. 10 pontot tudunk megkülönböztetni. Így a 0,25 mm-es szakasszal elválasztott két képpontot jó eséllyel két pontnak látjuk, hiszen a szakaszon belül is meg tudunk különböztetni legalább két különálló pontot. Ha a nagyítást fokozzuk, pl. 20x okulár, 1,5x prizma, akkor az objektív NA-ja által meghatározott 250 nm-es távolságot 0,75 mm-re nagyítjuk. Ez felesleges lenne, hiszen ebben az esetben is csak a 0,75 mm-es szakasz két végén láthatunk csak egy-egy pontot, míg ilyen nagy nagyítás mellet a szemünkkel már legalább 7 különálló pontot tudnánk a szakaszon megkülönböztetni. Általában követhetjük azt a szabályt, hogy az objektív NA-jának 1000-szeresét meghaladó nagyítást alkalmazni felesleges. A leírtakból adódóan a mikroszkópok fejlesztésének egyik lényeges célkitűzése a feloldás javítása. Az Abbe képletből adódóan ez több úton is elérhető. Egyrészt a hullámhossz csökkentésével, pl. UV mikroszkóp, ill. extrém példaként az elektronmikroszkóp. Mászrészt a numerikus apertúra növelésével is javíthatjuk a feloldást. Ennek egyszerű módja a φ félnyílásszög növelése pl. jobb objektív alkalmazásával, melynek nagyobb a frontlencse átmérője, kisebb munkatávolsága, vagy több (2, esetleg 3) objektív egyidejű használatával. A másik lehetőség a törésmutató növelése, pl. immerziós olaj bejuttatása az objektív és a tárgy közé, melynek törésmutatója ~1,55, szemben a levegő ~1,0 értékével. Az immerziós olaj használatára alkalmas objektíveket körbefutó fekete csík, vagy HI betűjelzés alapján ismerhetjük fel. Az ilyen objektívek immerziós olaj nélkül nem adnak jó minőségű képet (és természetesen a rajtuk feltüntetett NA érték helyett is csak annak kb. 2/3-ával számolhatunk). A feloldóképesség növelése érdekében az immerziós olajat a kondezor és a tárgy közé is bejuttathatjuk, ilyenkor gyakran nagy NA-jú immerziós objektívet alkalmazunk kondenzorként. Nem szabad a feloldást, ill. feloldóképességet az észlelhetőséggel összetéveszteni. Az utóbbi nem két pont elkülöníthetőségére vonatkozik, hanem arra, hogy egy pontnak önállóan, más pontoktól távol milyen nagynak kell lennie, és milyen sötétnek (vagy fényesnek) a környezetéhez képest (a kontraszt fontosabb, mint az abszolút fényesség!), ahhoz, hogy észlelhessük. Az észlelés nem jelenti azt, hogy tárgy alakját, nagyságát megítélhetjük. 2
Lencsehibák A mikroszkóp által alkotott képek minőségét nem csak a felbontóképesség, hanem az alkalmazott optikai elemek hibái is befolyásolják. A lencsehibákat részletesebben a Biofizika tankönyv tárgyalja. Itt csak a főtengelyhez közeli pontok leképezésénél fellépő hibákra, és az azokkal kapcsolatos néhány praktikus szempontra térünk ki. 1.A gömbi eltérés, más néven szférikus aberráció abból ered, hogy a gyűjtőlencse szélén áthaladó fénysugarak nagyobb mértékben törnek meg, mint az optikai tengely mentén haladók. Emiatt a tengelyre eső pont képe nem éles, hanem a széle felé elmosódik. Másképpen fogalmazva, a lencsének nem gyújtopontja, hanem gyújtófelülete keletkezik. Korrekciója aszférikus (több lencséből álló) objektívekkel, vagy a szélső sugarak blendével történő kirekesztésével valósítható meg. 2. A képdomborodás (képmezőgörbület) szintén a gömbi eltéréshez kapcsolódó hiba, mely a főtengelyhez közeli, de rá nem eső, nagy nyílású sugárnyalábbal leképezett pontokat érinti. Miatta a látótérnek vagy a közepén, vagy a szélén éles a kép, de egyszerre az egész látóteret nem lehet élesre állítani. Az olyan objektívek, melyek mentesek ettől a hibától, ún. aplanát lencserendszereket tartlamaznak, nevükben a plan- előtag szerepel. 3. A színi eltérés, vagy kromatikus aberráció oka, hogy a lencse fénytörése hullámhossz-függő, a rövidebb hullámhosszakra nézve rövidebb a fókusztávolság. Ez az eltérés úgy korrigálható, ha különböző törésmutatójú üvegekből készült lencséket egymással megfelelően kombinálunk. Ha két színre korrigálják az eltérést, achromat lencséről beszélünk, ha 3 színre, akkor apochromat lencséről. Még az apochromat objektív esetén is marad egy negyedik szín (a kék, zöld, sárga és vörös színeket tekintjük a itt fő színeknek), amelyre korrekciót lehet bevezetni a tökéletesen, színi aberrációtól mentes kép elérése érdekében. Erről speciális kompenzációs okulárral gondoskodhatunk. A mikroszkóp használatának alapelvei A mikroszkóp akkor ad jó minőségű képet, ha beállítása tökéletes, és a minta előkészítése, minősége is jó. A legtöbb hibát a megvilágítás helytelen beállítása okozza. Hogyan lehet ezt elkerülni? 1. A tárgyra eső fény intenzitása olyan legyen, hogy mind a kép világossága, mind kontrasztja optimális. 2. A fénynyaláb szimmetrikus legyen, középső tengelye az optikai elemek szimmetriatengelyével (optikai tengely) essen egybe. (Kivétel, ha szándékosan megfelelően beállított ferde világítást hozunk létre.) 3. Az egész látótér megvilágítása egyenletes legyen, és ne essen fény a látótéren kívüli pontokra, mert az onnan szóródó fotonok rontják a kép minőségét. 4. A megvilágítás nyílásszöge egyezzen meg az objektív nyílásszögével. Ez a gyakorlatban a kondenzor és az objektív NA-jának illesztését jelenti. Mivel általában a kondenzort nem áll módunkban cserélni, ezt úgy érhetjük el, hogy nagy NA-jú nagy nagyítású objektívekhez a kondenzort a mintához közel visszük és blendéjét nyitjuk, kis NA-jú objektívek használatakor a kondenzort a mintától távolítjuk és blendéjét szűkítjük. A megvilágítás beállításának lépései a hagyományos fénymikroszkóp esetében: 3
1. A fény központosítása. A legkisebb nagyítású objektívvel élesre állítjuk a tárgy képét, majd a lámpa és a kondenzor fényrekeszét minimálisra szűkítjük. A keletkező kis fényfoltot a kondenzor, ill. lámpa állító csavarok mozgatásával a látótér közepére állítjuk. 2. A megvilágítás erősségének és nyílásszögének beállítása. Először az alkalmazni kívánt objektívvel élesre állítjuk a tárgy képét. Ezután a kondenzor rekeszt kinyitva a kondenzor magasságának változtatásával élesre állítjuk a lámparekesz képét. A lámpa fényrekeszét addig nyitjuk, amíg a látótér egyenletesen világos lesz, de a fényfolt nem terjed a látótéren kívülre. Ekkor eltávolítjuk az (egyik) okulárt, és úgy állítjuk a kondenzor rekeszt, hogy annak képe majdnem elérje az objektív hátsó lencséjének kerületét, vagy legfeljebb annak 1/4-ével legyen beljebb. Objektív cseréjekor a kondenzor fényrekeszét és tárgytól való távolságát (magasságát) mindig az alkalmazott objektív NA-jához kell igazítani: nagyobb NA-jú objektívhez magasabb állású kondenzor és tágabb fényrekesz tartozik, és fordítva. A mikroszkópiák néhány fontosabb válfaja Világos látótér: A világos látóterű (konvencionális) mikroszkópia a legelterjedtebb és legtöbbet alkalmazott módszer a laboratóriumokban. A vizsgálni kívánt objektum megvilágítása fehér (összetett) fénnyel történik, így egyaránt lehetőség van festett és a festetlen minták tanulmányozására. A festetlen minták egyes részei eltérő optikai tulajdonságaik miatt különböző mértékben törik meg, illetve szórják a fényt, így a mikroszkópba tekintve eltérő intenzitású alakzatokat láthatunk. (Sötét-világos kontraszt.) Ha a mintát megfestjük, akkor a festék tulajdonságaitól függően más és más alkotóelemek válnak láthatóvá. A megvilágítás intenzitásának a csökkentésével nagyobb kontraszt és mélységélesség érhető el (alacsony kondenzor állás, szűk kondenzor rekesz). Természetesen ez egyúttal a numerikus apertúra, és ezáltal a felbontóképesség csökkentését is jelenti. Koehler-típusú megvilágítás A Koehler típusú megvilágítás alkalmazásával a mintákról sokkal élesebb kép állítható elő, mivel ennél a megvilágítás intenzitásának csökkentésével a mikroszkóp feloldóképessége nem csökken. A gyakorlati megvalósítása az alábbiak szerint történik: a fényforrás fényét egy lencse segítségével az alsó (kondenzor) rekeszre fókuszálják, ami egyben a kondenzor lencse hátsó fókuszsíkja is. Ily módon a fényforrás minden pontja a kondenzor fókuszába kerül, és ezért a kondenzor minden egyes pontról kollimált (párhuzamos) nyalábot állít elő, amely egyenletesen világítja be a látóteret. Következésképpen a tárgyról alkotott kép sokkal élesebb, kevesebb megvilágításból eredő műterméket tartalmaz. Sötét látótér: A sötét látóteres mikroszkópia esetében az alábbi módón történik a képalkotás: a direkt (a tárgyon egyenesen, szórás nélkül keresztülhaladó) fénynyalábot kitakarják, és csak azon indirekt fénysugarak vesznek részt a képalkotásban, melyek a mintában törést és elhajlást (diffrakciót) szenvednek, majd ezután jutnak be a mikroszkóp objektív lencséjébe. Ez a módszer lehetővé teszi a fénytörési sajátságok gyors változásának (pl. kis fényszóró objektumok látótérben való mozgásának) a megfigyelését, valamint az objektumok valódi színe is meghatározható a direkt nyaláb kikapuzása miatt. Lényeges, hogy a sötét háttér miatt a készülékben a felismerhetőség alsó határa csökken a sötét-világos kontraszt miatt, olyan részletek is láthatóvá válnak, melyek azonos felbontású világos mező mikroszkóp esetén nem, ugyanis a szem nagyon érzékenyen detektálja a fényintenzitásban bekövetkező különbségeket. Fáziskontraszt: 1932-ben Zernike fejlesztette ki ezt a mikroszkópot (1953-ban kapott Nobel-díjat). E módszer segítségével nem fixált és festetlen sejtek is kiválóan tanulmányozhatók a megnövelt kontraszthatás miatt. A sejtekben található alkotórészek nagy része átlátszó és a törésmutatója nagy. A fénysugár ezeken áthaladva kb. ¼ hullámhossznyi fáziskésést szenved az eredeti nyalábhoz 4
képest. Az ugyanezen tárgypontokról szóródó fotonok viszont nem szenvednek fáziskésést. Az áthaladó (direkt) és a szórt fotonok között jelentkező fáziskülönbséget a fáziskontraszt mikroszkóp intenzitáskülönbséggé alakítja. A szórt és az eredeti nyalábot szétválasztva további ¼ hullámhossznyi késést generál az egyik (általában pozitív kontraszt esetén a direkt) nyaláb fotonjainál, majd ezután a két nyalábot interferáltatva történik a képalkotás. A két fénynyaláb szeparálásához a megvilágító fénynyalábot a kondenzorban egy átlátszó gyűrű engedi át; a gyűrűn kívül és belül eső sugarak nem jutnak a mintára. A megvilágító sugarak ezért egy fénygyűrűt képeznek, mely kúpszerűen szűkül a kondenzor kollimáló hatása miatt, és egy egyenletesen megvilágított foltot hoz létre a fókuszsíkban. A nem szóródott fénysugarak innen egy bővülő kúpban haladnak tovább, és helyes beállítás esetén áthaladnak az ún. fázisgyűrűn, mely az objektívben (gyakran annak valamelyik lencséjén) kialakított fázislemez megfelelő méretű gyűrű alakú része. A szórt fotonok nagyobb része a fázislemez fázisgyűrűn kívül és belül eső részén halad át, a fázisgyűrűn áthaladó kis hányaduk a leképezés szempontjából elhanyagolható jelentőségű. A fáziskontraszt mikroszkópok pozitív és negatív kontraszt üzemmódban használhatók. A pozitív vagy sötét kontraszt esetén a direkt fénynyalábot késleltetjük ¼ fázissal a fázisgyűrűn (pl. vékony MgF 2 vagy Al réteg segítségével). Ekkor a nagyobb törésmutatójú pontokon áthatoló direkt fotonok fázisa a tárgyban kb. maximum ¼ hullámhossznyival késik, a fázisgyűrűn ugyancsak ¼ hullámhossznyival, míg a szórt fotonok az eredeti fázisban maradnak. A direkt és a szórt nyaláb interferencia révén kioltja egymást (ha pontosan ¼ λ a tárgyban a fáziskésés), ill. jelentősen csökken a nagyobb törésmutatójú pontok intenzitása a környezetükkel azonos törésmutatójú pontokéhoz képest (melyeknél a maximális intenzitás 50%-át tapasztaljuk). A környezetüknél kisebb törésmutatójú pontokon fázissietés következik be, amelyet a fázisgyűrű kompenzál, így az ott áthaladó fotonok a szórt fotonokkal kb. azonos fázisban érkeznek, interferenciájuk erősítést eredményez, ezért ezen pontok képe a legvilágosabb. Negatív vagy világos kontraszt esetén a fázislemezen a kondenzor fázisgyűrűjének a kiegészítő képét (tehát a gyűrűn kívül és belül elhelyezkedő felületet) látják el ¼ λ késést okozó bevonattal, tehát olyan hatást érnek el, mintha a direkt sugarakat siettetnék. Ennek megfelelően a direkt fotonok nagyobb törésmutatójú objektumokon létrejövő fáziskésését kompenzálják, így ezen pontok képe környezetüknél világosabb lesz. A kisebb törésmutatójú pontokon fellépő fázissietés viszont tovább fokozódik, s így ezen pontok képe az átlagos törésmutatójúakéhoz képest sötétebb lesz. A nagyobb kontraszt elérése érdekében a direkt nyaláb intenzitását csökkentik a fázisgyűrű segítségével: abszorbeáló bevonatot visznek fel a fázisgyűrűre, melynek hatásfoka 75-95%-os. Így a szórt nyaláb intenzitásához hasonlóvá válik a direkt nyaláb intenzitása. Mivel a törésmutató hullámhosszfüggése miatt kromatikus aberrációk lépnek fel, ezek kiküszöbölésére monokromatikus fényt használunk a megvilágításra. Tekintve, hogy az emberi szem a zöld-sárga tartományban a legérzékenyebb, ilyen színű sávszűrővel előállított, kb. 550 nm-es fényt alkalmaznak a leggyakrabban. Fluoreszcenciás mikroszkópia: A fluoreszcenciás mikroszkópia a különféle fluoreszkáló festékek alkalmazásán alapszik (lásd Biofizika tankönyv), melyeket szelektíven köthetünk a minta bizonyos alkotóelemeihez. A fluoreszcens festékeket a megfelelő hullámhosszú fénnyel gerjesztve nagyobb hullámhosszúságú fényt emittálnak. A gerjesztő és emittált fotonok minél tökéletesebb szétválasztása érdekében ún. dichroikus tükröket helyeznek az okulár és az objektív közé (előadás ábra). A dichroikus tükrök csak egy adott hullámhosszúság tartományban vernek vissza, a többi fényt átengedik. Így a gerjesztő fényt a mintára vetítik, az emittált fotonokat pedig eltérítés nélkül átengedik a megfigyelő irányába. A további szelektálást színszűrőkkel végzik mind a gerjesztési, mind az emissziós oldalon. A fluoreszkáló molekulák a sötét háttér miatt jól láthatók, kvantitatív digitális mikroszkópia segítségével nagy pontosságú mérések is végezhetők rajtuk. Mivel a megfigyelt pontok fényforrásként működnek, a feloldóképességet a d=0.61 λ/na objektív összefüggés szabja meg. A fluoreszcenciás mikroszkópia különleges alkalmazásai a konfokális lézer pásztázó mikroszkópia (lásd Biofizika tankönyv), a fluoreszcencia korrelációs mikroszkópia, és a különféle nagyfelbontású és nemlineáris optikai mikroszkópiák (lásd előadás). 5
Biológiai minták esetén a festékek típusától függően többféle sejtparaméter is tanulmányozható - akár egyszerre is (életképesség, membránpotenciál, fehérjék konformációs változásai stb.). A sejteket a kísérlet előtt antitestekhez konjugált fluoreszkáló festékkel jelölhetjük meg (pl. sejtfelszíni antigének vizsgálatakor) vagy festékekkel töltjük fel (pl. életképesség vizsgálata) - lásd bővebben a Sejtbiológia gyakorlati jegyzetben. kamera megvilágítás erõsségének állítása megvilágított terület állítása megvilágítás fókuszálása fényút váltó (kamera/okulár) gerjesztési szûrõdikroikus tüköremissziós szûrõ váltó megvilágított terület pozicionálása lámpa fluoreszcens mikroszkópiához (higanygõzlámpa) megvilágítás erõsségének állítása hagyományos fénymikroszkópiához megvilágítás kapcsoló hagyományos fénymikroszkópiához Az ábra a gyakorlaton használt fluoreszcenciás mikroszkóp vázlatos felépítését, főbb kezelőszerveit mutatja. 6
I. rész: Mérések fénymikroszkóppal Az okulárskála kalibrációja és vörösvérsejtek átmérőjének mérése Elvégzendő feladatok: a) Az okulárskála kalibrációja tárgymikrométer segítségével. Kalibrálja az okulárban található skálát a tárgymikrométer segítségével! A tárgymikrométeren két osztás távolsága 10 μm. 1 egység az okulárskálán:...μm. b) Vörösvérsejtek átmérőjének mérése. Határozza meg a béka vérkenetben található, ellipszis alakú vörösvértestek nagytengelyének hosszát! Használjon 100x, immerziós objektívet! Mérje meg kb. 30 db vörösvértest átmérőjét, majd számoljon átlagot, és a fenti kalibráció segítségével adja meg egy vörösvértest átmérőjét mikrométerben! VVT átmérők (okulárskála egységekben): VVT átlagos átmérő:...okulárskála egység, vagyis... μm Adja meg a mérési eredmények korrigált empirikus szórását (SD) és a mintaközép szórását (SEM) μm egységekben. SD= SEM= c) Emberi és béka vörösvérsejtek átmérőjének összehasonlítása. Egy emberi vérkeneten elvégezve a fenti mérést, az alábbi adatokat kaptuk: mérések száma: n=30 mintaátlag (okulárskála _ egységekben): x =4,56 korrigált empirikus szórás SD=1,23 (okulárskála egységekben): Hasonlítsa össze 2-mintás t-próbával, hogy 5% szignifikanciaszinten jelentősen különbözik-e egymástól az emberi és a béka VVT-k átmérője. (Akkor is végezze el a t-próbát, ha az F-próba szerint jelentősen különböző a két populáció szórása!) 7
II. rész: Mérések fluoreszcencia mikroszkóppal Fluoreszcens gyöngyök vizsgálata, az optikai és a digitális felbontóképesség összehasonlítása Elvégzendő feladatok: a) Fluoreszcens gyöngyök (bead) vizsgálata. Helyezze a mikroszkópba a fluoreszcens gyöngyöt tartalmazó tárgylemezt! Állítsa be a mikroszkópot először a 10x objektív használatával (csak a fókuszt és a tárgylemez pozícióját állítsa, a gerjesztő fény erőssége, pozicionálása, kondenzor magassága, kondenzor fényrekesz; (ezen a mikroszkópon nem lehet a lámparekeszt állítani) beállításához kérje a gyakorlatvezető segítségét!). Vizsgálja meg a fluoreszcens gyöngyöt tartalmazó tárgylemezt epifluoreszcens és fénymikroszkóp üzemmódban is. A fluoreszcens gyöngyöket sokkal könnyebb megtalálni fluoreszcens üzemmódban. Fénymikroszkóp üzemmódban zárja el a fluoreszcens megvilágítás útját. A fluoreszcens lámpát (higanygőzlámpa) ne kapcsolja ki, mert azt nem lehet gyorsan ki- és bekapcsolni egymás után. Állítsa be a megvilágítás erősségét úgy, hogy a kontraszt a legnagyobb legyen. Fluoreszcens mikroszkóp üzemmódban kapcsolja ki a hagyományos mikroszkópiához használt lámpát. Használjon kék gerjesztő fényt (és az annak megfelelő gerjesztési és emissziós szűrőket, valamint dichroikus tükröt). Készítsen felvételt a mikroszkópon található kamera segítségével a fluoreszcens gyöngyökről először a 25x, majd a 50x (vagy 40x) objektív használatával! NE használjon immerziós olajat, a fluoreszcencia mikroszkóp objektívjei nem immerziósak! A kép készítése a számítógép segítségével történik. A program, melyet el kell indítani, az Olympus C-W95 nevet viseli. A Camera>Camera Control menüponton belül be kell állítani a képminőséget (SHQ=super high quality, 1280x1024 pixel), majd a kép felvétele a TAKE PICTURE gomb megnyomásával történik. Ezt követően a kép megjelenik a képernyőn. Mind a 25x, mind az 50x (vagy 40x) objektívvel készített képeket mentse el BMP formátumban (FILE>SAVE)! b) A mikroszkóp optikai felbontóképességének és a kamera felbontóképességének összehasonlítása. Számítsa ki a mikroszkóp által feloldott legkisebb távolságot mind a 25x, mind az 50x (vagy 40x) objektív használata esetén! A megvilágító fény hullámhossza kb. 480 nm (kék gerjesztés), illetve 550 nm (zöld gerjesztés). Használja az egyszerűsített Abbe formulát: d=½λ/na objektív d 25x = d 50x vagy 40x = (jelölje, melyik objektívet használta!) A kamera fényérzékeny detektora a mikroszkóp leképező lencserendszerének (objektív + tubuslencse) képsíkjában található. Ebben az esetben a lencserendszer nem tartalmazza az okulárt. A kamera által rögzíthető legjobb minőségű képek 1280x1024 pixel méretűek, tehát a kamera fényérzékeny detektora 1280x1024=1310720 elemi képpont érzékelésére képes. (HQ üzemmódban 1024x768=786432 elemi képpontból áll a felvett kép.) Minél kisebb ezen pixelek átmérője, annál jobb a digitális kép felbontása. Ha viszont a kamera pixelszélessége sokkal kisebb, mint annak a körnek az átmérője, amekkora szélességűre egy képpontot az objektív leképez, az nem növeli tovább a digitális kép információtartalmát és fölöslegesen növeli a felvett digitális képek méretét (a tárolásukhoz szükséges memória mennyiségét, amely a pixelszámmal egyenesen arányos). Ha a detektor pixelszélessége sokkal 8
nagyobb, mint az előbb említett kör átmérője, a kamera által detektált digitális kép feloldása sokkal rosszabb lesz annál, mint amit a mikroszkóp optikai elemei lehetővé tennének. pixelek a fényérzékeny detektoron pixelek a fényérzékeny detektoron a tárgypont képe (átmér je a mikroszkóp optikai feloldóképességével függ össze) objektív tárgypont Üres digitális információ (túlmintavételezés) A digitális kép feloldóképessége rosszabb, mint a mikroszkópé Határozza meg, milyen szélességű területet képez le az objektív a képsíkban elhelyezkedő detektor egyetlen pixeljére! Végezze el a számításokat az alábbi két módon: 1. Tudjuk, hogy a fényérzékeny detektor nagysága 10x8 mm. A detektor pixelszámának felhasználásával (1280x1024) határozza meg egy pixel fizikai szélességét, majd az objektív nagyításának ismeretében határozza meg, hogy ezen képnagyságnak mekkora tárgynagyság felel meg! d 25x = d 50x vagy 40x = (jelölje, melyik objektívet használta!) 2. Ismert, hogy a vizsgált fluoreszcens gyöngyök átmérője... μm. (Ezt az adatot a gyakorlaton kapják meg az aktuálisan használt gyöngyök függvényében.) A ScionImage nevű program felhasználásával mérje meg, hogy a képeken hány pixel felel meg ennek az átmérőnek! Nyissa meg az elmentett képeket (FILE>OPEN), majd állítsa be a méretét úgy, hogy az egész képet lássa (OPTIONS>SCALE TO FIT WINDOW)! Ha szükséges, növelje a kép kontrasztját (PROCESS>ENHANCE CONTRAST)! Mérje meg a gyöngy átmérőjét: 1. az Analyze>Options ablakon belül szelektálja ki a Perimeter/Length opciót. 2. ANALYZE>RESET 3. ANALYZE>SHOW RESULTS 4. válassza ki a vonalmenti mérést (TOOLS ablakon belül a jobb oldali ikonoszlopban felülről a negyedik) 5. helyezze az egér segítségével a vonal két végét a bead két átellenes pontjára, majd mérje meg ezt a távolságot pixelekben (ANALYZE>MEASURE) 6. számolja ki 10 mérés átlagát 7. végezze el a fenti mérést a 25x és a 50x (vagy 40x) objektívvel felvett képpel is 9
Gyöngy átmérők a 50x (vagy 40x) objektívvel Gyöngy átmérők a 50x (vagy 40x) objektívvel Gyöngy átmérők a 25x objektívvel Gyöngy átmérők a 25x objektívvel Átlagos gyöngy-átmérő a 50x (vagy 40x) objektív esetében:... pixel Átlagos gyöngy-átmérő a 25x objektív esetében:... pixel Számolja ki a gyöngy átmérőjének ismeretében, hogy egy pixel szélessége mekkora távolságnak felel meg a tárgysíkban a 25x és a 50x (vagy 40x) objektív esetében: d 25x = d 50x vagy 40x = (jelölje, melyik objektívet használta!) Vesse össze a kétféleképpen meghatározott távolságértékeket, és hasonlítsa össze ezeket a mikroszkóp optikai feloldóképességére kapott számokkal! Írja le következtetéseit! 10