Dr Fekete Jenı: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC Mozgófázisok a HILIC-ban Módszer specifikus feltétel: kevésbé poláris, mint az állófázis vagy a víz Miért a víz? Mitıl l poláris az állófázis felülete? lete? A komponens megoszlik a szorbeált vízréteg és a mozgófázis között. A különbözı állófázisoknál a víz a legkevésbé poláris. ezért ennél kell kevésbé polárisnak lenni a mozgófázisnak. AN + H 2 O S K H 2 O H 2 O
Általános feltételek kis viszkozitás -nagy tisztaság -szilárdanyag mentesség -gázmentesség -UV detektálásnál kis UV cut-off -kis mértékő kipárolgás -kis toxicitás -gazdaságosság Oldószerek: víz-metanol-acetonitril-izopropanoltetrahidrofurán A HILIC-ban használt oldószerek fizikai tulajdonságai
H 1 H 2 Viszkozitás változás a szerves oldószer-víz összetétel függvényében Választás: viszkozitás 1,8 1,6 1,4 viszkozitás [cp] 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 Metanol T HF Acetonitr 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 szerves oldószer tartalom [v%] Az elválasztás hatékonyságának függése a mozgófázis viszkozitásától H η 2 η 1 H min u gyakorlati u Különbözı binér-elegyek H-u görbéi a lineáris áramlási sebesség függvényében Az acetonitril-víz elegy adja a legkisebb H értékeket, használatakor legnagyobb az elválasztás hatékonysága. Használata a HILIC-ban ajánlatos. H víz-2-propanol víz-etoh víz-meoh víz-acn u
Mozgófázis erısség a HILIC-ban víz>metanol>acetonitril>tetrahidrofurán Mozgófázis erısség a RP-HPLC-ban víz<metanol<acetonitril<tetrahidrofurán.. Az elsı szempont, hogy a vegyületek molekuláris formája vagy azok aránya az elválasztás körülményei között állandó legyen. Ha ez a feltétel nem teljesül, akkor a másodlagos egyensúlyok miatt a kromatográfiás csúcs kiszélesedik, és a visszatartás is változhat. A HILIC-nál is elsı eldöntendı kérdés, hogy kell-e ph kontroll vagy nem, ezt a vegyületek szerkezete dönti el.
HILIC szempontból a vegyületek négy csoportra oszthatók: kromatográfiás szempontból semleges vegyületek savas jellegő funkciós csoportot tartalmazó vegyületek bázikus funkciós csoportot tartalmazó vegyületek ionos vegyületek Kromatográfiásan semleges vegyületek, amelyek poláris csoportokat tartalmaznak és lgp<-0,5 ekkor A VEGYÜLET NEM KÖVETELI MEG A ph KONTROLLT Retenció beállítása: H2O>MeOH>AN>2-PrOH>THF A visszatartás egyik lehetséges változata a HILIC folyadékkromatográfiás módszernél. A komponens megoszlik a szorbeált vízréteg és a mozgófázis között. Megoszlás cak akkor várható, ha jelentıs eltérés van a mozgófázis és az állófázis víztartalma között. AN + H 2 O S K H 2 O H 2 O
A visszatartás változása a mozgófázis szerves oldószer tartalmának változtatásával. A vegyületek poláris jellegével a visszatartás nı. Polaritási sorrend: 3>2>1. k 70 3 2 1 φ (tf%) A visszatartási tényezı változása a szerves oldószer koncentrációjának függvényében és linearizálás mindenki ismeri RP-HPLC-t ezért ehhez viszonyítunk mindent!!! lgk=a-bφ lg k Linearizálható szakasz lg k =A +B φ 80 100 φ (v/v%) A visszatartás változása a mozgófázis víztartalmának függvényében a HILIC módszer alkalmazásakor. Minél nagyobb a vízoldhatósága a vegyületnek, annál kisebb az egyenes meredeksége. Linearizálni csak 60-70 tf.% víztartalom felett lehet. lg k φ víz (v/v%)
Mekkora lehet a legnagyobb víztartalom? Alap: -kis víztartalmú szerves oldószereknél az egyensúly beállás hosszú -az egyensúlyi állapot ismételhetısége bizonytalan -3-5 tf.% víz kell a szerves oldószerbe Savas csoportot tartalmazó vegyületek Modell: R-COOH=RCOO +H + pk a Ha lehet az elválasztásuk, a ion visszaszorított formában, ennek feltétele: lgp<-0,5 Savas csoportot tartalmazó vegyületek Ion visszaszorított: lgp<-0,5, Ionozált: lgd <-0,5
Bázisos csoportot tartalmazó vegyület ionizáltság 1 protonált bázis I 0,5-2 +2 pk a szabad bázis ph Lehetséges módok: Bázisos csoportot tartalmazó vegyületeknél: IONIZÁLT!! Oka: szilanolcsoportok ion visszaszorított formában legyenek. ph kontrollt pufferekkel végezzük, de NAGY A SZERVES OLDÓSZER TARTALOM CSAK SZERVETLEN KOMPONENSEKET TARTALMAZÓ PUFFEREK NEM OLDÓDNAK!!!!!
ammónium-acetát/ecetsav ammónium-formát/ hangyasav MS, ELSD, CAD kombabilitás ammónium-citrátok/citomsavak tris/tris HCl trietilamin-foszfát ph tompító hatású anyagok: hangyasav ecetsav trifluorecetsav A pufferkapacitás ph és koncentrációfüggése ammóniumacetát puffer alkalmazásakor
Víz: skálát 0 és 14 között értelmezzük Metanolnál ez az érték 16,77 a ph skála ennek megfelelıen 0 és 16,77 között értelmezendı Acetonitril-víz esetén a pk a érték 34,40 Tetrahidrofurán-víznél 34,70. Kérdés: nagy a szerves oldószer tartalom, akkor Mi a hidrogén-ion aktivitás az oldatban, pk a változás, hova pufferoljunk Mi a hidrogén-ion aktivitás a határfelületen, meddig stabil a kolonna Az ajánlott módszer, hogy az elsıdleges és/vagy másodlagos pufferekbıl tömeg szerint összemérjük az oldatokat, és a nemzetközileg elfogadott értéket használjuk. Ez egyértelmő, mindenhol reprodukálható. Amennyiben táblázatban az adott összetételt és a hozzá tartozó ph értéket nem találjuk meg, akkor a tiszta komponensekbıl törzsoldatot készítünk, ezek ph-ja adott és a megadott arányokban összemérjük, és mérjük a ph értéket. A tömegmérés az egyik legpontosabb analitikai mérésünk.
Az analitikai-kémiai számításoknál megismert közelítı képlet alapján számítást végzünk: ph=pk a +log C só /C sav a képlet alapján kiszámoljuk, hogy 0,01 mól/l savhoz mennyi bázist kell adni, hogy 4-es legyen a ph értéke. Készítsünk ecetsav-ammóniumacetát puffert. pk a =4,76, ekkor bemérünk 0.01 mol ecetsavat egy 1000 ml-es normállombikba, majd a számítás alapján hozzáadunk 0,015 mol ammónium-hidroxidot, és 1 l-re egészítjük ki. A ph csak körülbelül lesz 4-es értékő, mert a bázisnál nem vettük figyelembe az aktivitásfüggést ( lásd Debey-Hückel elmélet vagy Bates-Guenheim közelítés). A hidrogén-ion aktivitás függ a disszociációs állandótól, az egyéb ionoktól, és a mozgó fázisban mért valódi hidrogénion aktivitás, az önprotonálódási állandótól. Módszer: bemérjük az ecetsavat és ammónium-hidroxiddal-dal 4-es ph értékig titráljuk. Ismételten a hidrogénion aktivitás meghatározatlansága okoz bizonytalanságot a retenció reprodukálásában. Módszer: a fenti mőveletet a mozgófázisban hajtjuk végre. A mozgófázishoz hozzámérjük az ecetsavat, és NH 4 OH oldattal titrálva állítjuk be a ph értéket. Ekkor a vízre vonatkoztatott értékhez képest megkapjuk a vízre kalibrált, de a mozgó fázisban mért ph értéket, amely eltér a vízre vonatkoztatottól és a szerves oldószerre vonatkoztatottól is.
Mérjük a puffer ph-t és ehhez adjuk a szerves oldószert Kalibráljuk az üvegelektródot az elsıdleges és/vagy másodlagos pufferekre, és utána a kész mozgófázisban mérjük a ph-t A kalibrációnál az elsıdleges és/vagy másodlagos puffereket a mozgófázisba mérjük be, és a mérést is a mozgófázisban végezzük el. A ph és a pk a változása a vízben mérthez Savas csoportot tartalmazó vegyületek elválasztása savas pufferrel. Az 1. görbe a vizes közegben adja meg a vizsgálandó vegyületre a molekuláris formák arányát, a 3. nagy szerves oldószer tartamú közegben. A 2. és 4. görbék a puffer ionizációs viszonyait adják meg vízben és nagy szerves oldószer tartamú közegben
A puffer bázikus összetevıjének és a szerves vegyület bázisos csoportjának pk a értét eltolódása a mozgófázis szerves oldószer tartalmának változtatásával. Jelölések:1. puffer vizes közegben, 2. bázikus csoportot tartalmazó vegyület vízben, 3. puffer 60 v/v% szerves oldószerben, 4. bázikus csoportot tartalmazó vegyület 60 v/v% szerves oldószerben A szaggatott vonallal jelölt görbék a vízre megadott ionizációs viszonyokat tartalmazzák, a folytonos a szervesoldószer hozzáadása után kialakultakat. A jobb oldalon a savas puffer (formiát vagy acetát) változása, míg a baloldalon a bázisos vegyületé látható.