Az ízületi implantátum aszeptikus lazulás gyógyszeres befolyásolhatóságának kísérletes vizsgálata

A Pécsi Tudományegyetem, ÁOK, Ortopédiai Klinika és a chicagoi Rush Medical Center Department of Orthopedics közleménye Az ízületi implantátum aszeptikus lazulás gyógyszeres befolyásolhatóságának kísérletes vizsgálata DR. VERMES CSABA, DR. LOVÁSZ GYÖRGY, DR. BELLYEI ÁRPÁD, DR. GLANT T. TIBOR Érkezett: 2005. május 3. ÖSSZEFOGLALÁS A nagyízületi endoprotézisek aszeptikus kilazulásához vezető mechanizmusok minden részletükben még nem ismertek. A szerzők bemutatják, hogy in vitro körülmények között kopási törmelék jelenlétében az osteoblastok csökkent mennyiségben termelnek csont mátrix proteineket (kollagén, osteonectin, osteocalcin, alkalikus foszfatáz). Emellett fokozottan szabadítanak fel interleukin-6-ot, mely erőteljes osteoclast aktiválással bír. A két folyamat együttesen progresszív csontvesztéshez vezet. A megváltozott osteoblast funkciók kompenzálhatók voltak bizonyos növekedési faktorokkal (insulin-like growth factor-1, transforming growth factor-β1, bone morphogenetic protein- 7), farmakológiai szerekkel (genistein, PDTC), valamint ismert, már gyógyszerként is használt készítményekkel (pamidronate, calcitriol), ezáltal a jelen tanulmány prevenciós/terápiás lehetőségeket is megvilágít. Kulcsszavak: Ízületi protézisek Szövődmények; Osteoblast Gyógyszeres kezelés; Osteolysis Etiológia; Protézisek és implantátumok Szövődmények; Protézislazulás; Cs. Vermes, Gy. Lovász, Á. Bellyei, T. T. Glant: Aseptic loosening of the joint implant influenced by drugs. Experimental study The mechanism of aseptic loosening concerning large joint endoprostheses has not been entirely known yet. The authors introduced, that in vitro the osteoblast produced bone matrix proteins (collagen, osteonectin, and alkaline phosphatase) were diminished in the presence of erosion particles. However the interleukin-6 production was obvious, highly activating the osteoclasts. These both processes resulted in the progressing bone loss. The disturbed osteoblast function could be compensated by certain growth factors (insulin-like growth factor 1, transforming growth factor β1, bone morphogenetic protein 7), by pharmacological agents (genistein, PDTC) and by well known medicaments (pamidronate, calcitriol), therefore this study gives preventional and therapeutical possibilities as well in this subject. Key words: Joint prosthesis Adverse effects; Osteoblasts Drug effects; Osteolysis Etiology; Prostheses and implants Adverse effects; Prosthesis failure; BEVEZETÉS A nagyízületi endoprotetizálás az elmúlt évtizedek legfontosabb ortopéd sebészeti vívmányainak egyike. Világszerte évente megközelítőleg egymillió protézist ültetnek be, jelentős javulást biztosítva ezzel mind az ízületi funkciók, mind a betegek életminősége tekintetében. Ezzel párhuzamosan azonban a pácienseinket új biológiai problémának tesszük ki, amit az implantátum anyag jelenléte okoz az emberi szervezetben, és ez speciális idegen test és humán szövet interakcióban nyilvánul meg. Ennek egyik klinikai megjelenése a periprotetikus csont felszívódása, ami az esetek nagy többségében együtt jelentkezik az implantátum aszep- Magyar Traumatológia, Ortopédia, Kézsebészet, Plasztikai Sebészet 2006. 49. 2. 153

tikus lazulásával. Ennek súlyossága az egyéntől, az implantátum anyagától és számos egyéb tényezőtől is függ (19). A folyamat a protézis rögzítettségének elégtelenségével, funkciójának elvesztésével, majd végső soron annak cseréjével jár. Összességében ez képezi a nagyízületi implantációk hosszú távú komplikációinak legjelentősebb részét, egyidejűleg a revíziós műtétek leggyakoribb okát is (21). A periprotetikus csontfelszívódás és aszeptikus implantátum lazulás patomechanizmusa, biológiai, molekuláris biológiai és biokémiai háttere rendkívül jól karakterizált folyamatok. Kialakulásának hátterében két fő mechanizmus áll: 1. Mechanikai: az implantátum terhelésével együtt járó nyomási erők (vagy azok hiánya) csont atrófiát okozhatnak (stress shielding). 2. Biológiai: a protézis normál használata közben lépésenként 20,000 30,000 kopási törmelék keletkezik (polimer és fém, átlagos méret tartomány: 10 nm 2 µm), ami éves szinten több milliót tesz ki (3, 32). Ehhez társul továbbá az implantátum anyagából kémiai bomlás során leváló termékek (pl. fém ionok oldott és precipitált formában) jelenléte (20). A folyamatosan termelődő és nem lebomló partikulumokat bekebelezik a periprotetikus térben elhelyezkedő különféle sejtek (macrophag, fibroblast, osteoclast és osteoblast), valamint az egyéb degradációs termékek is direkt sejtaktivációt eredményeznek. A phagocytosis és a partikulum-sejt interakció erős szignált biztosít a sejt számára, mely szignál különböző gének és az általuk kódolt proteinek fokozott expressziójával és számosak gátlásával jár. A fenti folyamatok eredménye egyrészt lokális sejtválasz és steril gyulladás kialakulása az implantátum körül (19), amelyeknek következménye egy agresszív, a rheumatoid arthritisben található synovialis hártyához hasonló szövet (angol irodalomban: synovium-like membrane [SLM], vagy interfacial membrane [IFM]) kialakulása az implantátum és csont határon (14, 19). A lokális reakción túl immunológiai (16) és egyéb szisztémás hatásai is lehetnek (36). A protézis mellett kialakuló aktív mikrokörnyezet a csontképzés és felszívódás arányát az utóbbi irányába tolják el, és kialakul a periprotetikus osteolysis (19). A kopási törmelék biológiai hatásai függnek a méretüktől, számuktól és összetételüktől. A fém és kisseb (a phagocytosisra alkalmas méretű) partikulumok lényegesen jobban aktiválják a periprotetikus sejteket in vitro, ugyan a részecskék többsége a protézisek puhább, polietilén komponenséből származik (32). Az in vitro partikulum stimulált macrophagok fokozottan termelnek különböző citokineket (tumor necrosis factor alpha [TNF α, interleukin [IL] 1, IL 6), kemokineket (IL 8, monocyte chemoattractant protein 1 [MCP 1]), prosztaglandin E2 (PGE 2)-t valamint mátrix metalloproteinázokat (MMP) (4). Hasonlóképpen, a fibroblastok is fokozott IL 1, IL 6, IL 8 és MMP 1 (stromelysin) és MMP 3 (collagenase) termeléssel válaszolnak partikulum kezelésre in vitro (46). Ami nagyon fontos, hogy ezek a mediátorok kimutathatók in vivo is betegekből lokálisan a lazult implantátum körül (14, 22). A periprotetikus csont mátrix lebontása több úton történik. Az aktivált fibroblastok és macrophagok által termelt MMP 1 és MMP 3 enzimatikus hatása révén bontja le az extracellularis csont mátrixot (46). Az osteoclastok direkt módon is aktiválódnak és fokozottan bontják le a csont extracellularis állományát kopási partikulumok hatására (44). Talán ennél is fontosabb, hogy a környező sejtek által termelt TNF-α, IL 1, IL 6, PGE 2 parakrín módon aktiválja az osteoclastokat (15). Továbbá, a termelt IL 8 és MCP 1 kemotaktikus hatást gyakorol a neutrophil leukocytákra, valamint a monocyta-macrophag sejtekre, mely sejtek további destruktív/inflammatorikus hatást fejtenek ki a periprotetikus térben (12). A csontlebontással normális esetben lépést tarthatna a fokozott osteoblast funkció, ami emelkedett csont metabolizmushoz, de talán normál denzitáshoz vezetne. Azonban in vivo 154 Magyar Traumatológia, Ortopédia, Kézsebészet, Plasztikai Sebészet 2006. 49. 2.

nem ez történik, ahogy a periprotetikus osteolysis idővel progrediál. Kísérleteink kimutatták, hogy ennek hátterében az osteoblast funkciók megváltozása áll (41). Ezek közül talán a legjelentősebb az I es típusú kollagén szintézisének csökkenése, ami a csont mátrix szerves alkotórészének közel 90%-át teszi ki. Ennek hátterében a prokollagén α1[i] gén expressziójának gátlása áll (42). Ezzel párhuzamosan fokozottan termelnek IL 6-ot, IL 8-at, MCP 1-et valamint PGE 2-t, mely anyagok stimulálják az osteoclastokat (40). Jelen tanulmányban kutatási eredményeink alapján bemutatjuk, hogy milyen elváltozásokat okoznak a kopási törmelékek humán osteoblastokon, és melyek azok a mediátorok, amik képesek in vitro körülmények között a partikulum hatását semlegesíteni osteoblastok esetében, így preventív, illetve terápiás értékkel bírhatnak a periprotetikus osteolysis kérdéskörében. MÓDSZEREK Osteoblast sejtkultúrák Kísérleteinkhez humán osteoblast sejtvonalakat, valamint humán csontvelő aspirátumból izolált primer osteoblast kultúrákat használtunk. Az MG 63, HOS és SaOS 2 sejtvonalak az american type culture collection (ATCC) sejtbankból származtak, amelyeket standard szövettenyészeti körülmények között tartottunk. A primer kultúrákhoz szükséges csontvelő aspirátum gerincműtéten átesett betegek csigolyatestéből származott, minden esetben a beleegyező nyilatkozat kitöltését követően. Két milliliter aspirátumot véralvadásgátlóval ellátott médiumba helyeztük, amiből centrifugálással elválasztottuk az úgynevezett buffy coat réteget. Ezt a fázist specifikus sejttenyésztő oldatba helyeztük, mely aszkorbinsavat, dexametazont és beta glicerinfoszfátot is tartalmazott. A primer kultúrák osteoblast irányú differenciálódását a sejtek alkalikus foszfatáz (AP) pozitivitása alapján állapítottuk meg, és csak a 80% feletti kultúrákat használtuk kísérletekhez. A kísérletekhez használt partikulumok Fém és polimer részecskéket használtunk kísérleteinkhez. A fémek közül tiszta titánt (Ti), króm ortofoszfátot (CrPO 4 ) és titán alumínium vanádium (Ti Al Va) ötvözetet alkalmaztunk. A polimerek közül polietilén (PE) és polymetil metacrylat (PMMA) kerültek felhasználásra. A partikulum fajták átlagos mérete 1 3 µm között volt, és az alkalmazott koncentráció 0,001 0,5 térfogatszázalékig terjedt a dózisfüggés megállapítására, és tipikusan 0,1% került felhasználásra a kísérleti sorozatokban. A sejtkultúrák kezelése A Petri csészében konfluens sejtkultúrákat alkalmaztunk kísérleteinkhez, ami körülbelül 1,5 10 6 sejtet jelent a sejtvonalak és körülbelül 0,5x10 6 sejtet a primer kultúrák esetében. Az adherens sejtek felülúszójába (10 ml) kevertük mind a partikulumokat, mind pedig a különféle anyagokat, amiket a tanulmány során használtunk. A sejteket kezeltük calcitriollal (0,1 µm), pamidronáttal (10 µg/ml), insulin-like growth factor 1-el (IGF 1, 30 ng/ml), transforming growth factor-β1-el (TGF β1, 20pg/ml), bone morphogenic protein 7-tel (BMP 7, 10 ng/ml), genisteinnel (20 µm), pirrolidin ditiocarbamattal (PDTC, 100 µm), illetve ezek és partikulumok kombinációival. A phagocytosis vizsgálata A kísérletek során a phagocytosist mikroszkóppal vizsgáltuk. Fém partikulumok esetében natív és festett készítményeket vizsgáltunk fénymikroszkóppal. Polimer részecskék esetében polarizációs mikroszkópot is alkalmaztunk. A réteg és nagyfelbontású vizsgálatokhoz kon- Magyar Traumatológia, Ortopédia, Kézsebészet, Plasztikai Sebészet 2006. 49. 2. 155

fokális mikroszkópot használtunk. Fluoreszcens vizsgálatokat is végeztünk abban az esetben, amikor a primer osteoblastok AP pozitivitását fluoreszcens módszerrel mutattuk ki, és paralel módon a sejtek fluoreszcens festékkel ellátott polimer partikulum kezelésnek voltak kitéve. A génexpresszió vizsgálata Génexpresszió vizsgálatához a kezelt és nem kezelt osteoblast kultúrákból RNS-t nyertünk ki standard módszerek segítségével, majd utána Northern blot, reverse transcription realtime polymerase chain reaction (RT PCR), gén csipp (DNA microarray) és RNaze protection assay (RPA) technikákat alkalmaztunk. A kultúrák által szekretált proteinek analízise A kezelési idő közben, valamint annak lejártával a sejtkultúrák felülúszójából mintát vettünk és enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) technikával vizsgáltuk. Rutinszerűen mértük a termelt TNF α, IL 1β, IL 6, TGF β1, osteocalcin és I-es típusú kollagén szinteket. Az intracelluláris jelátvitel vizsgálata A sejten belüli proteinek vizsgálatához a kezelt és nem kezelt kultúrákból kivontuk a teljes fehérjetartalmat standard módszerek szerint, majd úgynevezett SDS PAGE elektroforézissel a proteineket szeparáltuk és immunoblot (Western blot) technikával vizsgáltuk a jelátvivő molekulák aktiválódását (foszforiláció). A transzkripciós faktorokat electrophoretic mobility shift assay (EMSA) technikával vizsgáltuk, ahol a sejtekből elkülönítettük a magfrakciót és abból mutattuk ki az adott transzkripciós faktor, valamint specifikus komponenseinek a jelenlétét. Statisztikai analízis Leíró statisztikát alkalmaztunk a csoportátlagok, standard deviációk megállapítására. A Student T tesztet használtuk a csoportok összehasonlítására Bonferroni korrekcióval. A szignifikanciát a p<0,05 szinten állapítottuk meg. A statisztikai számításokat az SPSS 10.0 statisztikai programmal végeztük (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). EREDMÉNYEK A humán osteoblastok képesek a partikulum felvételére Annak ellenére, hogy az osteoblast nem phagocyta típusú sejt, képes volt partikulum bekebelezésére. Mind a standard sejtvonalak, mind a primer osteoblastok 2 3 óra elteltével elkezdték felvenni a partikulumokat, és 24 48 óra után szaturálódtak. A folyamat közben mindvégig magas maradt az AP pozitivitásuk, amely mutatja, hogy megőrizték az osteoblast fenotípusukat a phagocytosis során (1. ábra). 1. ábra A phagocytosis és az AP-pozitivitás vizsgálata primer humán osteoblast sejteken. A sejteket vizsgáltuk kezelés nélkül (A) és fluoreszcens partikulum (1 µm átmérő) stimuláció után (B) fluoreszcens mikroszkóppal. Jól látható a phagocytált partikulumok konglomerációja a sejtmag körül miközben kifejezett AP pozitivitást mutattak a sejtek. 156 Magyar Traumatológia, Ortopédia, Kézsebészet, Plasztikai Sebészet 2006. 49. 2.

Osteoblast specifikus gének expressziója partikulum jelenlétében Mivel napjainkban elfogadottá vált, hogy a periprotetikus osteolysis patogenezisében kulcsszerepe van a kopási törmeléknek, ezért teszteltük a hatását a csont specifikus gének expressziójára, mint az osteoblast egyik legmarkánsabb funkciójára. Kísérleteinkben négy gén expresszióját vizsgáltuk: prokollagén α1[i], AP, osteocalcin (OC) és osteonectin (ON). A humán osteoblast sejtvonalak mindegyikénél a prokollagén α1[i] gén expressziója szignifikáns mértékben gátlódott kopási partikulum jelenlétében, függetlenül azok anyagi öszszetételétől, bár különböző dózis volt szükséges a hasonló hatás eléréséhez. Érdekes módon, ugyanezen anyagok nem befolyásolták az OC, AP és ON gének expresszióját, jelezve, hogy a partikulum hatás génspecifikus, legalábbis e négy gén között (2. A ábra). A primer osteoblastok ezzel szemben nem csak a prokollagén α1[i] gén szuppressziójával válaszoltak a partikulum kezelésre, hanem az ON expressziója is jelentősen csökkent (2. B ábra). 2. ábra Osteoblast specifikus gén expresszió kopási törmelék jelenlétében humán osteoblast sejtvonal (A) és primer osteoblastok (B) esetében. A kopási törmelék típusától függetlenül szignifikánsan csökkentette a prokollagén α1[i] gén expresszióját mindkét sejttípus esetében, míg az ON gén expressziója csak a primer humán osteoblast sejtek esetében gátlódott. A különbség minden esetben szignifikáns volt (p<0.05). Az alkalmazott partikulum koncentráció 0,1% volt. Az osteoblast specifikus proteinek termelése partikulum jelenlétében A génexpresszió megváltozásával feltételezhető, hogy az adott protein szintézise is csökken. Mivel a csont extracellularis mátrixát alkotó proteinek közül az I-es típusú kollagén fordul elő a legnagyobb mennyiségben, ezért rutinszerűen ennek a szekrécióját mértük, a többi vizsgált gén által kódolt proteinek alkalomszerű mérése mellett. Az osteoblastok kollagén szintézise, hasonló mértékben a génexpresszióhoz, szignifikánsan csökkent. Az osteoblastok citokin termelése partikulum jelenlétében Az osteoblastok viszonylag széles spektrumban bocsátanak ki citokineket, növekedési faktorokat, illetve egyéb anyagokat külső stimulus hatására. Ezek többsége osteotrop hatással bír autokrin, vagy parakrin módon. A tesztelt komponensek közül mi az IL 6 (3. ábra) és TGF β1 szint szignifikáns emelkedését találtuk, ha az osteoblastok interakcióba kerültek a kopási törmelékkel. Az IL 6 egy potens osteoclast aktiváló citokin, tehát ez a jelenség a csontfelszívódást erősíti. A szekretált TGF β1 pedig egy autokrin kompenzáló hatás lehet, mivel ennek a növekedési faktornak kifejezetten pozitív hatása van több osteoblast funkcióra. A kísérletek folyamán sem a nyugvó, sem az általunk aktivált osteoblastok nem termeltek mérhető mennyiségű TNF α-t. Magyar Traumatológia, Ortopédia, Kézsebészet, Plasztikai Sebészet 2006. 49. 2. 157

A kopási törmelék által kiváltott intracelluláris jelátvivő mechanizmuok Ezt követően vizsgáltuk, hogy a partikulum sejt interakció milyen sejten belüli szignál folyamatot aktivál, ami következményesen stimulál olyan transzkripciós faktort, faktorokat, mely/ek képesek befolyásolni a prokollagén α1[i] gén expresszióját. Pár perces kezelési idő után már Western blottal detektálható protein tirozin kináz (PTK) aktivációt találtunk. A legkülönfélébb transzkripciós faktorok képesek aktiválódni a PTK rendszeren keresztül, beleértve a nuclear factor kappa B-t (NF κb) is, mely transzkripciós faktor centrális szerepet foglal el az immunológiai, proinflammatorikus, stressz és egyéb rapid válaszreakciókban. Valóban, a partikulumnak kitett sejtekben gyors NF κb aktivációt tapasztaltunk gél shift vizsgálatok során. Ez viszonylag specifikus volt, mivel egyéb, az osteoblastokban fontos és a prokollagén α1[i] gén expresszióját befolyásoló transzkripciós faktorok (pl.: AP 1 és Sp1) nem aktiválódtak. Az osteoblastok normális funkcióinak visszaállítása 3. ábra Az osteoblastok in vitro IL 6 termelése partikulum jelenlétében 72 órás kezelést követően. Mindegyik partikulum típus szignifikánsan (p<0.05) növelte az IL 6 szekréciót mind az osteoblast sejtvonalak, mind a primer sejtek esetében. Az alkalmazott partikulum koncentráció 0,1% volt. A fentiek alapján három stratégiát alkalmaztunk az osteoblastok funkcióinak a visszaállítására. Az elsőben olyan növekedési faktorokat használtunk, amelyek stimulálják azokat a funkciókat, amelyeket a partikulum gátol, tehát kompenzáló hatással bírnak. A másodikban a specifikusan aktiválódott jelátviteli molekulákat gátoltuk, ezáltal blokkolva a kopási törmelék hatását. A harmadikban pedig olyan anyagokat használtunk, amelyek gyógyszerként már használatosak olyan betegségekben, ahol a csont metabolizmus megváltozása a probléma. A növekedési faktorok BMP 7, IGF 1 és TGF β1 jelentős mértékben növelték a prokollagén α1[i] gén expresszióját, sőt a partikulum hatást képesek voltak teljesen ellensúlyozni (4. ábra). Emellett pozitív hatásuk volt a sejtek proliferációjára is, míg eközben nem fokozták az IL 6 szintézisét, de nem is gátolták azt. Partikulum kezelés mellett PTK aktiválódást gátló anyagokat (pl.: genistein) használtunk, melyek megakadályozták a kopási törmelék előidézte NF κb komplex aktiválódást és normális prokollagén α1[i] gén expressziót kaptunk. Ezt követően NF κb gátló anyagokat (pl.: PDTC) használtunk törmelék stimuláció mellett. Ez esetben a PTK rendszer aktiválódott, de az NF κb komplex nem tudta kifejteni hatását és így elmaradt a prokollagén α1[i] gén gátlása is (4. ábra). Ezek a komponensek lényegileg blokkolták az osteoblastok partikulum stimulálta IL 6 szintézisét is. A biszfoszfonát pamidronát és a D vitamin származék calcitriol többféle betegségben alkalmazott gyógyszer. A calcitriol osteoblastra gyakorolt hatásai ismertek, általánosságban fokozza az osteoblast funkciókat (37). Ezt használtuk ki, mivel partikulum stimuláció mellett is kedvező hatással volt az osteoblast specifikus gének expressziójára, míg az IL 6 szintézist teljesen blokkolta. A biszfoszfonátok osteoblastra gyakorolt hatásai nem igazán ismertek, amíg köztudottan gátolják az osteoclastok funkcióit. Először vizsgáltuk a pamidronát hatását a nyugvó osteoblast funkcióira. Ezt követően törmelékkel kezelt osteoblastokon vizsgáltuk 158 Magyar Traumatológia, Ortopédia, Kézsebészet, Plasztikai Sebészet 2006. 49. 2.

hatásait, ahol a legjelentősebb eredményt a csont specifikus gének csökkent expressziójának a normalizálásában láttuk. Emellett ez a komponens is blokkolta az IL 6 szintézisét (4. ábra). MEGBESZÉLÉS Az ízületi implantátum aszeptikus lazulása a legalaposabb sebészeti technika mellett is egy fenyegető hosszú távú szövődmény. A hazai gyakorlatban is egyre többször kell szembenézni ezzel a klinikai problémával. Annak ellenére, hogy a folyamat patogenezise teljességgel még nem tisztázott, azt biztonsággal állíthatjuk, hogy a kopási törmelék és az implantátum környezetében lévő sejtek interakciója egy rendkívül fontos lépés e probléma kialakulásában. Ahogy egyre több adat áll rendelkezésre a kopási törmelék által kiváltott biológiai válaszreakciókról, 4. ábra Farmakológiai anyagok hatása a prokollagén α 1[I] gén expressziójára. A kopási törmeléket itt tiszta titán partikulummal (Ti) modelleztük, mely mellett növekedési faktorokat, speciális inhibitorokat és ismert gyógyszereket adtunk a sejtkultúrákhoz. A partikulum szignifikánsan (p<0.05) csökkentette a gén expresszióját, az alkalmazott szerek viszont a kezeletlen szintre fordították azt vissza. Az alkalmazott koncentrációkat és rövidítéseket lásd a módszerek részben. úgy válik valószínűbbé a gyógyszeres beavatkozás lehetősége a periprotetikus csontvesztés kialakulásában. A partikulum által aktivált intracellularis jelátvivő rendszerek meghatározása, valamint specifikus molekulák és mechanizmusok megnevezése, melyeknek fontos szerepük van a kopási anyag okozta csontfelszívódásban (4, 9, 15, 17, 18, 23, 25, 26, 27, 29, 30, 33, 42, 47), lehetőséget teremt arra, hogy a gyógyszeres beavatkozás célmolekuláit megtaláljuk. Néhány ezek közül már sikerrel tesztelésre is került a periprotetikus osteolysis állatmodelles kísérleteiben (6, 7, 8, 13, 28, 35). Azonban nem szabad elfelejtenünk azt, hogy ezek a kísérletek mind a csontfelszívódás megakadályozására fókuszáltak, míg a csont metabolizmus egyensúlyát képező csontformálást elhanyagolták. A csontháztartás normális egyensúlyát a csontépítés és lebontás ciklikussága határozza meg, amik normális esetben is alternálva követik egymást az egész skeletonon belül egy rendkívül komplex rendszer által reguláltan. Logikus feltevés tehát, hogy a csont metabolizmusnak nem csak a katabolikus, hanem az anabolikus oldala is érintett olyan kóros állapotokban, mint amit a periprotetikus térben is találunk. Jelen tanulmányunkban is demonstráltuk, hogy kopási törmelék jelenlétében az osteoblastok csontképző funkciója csökken, mivel szignifikánsan kevesebb mátrix molekulát képesek szintetizálni. Emellett olyan anyagokat is termelnek, amik erőteljes osteoclast aktiváló hatással bírnak. Ezek a folyamatok az alapját képezik, illetve nyilvánvalóan fokozzák az osteoclastok mediálta csont felszívódást. A klinikai gyakorlatban már eddig is többféle gyógyszer használatos a kedvező csont metabolizmus és turnover eléréséhez a csontanyagcserét érintő különböző elváltozásokban. A periprotetikus osteolysis speciális szituáció több aspektusból is. A csontanyagcsere ebben az esetben lényegileg csak egy adott ponton, lokálisan változik meg. Emellett a patomechanizmusa nagyon komplex, nem egy definitív komponens megváltozása eredményezi ezt a kóros szituációt. Ennek megfelelően farmakológiai anyagok felhasználása is összetett feladat, mivel több folyamatot kell módosítani, amelyek az osteolysishez vezetnek. A jelen tanulmányban több szinten próbáltuk az osteoblastok funkcióját teljessé tenni partikulum jelenlétében. Bizonyos növekedési faktoroknak ismert a csontképzésre gyakorolt Magyar Traumatológia, Ortopédia, Kézsebészet, Plasztikai Sebészet 2006. 49. 2. 159

stimuláló hatása. Ezek nem specifikusan a törmelék ellen hatnak, hanem kompenzálják annak hatását, tehát a kettő mintegy kioltja egymást. A mi esetünkben a TGF β1, IGF 1 és BMP 7 hatékonyan semlegesítették a partikulum hatását az osteoblastokon. A kopási törmelék által aktivált intracelluláris jelátvivő rendszerek ismeretében lehetőség van a partikulum hatását specifikusan blokkolni. Az osteoblastok esetében a PTK NF κb tengely tehető felelőssé a csökkent I-es típusú kollagén szintézisért. A PTK aktiválódást genisteinnel blokkoltuk, ami egy flavonid származék, és a természetes forrása a szója. Korábban több tanulmány vizsgálta már a hatását a csontháztartásra és azt találták, hogy általánosságban anabolikus hatással bír. Ez a jelen kérdéskör esetében külön előnyös, hiszen egyrészt specifikusan blokkolja a partikulum osteoblastra gyakorolt hatását, másrészről pedig kedvező hatása van a csontformálásra. Az NF κb transzkripciós faktor centrális szerepet foglal el az immunológiai, proinflammatorikus, stressz és egyéb rapid válaszreakciókban. Érdekes módon a partikulum stimuláció nem csak az osteoblastokban okozza ennek a transzkripciós faktornak az aktiválódását, hanem más sejttípusban is, illetve a periprotetikus osteolysis kialakulásában centrális szerepet tulajdonítanak neki (30). Kísérleteink kimutatták, hogy az NF κb gátlása blokkolja a partikulum hatását osteoblastokban is. Erre a célra mi a PDTC nevű vegyületet alkalmaztuk, ami erős antioxidáns hatással is bír (27, 42). Itt is meg kell említeni, hogy az NF κb-nek ezen a specifikus aktiválódásán kívül általános befolyásoló hatása is van a csontanyagcserére. Az NF κb gént nem tartalmazó egerek osteopetrosisban szenvednek (1), míg az NF κb túlműködése osteoclast aktivációt eredményez egy nemrég felfedezett molekulacsoport aktiválódása által (receptor activator of nuclear factor-kappab [RANK] és a ligandja: RANKL). Bizonyos sejtek (pl.: osteoblast) a sejtfelszínen expresszálják a RANKL-t, ami aktiválja az osteoclast felszínén lévő RANK-t, ami aztán NF κb és osteoclast aktivációt, majd pedig csontfelszívódást eredményez (34). A RANK/RANKL rendszer gátlásával sikerült megakadályozni állatkísérletekben a periprotetikus osteolysis kialakulását (8). Mivel a partikulumon kívül a TNF α is centrális szerepet tölt be a periprotetikus osteolysis kialakulásában (30), valamint a RANK/ RANKL rendszer aktiválódásának is ez a citokin az egyik legerősebb motorja, ezért az anti- TNF α terápia (pl. etanercept, imfliximab) is célpontja lehet a gyógyszeres beavatkozásnak, melyet kísérletesen több ízben is teszteltek már (6, 7). A biszfoszfonát terápia lehetősége a periprotetikus osteolysisben nem új keletű, több tanulmány is foglalkozott vele (2, 24, 31, 38, 45), de azok nem vizsgálták az osteoblastokra gyakorolt hatását. A biszfoszfonátok osteoblast specifikus hatásairól igen kevés információ áll rendelkezésre, mindamellett, hogy széles körben alkalmazzák különböző klinikai elváltozásokban (11). A jelen tanulmányban a pamidronáttal elért eredményeink biztatóak, hiszen primer humán osteoblastokban több csont mátrix molekula expresszióját volt képes normalizálni partikulum jelenlétében. Ezen túlmenően blokkolta a sejtek IL 6 termelését is, ezáltal gátolva a parakrín osteoclast aktiválás lehetőségét (39). Ezek mellett természetesen a pamidronátnak is megvan a biszfoszfonátokra jellemző osteoclast gátló hatása is egy esetleges terápiás felhasználás esetén. Ismert továbbá a pamidronátnak a fent leírt RANK/RANKL rendszer gátló hatása is (43), ami szintén kedvező hatással bírhat. A calcitriol osteoblastra gyakorolt hatásai jól karakterizáltak (37), azonban klinikai felhasználásáról megoszlanak a vélemények, hiszen hosszú távú felhasználás esetén hipercalcaemiát és hipercalcuriát okozhat (5). Kutatási eredményeink azt mutatták, hogy az 1,25(OH) 2 vitamin D 3 jelentős mértékben fokozta a mátrix proteinek szintézisét, olyannyira, hogy kompenzálta a partikulum hatását. A calcitriol emellett blokkolta a partikulum indukálta IL-6 szekréciót is hasonlóan a pamidronáthoz (39). A pamidronát és a calcitriol kombinációja a jelen 160 Magyar Traumatológia, Ortopédia, Kézsebészet, Plasztikai Sebészet 2006. 49. 2.

tanulmányban hatékonyabban semlegesítette a partikulum hatását, mintha külön használtuk volna, ami kisebb calcitriol dózist is jelentett, tehát a potenciális mellékhatások tekintetében is kedvezőbb helyzetet teremtve, melyet korábban más aspektusból is megfigyeltek (10, 39). Jelenleg az aszeptikus lazulás diagnózisát a klinikai tünetek és röntgenlelet alapján lehet biztosan felállítani. Ennek hátránya, hogy ekkor már a probléma a végstádiumban van, tehát a megelőzés nem lehetséges, csak az implantátum revíziója. Ennek megfelelően igény van az implantátum rögzítettségének és biológiai fixációjának folyamatos monitorozására olyan technika segítségével, amely 1) rutinszerűen elvégezhető, 2) minimál invazív eljárás és 3) minden beteg rendelkezésére áll. A célja egy ilyen szűrőrendszernek az, hogy még a klinikai tünetek megjelenése előtt lehetőség legyen prognosztizálni az esetleges aszeptikus lazulást. Természetesen a korai diagnózis és patomechanizmus ismeretében lehetőség nyílik farmakológiai beavatkozásra is. A fent leírt terápiás lehetőségek sok kérdést vetnek fel. Egyrészt, hogy a gyógyszeres beavatkozás milyen szinten alkalmazható, azaz a prevencióban, vagy a terápiában lehet e relevanciája. A prevenció kérdése azért nehéz, mert sok esetben jelenleg sincs rá szükség, az aszeptikus lazulás sem érint minden protetizált beteget, továbbá a partikulum betegség mellett ez is multifaktoriális probléma. Kérdés továbbá, mind a prevenció, mind a kezelés esetében, hogy lokális vagy szisztémás alkalmazásra van-e szükség, illetve, hogy melyik a jobban kivitelezhető. Talán a legcélszerűbb volna lokálisan bejuttatni a primer műtét idején egy farmakológiai ágenst, mint a prevenció részét, majd az implantált betegpopulációban, ahol a csontvesztés bizonyítást nyert, időben el lehetne kezdeni a terápiát még a klinikai és a röntgentünetek megjelenése előtt. IRODALOM 1. Abu-Amer Y., Tondravi M. M.: NF-kappaB and bone: the breaking point. Nat. Med. 1997. 3: 1189-1190. 2. Astrand J., Aspenberg P.: Reduction of instability-induced bone resorption using bisphosphonates: high doses are needed in rats. Acta Orthop. Scand. 2002. 73: 24-30. 3. Blacker G. J., Charnley J.: Changes in the upper femur after low friction arthroplasty. Clin. Orthop. 1978. 137: 15-23. 4. Blaine T. A., Pollice P. F., Rosier R. N., Reynolds P. R., Puzas J. E., O Keefe R. J.: Modulation of the production of cytokines in titanium-stimulated human peripheral blood monocytes by pharmacological agents. J. Bone Joint Surg. 1997. 79-A: 1519-1528. 5. Brown A. J.: Therapeutic uses of vitamin D analogues. Am. J. Kidney Dis. 2001. 38: S3-S19. 6. Childs L. M., Goater J. J., O Keefe R. J., Schwarz E. M.: Effect of anti-tumor necrosis factor-alpha gene therapy on wear debris- induced osteolysis. J. Bone Joint Surg. 2001. 83-A: 1789-1797. 7. Childs L. M., Goater J. J., O Keefe R. J., Schwarz E. M.: Efficacy of etanercept for wear debris-induced osteolysis. J. Bone Miner. Res. 2001. 16: 338-347. 8. Childs L. M., Paschalis E. P., Xing L., Dougall W. C., Anderson D., Boskey A. L., Puzas J. E., Rosier R. N., O Keefe R. J., Boyce B. F., Schwarz E. M.: In vivo RANK signaling blockade using the receptor activator of NF- kappab:fc effectively prevents and ameliorates wear debris-induced osteolysis via osteoclast depletion without inhibiting osteogenesis. J. Bone Miner. Res. 2002. 17: 192-199. 9. Clohisy J. C., Teitelbaum S., Chen S., Erdmann J. M., Abu-Amer Y.: Tumor necrosis factor-alpha mediates polymethylmethacrylate particle- induced NF-kappaB activation in osteoclast precursor cells. J. Orthop. Res. 2002. 20: 174-181. 10. Erben R. G., Mosekilde L., Thomsen J. S., Weber K., Stahr K., Leyshon A., Smith S. Y., Phipps R.: Prevention of bone loss in ovariectomized rats by combined treatment with risedronate and 1α.25-dihydroxyvitamin D 3. J. Bone Miner. Res. 2002. 17: 1498-1511. 11. Fleisch H.: Bisphosphonates: mechanisms of action. Endocr. Rev. 1998. 19: 80-100. Magyar Traumatológia, Ortopédia, Kézsebészet, Plasztikai Sebészet 2006. 49. 2. 161

12. Fritz E. A., Glant T. T., Vermes C., Jacobs J. J., Roebuck K. A.: Titanium particles induce the immediate early stress responsive chemokines IL-8 and MCP-1 in osteoblasts. J. Orthop. Res. 2002. 20: 490-498. 13. Goater J. J., O Keefe R. J., Rosier R. N., Puzas J. E., Schwarz E. M.: Efficacy of ex vivo OPG gene therapy in preventing wear debris induced osteolysis. J. Orthop. Res. 2002. 20: 169-173. 14. Goldring S. R., Schiller A. L., Roelke M., Rourke C. M., O Neill D. A., Harris W. H.: The synovial-like membrane at the bone-cement interface in loose total hip replacements and its proposed role in bone lysis. J. Bone Joint Surg. 1983. 65-A: 575-584. 15. Greenfield E. M., Bi Y., Ragab A. A., Goldberg V. M., Van De Motter R. R.: The role of osteoclast differentiation in aseptic loosening. J. Orthop. Res. 2002. 20: 1-8. 16. Hallab N. J., Merritt K., Jacobs J. J.: Metal sensitivity in patients with orthopedic implants. J. Bone Joint Surg. 2001. 83-A: 428-436. 17. Haynes D. R., Crotti T. N., Potter A. E., Loric M., Atkins G. J., Howie D. W., Findlay D. M.: The osteoclastogenic molecules RANKL and RANK are associated with periprosthetic osteolysis. J. Bone Joint Surg. 2001. 83-B: 902-911. 18. Horowitz S. M., Algan S. A., Purdon M. A.: Pharmacologic inhibition of particulate-induced bone resorption. J. Biomed. Mater. Res. 1996. 31: 91-96. 19. Jacobs J. J., Roebuck K. A., Archibeck M., Hallab N. J., Glant T. T.: Osteolysis: Basic Science. Clin. Orthop. 2001. 393: 71-77. 20. Jacobs J. J., Skipor A. K., Patterson L. M., Hallab N. J.: A prospective, controlled, longitudinal study of metal release in patients undergoing primary total hip arthroplasty. J. Bone Joint Surg. 1998. 80-A: 1444-1458. 21. Jacobs J. J., Urban R. M., Glant T. T., Galante J. O.: Clinical implications of osteolysis. In: Galante J. O., Rosenberg A., Callaghan J. J. (Eds.) Total hip revision surgery. New York. Raven Press. 1995. 81-90. p. 22. Jiranek W. A., Machado M., Jasty M., Jevsevar D., Wolfe H. J., Goldring S. R., Goldberg M. J., Harris W. H.: Production of cytokines around loosened cemented acetabular components. Analysis with immunohistochemical techniques and in situ hybridization. J. Bone Joint Surg. 1993. 75-A: 863-879. 23. Merkel K. D., Erdmann J. M., McHugh K. P., Abu-Amer Y., Ross F. P., Teitelbaum S. L.: Tumor necrosis factor-α mediates orthopedic implant osteolysis. Am. J. Pathol. 1999. 154: 203-210. 24. Millett P. J., Allen M. J., Bostrom M. P.: Effects of alendronate on particle-induced osteolysis in a rat model. J. Bone Joint Surg. 2002. 84-A: 236-249. 25. Nakashima Y., Sun D.-H., Trindade M. C. D., Maloney W. J., Goodman S. B., Schurman D. J., Smith R. L.: Signaling pathways for tumor necrosis factor-alpha and interleukin-6 expression in human macrophages exposed to titanium alloy particulate debris in vitro. J. Bone Joint Surg. 1999. 81-A: 603-615. 26. Pollice P. F., Rosier R. N., Looney R. J., Puzas J. E., Schwarz E. M., O Keefe R. J.: Oral pentoxifylline inhibits release of tumor necrosis factor-alpha from human peripheral blood monocytes : a potential treatment for aseptic loosening of total joint components. J. Bone Joint Surg. 2001. 83-A: 1057-1061. 27. Roebuck K. A., Vermes C., Carpenter L. R., Fritz E. A., Ramesh N., Glant T. T.: Downregulation of procollagen a1[i] mrna expression by titanium particles correlates with NF-κB activation and increased Rel A and NF-κB1 binding to the collagen promoter. J. Bone Miner. Res. 2001. 16: 501-510. 28. Schwartz E. M., Benz E. B., Lu A. P., Goater J., Mollano A. V., Rosier R. N., Puzas J. E., O Keefe R. J.: Quantitative small-animal surrogate to evaluate drug efficacy in preventing wear debris-induced osteolysis. J. Orthop. Res. 2000. 18: 849-855. 29. Schwartz Z., Lohmann C. H., Vocke A. K., Sylvia V. L., Cochran D. L., Dean D. D., Boyan B. D.: Osteoblast response to titanium surface roughness and 1alpha,25- (OH)(2)D(3) is mediated through the mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway. J. Biomed. Mater. Res. 2001. 56: 417-426. 30. Schwarz E. M., Lu A. P., Goater J. J., Benz E. B., Kollias G., Rosier R. N., Puzas J. E., O Keefe R. J.: Tumor necrosis factor-α/nuclear transcription factor-kb signaling in periprosthetic osteolysis. J. Orthop. Res. 2000. 18: 472-480. 31. Shanbhag A. S., Hasselman C. T., Rubash H. E.: Inhibition of wear debris mediated osteolysis in a canine total hip arthroplasty model. Clin. Orthop. 1997. 344: 33-43. 32. Shanbhag A. S., Jacobs J. J., Glant T. T., Gilbert J. L., Black J., Galante J. O.: Composition and morphology of wear debris in failed uncemented total hip replacement arthroplasty. J. Bone Joint Surg. 1994. 76-B: 60-67. 162 Magyar Traumatológia, Ortopédia, Kézsebészet, Plasztikai Sebészet 2006. 49. 2.

33. Soloviev A., Schwarz E. M., Kuprash D. V., Nedospasov S. A., Puzas J. E., Rosier R. N., O Keefe R. J.: The role of p105 protein in NFkB activation in ANA-1 murine macrophages following stimulation with titanium particles. J. Orthop. Res. 2002. 20: 714-722. 34. Theill L. E., Boyle W. J., Penninger J. M.: RANK-L and RANK: T cells, bone loss, and mammalian evolution. Annu. Rev. Immunol. 2002. 20: 795-823. 35. Ulrich-Vinther M., Carmody E. E., Goater J. J., balle S., O Keefe R. J., Schwarz E. M.: Recombinant adenoassociated virus-mediated osteoprotegerin gene therapy inhibits wear debris-induced osteolysis. J. Bone Joint Surg. 2002. 84-A: 1405-1412. 36. Urban R. M., Jacobs J. J., Tomlinson M. J., Gavrilovic J., Black J., Peoc h M.: Dissemination of wear particles to the liver, spleen and abdominal lymph nodes of patients with hip or knee replacement. J. Bone Joint Surg. 2000. 82-A: 457-477. 37. van Leeuwen J. P., van Driel M., van den Bemd G. J., Pols H. A.: Vitamin D control of osteoblast function and bone extracellular matrix mineralization. Crit. Rev. Eukaryotic Gene Expr. 2001. 11: 199-226. 38. Venesmaa P. K., Kroger H. P., Miettinen H. J., Jurvelin J. S., Suomalainen O. T., Alhav E. M.: Alendronate reduces periprosthetic bone loss after uncemented primary total hip arthroplasty: a prospective randomized study. J. Bone Miner. Res. 2001. 16: 2126-2131. 39. Vermes C., Chandrasekaran R., Dobai J., Jacobs J. J., Andersson G. B. J., An H., Hallab N. J., Galante J. O., Glant T. T.: The combination of pamidronate and calcitriol reverses particle- and TNF-α-induced altered functions of bone-marrow-derived stromal cells with osteoblastic phenotype. J. Bone Joint Surg. 2004. 86-B: 759-770. 40. Vermes C., Chandrasekaran R., Jacobs J. J., Galante J. O., Roebuck K. A., Glant T. T.: The effects of particulate wear debris, cytokines, and growth factors on the functions of MG-63 osteoblasts. J. Bone Joint Surg. 2001. 83-A: 201-211. 41. Vermes C., Glant T. T., Hallab N. J., Fritz E. A., Roebuck K. A., Jacobs J. J.: The potential role of the osteoblast in the development of periprosthetic osteolysis: Review of in vitro osteoblast responses to wear debris, corrosion products, and cytokines and growth factors. J. Arthroplasty, 2001. 16: 95-100. 42. Vermes C., Roebuck K. A., Chandrasekaran R., Dobai J. G., Jacobs J. J., Glant T. T.: Particulate wear debris activates protein tyrosine kinases and nuclear factor-kappa B which downregulates type I collagen synthesis in human osteoblasts. J. Bone Miner. Res. 2000. 15: 1756-1765. 43. Viereck V., Emons G., Lauck V., Frosch K. H., Blaschke S., Grundker C., Hofbauer L. C.: Bisphosphonates pamidronate and zoledronic acid stimulate osteoprotegerin production by primary human osteoblasts. Biochem. Biophys. Res. Commun. 3-1-2002. 291: 680-686. 44. Wang W., Ferguson D. J. P., Quinn J. M. W., Simpson A. H. R. W., Athanasou N. A.: Biomaterial particle phagocytosis by bone-resorbing osteoclasts. J. Bone Joint Surg. 1997. 79-B: 849-856. 45. Wilkinson J. M., Stockley I., Peel N. F., Hamer A. J., Elson R. A., Barrington N. A., Eastell R.: Effect of pamidronate in preventing local bone loss after total hip arthroplasty: a randomized, double-blind, controlled trial. J. Bone Miner. Res. 2001. 16: 556-564. 46. Yao J., Glant T. T., Lark M. W., Mikecz K., Jacobs J. J., Hutchinson N. I., Hoerrner L. A., Kuettner K. E., Galante J. O.: The potential role of fibroblasts in periprosthetic osteolysis: fibroblast response to titanium particles. J. Bone Miner. Res. 1995. 10: 1417-1427. 47. Zhang X., Morham S. G., Langenbach R., Young D. A., Xing L., Boyce B. F., Puzas E. J., Rosier R. N., O Keefe R. J., Schwarz E. M.: Evidence for a direct role of cyclo-oxygenase 2 in implant wear debris- induced osteolysis. J. Bone Miner. Res. 2001. 16: 660-670. Dr. Vermes Csaba PTE, ÁOK, Ortopédiai Klinika 7624 Pécs, Ifjúság u. 13. Magyar Traumatológia, Ortopédia, Kézsebészet, Plasztikai Sebészet 2006. 49. 2. 163