Doktori értekezés tézisei AZ ANDROGÉNEK SZEREPE A KRÓNIKUS ALLOGRAFT NEPHROPATHIA KIALAKULÁSÁBAN Dr. Antus Balázs Semmelweis Egyetem, Kórélettani Intézet Témavezető: Prof. Dr. Rosivall László Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Budapest
1. Bevezetés A végstádiumú vesebetegség kezelésének a beteg számára a legjobb életminőséget biztosító formája a vesetranszplantáció. Az elmúlt két évtized során többek között a műtéti technika fejlődésének, az újabb és hatékonyabb immunszuppresszív gyógyszerek bevezetésének, a peri- és postoperatív betegellátás korszerűsödésének és nem utolsósorban a transzplantációs immunológia területén elért tudományos eredményeknek köszönhetően a sikeres vesetranszplantációk száma sokszorosára növekedett. Korábban az akut kilökődés megelőzése jelentette a legnagyobb feladatot a vesetranszplantáció után. Napjainkban a transzplantált vese elvesztésének leggyakoribb oka az ún. krónikus allograft nephropathia. A kórkép kialakulása során a vesefunkció fokozatosan beszűkül, proteinuria és hipertenzió jelenik meg, végül a folyamat progresszív vesefibrózishoz és végstádiumú vesebetegséghez vezet. A transzplantált vesében aspecifikus szöveti elváltozások figyelhetők meg: glomerulosclerosis, interstitialis fibrózis, tubularis atrófia és a graft artériáinak arteriosclerosisa. A krónikus allograft nephropathia kialakulásában mind alloantigén-dependens, mind pedig alloantigén-independens mechanizmusoknak szerepük van. Úgy tűnik, hogy a nem mint alloantigén-független tényező szintén befolyásolja a kórkép kialakulását. A klinikai tanulmányok egy része a férfi donorból származó vesetranszplantátumok hosszú távú túlélését kedvezőbbnek tartja a női donorból származó graftokhoz képest. A női recipiensekben ugyanakkor a krónikus allograft nephropathia előfordulása ritkább a férfi recipiensekhez képest. Hosszú évek óta elfogadott az a hipotézis, mely szerint a kisebb női vesék férfi recipiensbe történő transzplantációja során a transzplantált nephron mennyiség nem elegendő a nagyobb recipiens szervezet metabolikus igényeinek kielégítésére, ami a glomerulusok hiperfiltrációs károsodásához, illetve glomerulosclerosis kialakulásához vezet, és főként ez a mechanizmus felelős a női graftok rosszabb hosszú távú eredményeiért. A recipiens nemi különbözőségéből eredő hatások a feltételezések szerint részben az immunrendszer működésében fennálló nemi különbségeknek, részben pedig a nemi hormonok hatásainak tulajdoníthatóak. A nemi hormonok szabályozzák a glomerularis hemodinamikát, a mesangialis sejtek proliferációját és extracellularis mátrix szintézisét, valamint több olyan vazoaktív anyag, növekedési faktor és citokin termelődését, amelyek a krónikus vesebetegség patogenezisében meghatározó szerepet játszanak. A nemi hormonok ezenfelül számos cellularis és humoralis immunválasz szabályozásában is részt vesznek. Kísérleteink során egyrészt a nemi különbségek hátterét, különösen a tesztoszteron szerepét kívántuk pontosabban megismerni a krónikus allograft nephropathia patogenezise során. Másrészt, a hormonális rendszer befolyásolásán keresztül a terápiás beavatkozás lehetőségét kerestük az említett kórképben. 2. Célkitűzések Tudományos kutatómunkánk fő célkitűzése annak vizsgálata volt, hogy a donor neme, a hím nemi hormonok, valamint azok gátlása miként befolyásolják a krónikus
allograft nephropathia kialakulását a transzplantált vesében. Az értekezésben bemutatásra kerülő két kísérletsorozat során az alábbi hipotéziseket kívántuk vizsgálni. 1. A tesztoszteron elősegíti a krónikus allograft nephropathia kialakulását kasztrált és intakt hímpatkány recipiensekben. 2. A tesztoszteron receptor blokád, valamint a tesztoszteron-dihidrotesztoszteron átalakulásnak 5 -reduktáz inhibitorokkal történő gátlása csökkentik a krónikus allograft nephropathia progresszióját intakt hímpatkány recipiensekben. 3. A donor neme szerepet játszik a krónikus allograft nephropathia kialakulásában kasztrált és intakt hímpatkány recipiensekben. 3. Módszerek 3.1. Transzplantáció Kísérleteinket beltenyésztett, 200 250g súlyú Lewis (Lew, RT1) és Fisher (F344, RT1v1) patkányokon végeztük. Az első kísérletsorozatban hím és nőstény Fisher patkányok veséjét ortotóp módon kasztrált, míg a második kísérletsorozatban intakt hím Lewis patkányokba transzplantáltuk. Az állatokat a beültetést követő tíz napon át alacsony dózisú cyclosporinnal (1.5 mg/kg/d) kezeltük az akut kilökődés megelőzésére. A recipiens jobb oldali saját veséjét a 10. napon távolítottuk el. 3.2. Kísérleti protokoll A kasztrált recipienseket 4 kísérleti csoportba (8 állat/csoport) osztottuk a donor nemének és az alkalmazott hormon kezelésnek megfelelően: tesztoszteron kezelés és hím (T/H) vagy nőstény graft (T/N) vehiculum kezelés és hím (V/H) vagy nőstény graft (V/N). Az intakt recipienseket 8 kísérleti csoportba (8 állat/csoport) osztottuk a fentiekkel analóg módon: tesztoszteron kezelés és hím (T/H) vagy nőstény graft (T/N) vehiculum kezelés és hím (V/H) vagy nőstény graft (V/N) tesztoszteron receptor blokkoló flutamide kezelés és hím (FL/H) vagy nőstény graft (FL/N), valamint 5 reduktáz inhibitor finasteride kezelés és hím (FI/H) vagy nőstény graft (FI/N). 3.3. Funkcionális mérések Az állatok testsúlyát, valamint a 24 órás fehérjeürítést négy hetente, metabolikus ketrecek segítségével mértük. A 20. hét végén az állatokban meghatároztuk a kreatinin clearancet, valamint a szérum tesztoszteron és dihidrotesztoszteron koncentrációját, majd a hasi aortában artériás vérnyomást mértünk. Ezt követően az állatokat elvéreztettük, és a traszplantátumot további vizsgálatok céljából eltávolítottuk. 3.4. Szövettan és immunhisztokémia Szövettani vizsgálat céljából a 4%-os formalinban fixált vese mintákat paraffinba ágyaztuk, majd a metszeteket hematoxilin/eosin, Masson-féle trichrom, elastika és perjódsav-schiff reagenssel (PAS) festettük. A kiértékelés során a sclerotikus glomerulusok számát az ép glomerulusok számához viszonyítottuk (glomerulosclerosis
index). Az interstitialis fibrózist, a tubularis atrófiát és a transzplant vasculopathiát a Banff 97 klasszifikáció alapján határoztuk meg (Banff-score). Az immunhisztokémiai vizsgálat során a folyékony nitrogénben lefagyasztott szövetmintákból metszeteket (4 m) készítettünk, majd acetonnal fixáltuk. A CD5+ T- sejteket (OX19), valamint az ED1+ monocita/makrofágokat primer egér monoklonális antitestek felhasználásával az APAAP metodika szerint festettük meg. A pozitívan festődő sejtek számát sejt/látótér (sejt/lt) formában adtuk meg. 3.5. Molekuláris analízis A fagyasztott vesemintákból teljes RNS izoláció történt a módosított guanidineisothiocyanat módszer segítségével. A szövetmintákból kivont RNS-t oligo(dt) 12-18 primer segítségével reverz-transzkripcióval (RT) írtuk át complementer DNS (cdns) molekulává. A cdns-t specifikus primerek (Platelet-Derived Growth Factor-A és -B PDGF-A és -B ) segítségével polimeráz láncreakció (PCR) során amplifikáltuk. A PCR termékeket ethidium bromiddal festett agaróz gélben futattuk meg, és UV megvilágítása mellett tettük láthatóvá. A Transforming Growth Factor- 1 (TGF- 1) növekedési faktor intragraft mrns expresszióját RNase protection assay segítségével határoztuk meg. Az assay során a vesemintákból izolált teljes RNS-t olyan specifikus antisense szekveciákkal hibridizáltattuk, amelyeket radioaktív 32 P UTP jelenlétében egy T7 RNS polimeráz segítségével álllítottunk elő. Ezt követően a mintákat RNase A+T1 oldatban emésztettük. Az emésztett és emésztetlen RNS szekvenciákat egy 5%-os bisacrylamide gél elektroforézis segítségével választottuk el egymástól. Végül az emésztetlen RNS szekvenciák rádióaktivitását phosphorimaging analyser segítségével, denzitometriás úton mértük meg. A vizsgált faktorok mrns expresszióját a faktor és a GAPDH (belső kontroll) intenzitásának az arányában adtuk meg. 3.6. Statisztikai analízis Az adatok átlag±átlag szórás (Standard Error of Mean, SEM) formában szerepelnek. A parametrikus adatok összehasonlítása kétutas varienciaanalízissel, majd ezt követően a Newman-Keuls teszttel történt. A nem parametrikus adatokat a Kruskal-Wallis teszttel értékeltük ki. P<0.05 esetén tekintettük a különbségeket szignifikánsnak. 4.1. Első kísérletsorozat 4. Eredmények A tesztoszteron kezelés hatására mind a hím, mind a nőstény donorból allograftot kapott állatokban a 20. hétre súlyos proteinuria (T/H: 55.9 7.8 vs. V/H: 19.4 3.9 mg/24h T/N: 48.4 3.9 vs. V/N: 16.7 2.8 mg/24h) alakult ki, amit kiterjedt glomerulosclerosis (T/H: 29.2 5.8 vs. V/H:18.2 2.2 T/N: 28.3 4.9 vs. V/N: 16.6 3.2), ED1+makrofág sejtinfiltráció (T/H:27.7 2.6 vs. V/H: 16.6 2.5 T/N: 28.9 2.3 vs. V/N: 15.5 4.1), valamint a TGF- 1, PDGF-A és -B növekedési faktorok fokozott intragraft mrns expressziója kísért. A tubulointerstitium károsodása kifejezettebb volt a nőstény donorból származó transzplantátumok esetében (Banff score: T/N: 5.0 0.5 vs. V/N: 3.0 0.6). A CD5+ T-sejtek infiltrációját a tesztoszteron kezelés nem befolyásolta szignifikánsan.
A transzplantáció idején a donor-vesesúly/recipiens testsúly arány (vs/ts) kisebb volt azokban az állatokban, amelyek nőstény állatból származó graftot kaptak. Ennek ellenére a donor neme nem befolyásolta a krónikus allograft nephropathiára jellemző funkcionális és szövettani elváltozások kialakulását a vehiculummal kezelt állatok között (V/H, V/N). 4.2. Második kísérletsorozat A tesztoszteronnal kezelt és nőstény donorból allograftot kapott recipiensekben súlyos proteinuria (20. hét: T/N: 85.9 7.8 vs. V/N: 41.4 3.9 mg/24h) alakult ki, amit kiterjedt glomerulosclerosis (T/N: 42.1 9.3 vs. V/N: 25.9 3.1), interstitialis fibrózis és transzplant vasculopathia (Banff score: T/N: 6.3 1.2 vs. V/N: 2.9 0.4), valamint a TGF- 1, PDGF-A és -B növekedési faktorok fokozott intragraft mrns expressziója kísért. A tesztoszteron káros hatása közel azonos mértékű volt a hím donorból származó vesetranszplantátumokban. A tesztoszteron receptor blokkoló flutamide hatására mind a hím, mind a nőstény donorból graftot kapott állatokban csökkent a glomerulosclerosis (FL/H: 9.8 1.8 vs. V/H: 25.6 3.8 FL/N: 11.1 2.1 vs. V/N: 25.9 3.1), valamint az interstitialis fibrózis és a vascularis károsodások mértéke (Banff score: FL/H: 1.2 0.5 vs. V/H: 3.0 0.4 FL/N: 1.0 0.2 vs. V/N: 2.9 0.4). Az graftokban csökkent a ED1+ makrofág sejtinfiltráció (FL/H: 5.8 0.7 vs. V/H: 13.9 2.8; FL/N: 7.9 1.4 vs. V/N: 12.7 3.0), valamint a TGF- 1, PDGF-A és -B faktorok alacsonyabb mrns szintje volt megfigyelhető. A finasteride kezelés a flutamide-hoz hasonló mértékben csökkentette a krónikus allograft nephropathiára jellemző elváltozások mértékét. A finasteride kedvező hatást a graft neme nem befolyásolta. A tesztoszteronnal és a flutamide-dal kezelt állatokban a szérum tesztoszteron szint növekedett. A finasteride kezelés csökkentette a szérum dihidrotesztoszteron szintjét. A transzplantáció idején a vs/ts kisebb volt azokban az állatokban, amelyek nőstény állatból származó graftot kaptak. A donor neme azonban nem befolyásolta a funkcionális és szövettani elváltozások kialakulását a vehiculummal kezelt állatok között (V/H, V/N). 5. Következtetések 1. A donor neme nem befolyásolja a krónikus allograft nephropathia kialakulását. Eredményeink nem támogatják azt a korábbi hipotézist, mely szerint a graftok női neme fokozottabban hajlamosítana hiperfiltrációs károsodásra a férfi donorból származó vese allograftokhoz képest. 2. A tesztoszteron elősegíti a krónikus allograft nephropathia kialakulását hímpatkány recipiensekben. 3. A tesztoszteron receptor blokkoló flutamide csökkenti a krónikus allograft nephropathia progresszióját. 4. A tesztoszteron-dihidrotesztoszteron átalakulás gátlása az 5 -reduktáz inhibitor finasteride segítségével a tesztoszteron receptor blokádhoz hasonló terápiás hatású.
Az androgéneknek az allograft működésre gyakorolt káros hatásait a dihidrotesztoszteron közvetíti. 5. Az androgének gátlása mind hím, mind pedig nőstény donorból származó transzplantátumokon hasonló terápiás hatású. 6. Az értekezés tárgykörében megjelent saját közlemények és előadáskivonatok bibliográfiai adatai 6.1. Közlemények 1. Antus B, Mucsi I, Mozes M, Rosivall L. A transforming growth factor- és a vese. Hypert Nephrol 3: 72-79, 1999 2. Szabo A, Lutz J, Schleimer K, Antus B, Hamar P, Philipp Th, Heemann U. Effect of ACE inhibition on growth factor mrna in chronic renal allograft rejection in the rat. Kidney Int 57: 982-991, 2000 3. Antus B, Exton MS, Rosivall L. Angiotensin II: a regulator of inflammation during renal disease? Int J Immunopathol Pharmacol 14: 25-30, 4. Liu S, Lutz J, Antus B, Yao Y, Baik S, Illies F, Heemann U. Recipient age and weight affect chronic renal allograft rejection in rats. J Am Soc Nephrol 12: 1742-1749, 5. Antus B, Yao Y, Liu S, Song E, Lutz J, Heemann U. Contribution of androgens to chronic allograft nephropathy is mediated by dihydrotestosterone. Kidney Int 60, 1955-1963, 6.2. Előadáskivonatok 1. Heemann U, Lutz J, Zou H, Liu S, Antus B, Philipp Th. The effect of SDZ-RAD on ongoing chronic rejection in rat renal allograft. J Am Soc Nephrol 10: 703A, 1999 2. Antus B, Hamar P, Lutz J, Zou H, Liu S, Heemann U, Rosivall L. SDZ-RAD csökkenti a krónikus kilökődés progresszióját patkány vesében. Magyar Nephrologiai Társaság Nagygyűlése, 1999 3. Antus B, Liu S, Yao Y, Zou H, Lutz J, Heemann U. Progesterone promotes the development of chronic rejection. J Am Soc Nephrol 11: 658A, 2000 4. Lutz J, Torony E, Antus B, Illies F, Becker G, Schmid KW, Heemann U. Bcl-2 and bax mrna and apoptosis in kidneys after ischemia/reperfusion in mice. J Am Soc Nephrol 11: 494A, 2000 5. Hamar P, Regos A, Kokeny G, Antus B, Heemann U, Rosivall L. Early kidney graft function following transplantation in rats. Nephrol Dial Transplant 15: A243, 2000 6. Yao Y, Antus B, Liu S, Song E, Lutz J, Heemann U. Influence of sex hormones and androgen antagonists on chronic renal rejection in male intact rats. Nephrol Dial Transplant 15: A245, 2000 7. Risch K, Lutz J, Antus B, Lehmann M, Heemann U. Apoptosis and AT-receptor antagonists in acute renal allograft rejection. Nephrol Dial Transplant 16: A200, 8. Wang M, Yao Y, Liu S, Antus B, Zou H, Illies F, Lutz J, Heemann U. Recipient age affects chronic allograft nephropathy in rats. Nephrol
Dial Transplant 16: A203, 9. Hamar P, Regos A, Kokeny G, Antus B, Rosivall L. Injury caused by kidney perfusion significantly impairs graft function in rats. J Am Soc Nephrol 12, 858A, 10. Antus B, Yao Y, Liu S, Song E, Lutz J, Heemann U. Finasteride ameliorates chronic allograft nephropathy. J Am Soc Nephrol 12: 852A, 11. Song E, Antus B, Yao Y, Lutz J, Heemann U. Sequential activation patterns of macrophages in chronic allograft nephropathy. J Am Soc Nephrol 12: 868A, 12. Lutz J, Song E, Yao Y, Antus B, Heemann U. Early application of matrix metalloproteinase inhibitor ameliorates chronic allograft nephropathy in rats. J Am Soc Nephrol 12: 861A, 13. Liu S, Lutz J, Antus B, Yao Y, Baik S, Illies F, Heemann U. Recipient age and weight affect chronic allograft rejection in rats. J Am Soc Nephrol 12, 861A, 14. Antus B, Liu S, Yao Y, Zou H, Song E, Lutz J, Heemann U. Anti-estrogens promote chronic allograft nephropathy. J Am Soc Nephrol 12: 852A, 15. Antus B, Yao, Y, Liu S, Song E, Heemann U, Rosivall L. A tesztoszteron fokozza a transzplant vasculopathia es glomerulosclerosis kialakulását az allograft vesében. Magyar Hipertonia Társaság Nagygyűlése,