BIOFIZIKA Liliom Károly SE ÁOK Biofizikai és Sugárbiológiai Intézet karoly.liliom.mta@gmail.com
A biofizika előadások temafkája 1. 09-05 Biofizika bevezetés, szerkezet és funkció 1 2. 09-12 Szerkezet és funkció 2 3. 09-19 VBK dékáni szünet 4. 09-26 Kölcsönhatások jellemzése 5. 10-03 Szerkezet és funkció 3 6. 10-10 ZH-1 7. 10-15! elmarad 8. 10-17 Fehérjék: szerkezet és funkció 9. 10-24 Biológiai membránok 10. 11-07 Transzport biológiai membránokban 11. 11-14 Receptorok 12. 11-21 ZH-2 13. 11-28 Jelátvitel, pót-zh 14. 12-05 elmarad oktatas.ch.bme.hu/biofizika
A molekuláris biofizika módszerei Meg akarjuk érteni a biológiai rendszereket, az azokban zajló folyamatokat, elsősorban a sejt és sejtalkotó molekulák szintjén Hogyan épül fel SZERKEZET Hogyan működik FUNKCIÓ MAKROSZERKEZET (10-1000 nm): DINAMIKA: fénymikroszkóp (DIC) Konformáció és annak konfokális mikroszkóp megváltozása (CD és (kontraszt javítása) fluoreszcencia spektr., STED, PALM, STORM fluor. anizotrópia) (feloldóképesség jav.) Kötődési vizsgálatok MIKROSZERKEZET (1-100 nm): (fluoreszcencia spektr., X-ray, NMR, (atomi részletesség) fluor. anizotrópia, CD) Cryo-EM, szórásos technikák (alak) - különböző technikák...
Biológiai funkció = kölcsönhatás HOMOGÉN kölcsönhatás közege HETEROGÉN Fpikusan oldatban Fpikusan határfelületen ITC, fluoreszcencia spekt., FRET,... SPR, QCM, ELISA,... DIREKT kölcsönhatás követése INDIREKT egyik partner sem jelölt min. az egyik partner jelölt SPR, QCM, ITC, ELISA FRET, fluor. spekt., biofnilálás, His-tag EGYENSÚLY kölcsönhatás menete FOLYAMAT vég-pont esszék kinefkai esszék (lassú, egyszerű) (gyors, komplikált) ITC, termoforézis, ELISA,... SPR, QCM, stopped flow
kölcsönhatás = reakció
GMMA = global mulf-method analysis Biofizika 2016, Liliom Károly
Szerkezetmeghatározás főbb módszerei
NMR a fehérjeszerkezet meghatározásában N α mivel e E E kt α α E és β N β ezért e N E kt α β N β Külső mágneses térben a felesspinű magok energiafelhasadást szenvednek, a populációk eltérő betöltöxsége miax indukált mágnesezexség mérhető. -Rádiófrekvenciás segédtérrel kibillentjük a magokat és a relaxációt a segédtér tekercsében indukált áram időfüggésével követjük, ennek a függvénynek a Fourier-transzformáltja megadja a frekvenciaeltolódásokat, amelyek a felhasadási energiával arányosak. -Makromolekulák 1D-spektrumában összeolvadnak a jelek, korelációs technikák, többdimenziós spektrumok kellenek az egyes eltolódások hozzárendelésére a magokhoz (annotálás)...
NMR a fehérjeszerkezet meghatározásában Az annotációs folyamat: 1) Különböző korrelációs technikákkal megmérni a spinrendszereken belüli (egyes aminosavak) és közöz csatolásokat, amelyek kényszerfeltételeket adnak az egyes atomok szomszédsági és távolsági viszonyaira 2) Szükség van az aminosavsorrend ismeretére, amely további kényszerfeltételeket jelent A térszerkezet-építési folyamat: 1) Az annotáció ismeretében a kényszerfeltételek figyelembevételével megpróbálunk összerakni egy térszerkezetet, amelyiknek aztán visszafejtve konformnak kell lennie az ismert kényszerekkel 2) A lehetséges szerkezeteket egymásra ve{tve elfogadjuk a molekula modelljének Itera{v szerkezet-meghatározás mindig modell-építés
X-ray vs NMR a szerkezetmeghatározásban
Röntgen-krisztallográfia a fehérjeszerkezet meghatározásában modellépítés! A szórási adatokból elektron-sűrűségi térképet kapunk. Fel kell építenünk a fehérjénk ezzel kompafbilis modelljét. Minél nagyobb a felbontás, annál kisebb a bizonytalanság a pepfdváz és az oldalláncok koordinátáiban... Biofizika 2016, Liliom Károly
Cryo-EM a feltörekvő technika
Cryo-EM a feltörekvő technika
Cryo-EM ~2Å felbontás már elérhető Biofizika 2016, Liliom Károly
A tudomány módszertana valóság megfigyelés és kísérlet absztrakció = modell modell összevetése a valósággal = a modell megmagyarázza-e az ismert tényeket és megjósolhatók-e kísérlefleg ellenőrizhető, új, eddig nem ismert effektusok... pontosítox absztrakció = új á ogóbb érvényű modell (BIO)STATISZTIKA
Adatgyűjtés: Megfigyelés és Kísérlet Az adatgyűjtés mindkét esetben méréseket jelent A mérés a mérendő mennyiség közvetlen vagy közvetex összehasonlítása a mértékegységgel - eredménye soha nem lehet tökéletesen pontos A mérési eredmény szisztemafkus és véletlen hibákat tartalmaz - a szisztemafkus hibák egy része (hőmérséklef dri, kalibrációs hiba) a mérés gondos kivitelezésével kiküszöbölhető, a véletlen hibák a mérés sajátságai Következmény: a mérési (a kísérlef) eredményt a véletlen matemafkai törvényszerűségei (is) jellemzik!
A mérési eredmény stafszfkai változó Adox elemek összességét a bennünket érdeklő tulajdonságukat leíró numerikus adatokkal együx sta2sz2kai sokaságnak nevezzük. Általában a sokaság eloszlását, de legalább az eloszlást jellemző paramétereket akarjuk meghatározni, amihez mintát veszünk, ami a sokaság n számú elemének véletlenszerű kiválasztásából áll. Egy mérés (kísérlet vagy megfigyelés) mindig mintavételezés, eredménye (a laboratóriumi gyakorlatban majdnem mindig) egy folytonos eloszlású valószínűségi változó.
A mérési eredmény stafszfkai változó A mérés mindig mintavételezés, eredménye egy valószínűségi változó adox értéke. n-szer megismételt mérés eredménye n számú egymástól független és azonos eloszlású valószínűségi változó. (DE: megismételt mérések eredményei (párhuzamosok) akkor tekinthetők független mintavételnek, ha a megismételt mérés új preparátumon történt) Bármely sta8sz8kai jellemző, amelyet az adatainkból számolunk maga is sta8sz8kai változó!!!
A mérési eredmény mint várható érték A mért mennyiség valódi (meghatározandó) értékének az eloszlás várható értékét tekintjük. Az eloszlás paramétereit is csak a mérési adatokból tudjuk becsülni tehát azok is valószínűségi változók! 1.4 valódi érték 1.3 szisztemafkus hiba 1.2 1.1 véletlen hibák 1.0 0.9 várható érték 0.8 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 A véletlen mérési hibák többsége normális eloszlású!
Normális eloszlás a mérési eredményekből n = 20 50 100 500 "n" a biológiai mérésekben 8pikusan 3-5 közöh van!!!
A mérési eredmény mint stafszfkai minta kis n esetén (Fpikusan n<10) A normális eloszlású alapsokaságból véletlenszerűen kiválasztox minta - tehát a kísérlef adatok - ~95%-a az átlagértéktől számítox ± 2σ tartományba esik. Ez kb azt jelenf, hogy 100 mérésből átlagosan 5 eredményez kiszóró pontot, feltéve, hogy a mérés szisztemafkus hibától vagy egyéb torzítástól mentes! Következmény: 3-5 párhuzamosban valószínűtlen a kiszóró pont! Ne dobjunk el kísérlef adatot alapos elemzés nélkül, hacsak nem vagyunk teljesen biztosak abban, hogy az adox mérés hibás volt! A biológiában mérési eredményeink gyakran normális vagy lognormális eloszlást követnek.
Regresszióanalízis Ha két változó közöx függvénykapcsolat van, annak {pusát és paramétereit akarjuk meghatározni. Általában az egyik mennyiség általunk determinált (vagy manipulált) és ezt tekintjük független változónak (például koncentráció, idő, stb). Természetesen a valóságban ez is stafszfkai változó (pipexázási hiba, időmérés pontatlansága), de ezt a regresszióanalízisnél nem tudjuk stafszfkailag megfelelően kezelni, ezért a független változó értékeit hibamentesnek tekintjük! 6 5 4 3 Általában azt a függvényt keressük, amire teljesül, hogy a mért és számítox értékek négyzetes eltérésösszege minimális (legkisebb négyzetek módszere): 2 1 Y = a + b*x a =!0.3458 b =!1.0013 R =!0.9561 0 0 1 2 3 4 5 6 n i=1 S = (y i f (x i )) 2 min
Nemlineáris regresszió n i=1 S = (y i f (x i )) 2 min Amennyiben a két változónk közöx nem lineáris a kapcsolat úgy két dolgot tehetünk: - megpróbáljuk a fügvénykapcsolatot visszavezetni a lineáris esetre, vagyis linearizálunk (ennek lényege az, hogy a regresszióanalízissel becsülni kívánt függvény-paraméterekre nézve elsőfokú összefüggést kapjunk) - a feltételezex nemlineáris függvénykapcsolaxal felírt eltérés-négyzetösszeget minimalizáljuk, tehát a legkisebb négyzetek elve marad, csak a paraméterekre általában nemlineáris egyenletrendszert kapunk, amiből valamilyen iterációs eljárással igyekszünk megbecsülni a legkisebb eltérés-négyzetösszeget adó paramétereket (Newtonmódszer, gradiens módszer, Levenberg-Marquard módszer)
Modellek közöz választás M1 M1 M2 egymásba ágyazox modellek (nested) - likelihood-rafo teszt (LRT) D = -2*ln(likelihood-M1 / likelihood-m2) M2 χ 2 -eloszlású, df = df2-df1 M1 M2 független modellek (non-nested) - AIC, AICc AIC = 2*k 2*ln(L) M1 M2 χ 2 -eloszlású, df = df2-df1
Modellek jóságának összehasonlítása: nested modellek Az összetexebb modell az egyszerűbb kibővítése ugyanolyan taggal (például monoexponenciális vs bi-exponenciális) általánosabban: az összetexebb modell magában foglalja az egyszerűbb modellt F-teszt extra négyzetösszeg alapján (SS: sum-of-squares) - ha az egyszerűbb modell (1) korrekt, akkor (ss1-ss2)/ss2 ~ (df1-df2)/df2 - ha az összetexebb modell (2) korrekt, akkor (ss1-ss2)/ss2 > (df1-df2)/df2 F-próba: F = [(SS1-SS2)/(df1-df2)]/(SS2/df2) F α, df1-df2, df2
Modellek jóságának összehasonlítása: non-nested modellek Információs elv (entrópiaelv) alkalmazása a stafszfkában (eredefleg Hirotugu Akaike fejlesztexe ki a maximum likelihood elv használatával): Tetszőleges modell esetén definiál egy mennyiséget (AIC), amelynek csak a különbségét kell venni két modell összehasonlításakor. Ha a maradéktagok normális eloszlásúak, akkor : AIC = N* ln (SS2 / SS1) + 2* df Ha AIC nega{v, akkor az egyszerűbb modellt (1, kevesebb paraméteres) favorizáljuk, ha AIC pozi{v, akkor az összetexebbet (2).