DNS-szekvencia meghatározás Gilbert 1980 (1958) Sanger 3-1
A DNS-polimerázok jellemzői 5'-3' polimeráz aktivitás 5'-3' exonukleáz 3'-5' exonukleáz aktivitás Az új szál szintéziséhez kell: templát DNS primer (szabad 3 OH) dntp (datp, dctp, dgtp, dttp) új szál primer 3 5 3 3 templát 5 1-2
Sanger, didezoxi láncterminációs módszer didezoxi származék + jelölés: pl. α32pdatp + jelölés: pl. α32pdatp + jelölés: pl. α32pdatp poliakrilamid gélelektroforézis 3-3
Poliakrilamid gélelektroforézis - PAGE AA Hagyományos szekvenáló készülék bisaa PAGE: a gél kialakítása polimerizációval, keresztkötések bisakrilamid segítségével, a két komponens aránya (AA, bis-aa), koncentrációja határozza meg a gél felbontó képességét. Egyszálú DNS elválasztás szekvenálás DNS, RNS elválasztás (etídium bromiddal festés) fehérje elválasztás denaturáló fehérje gél: SDS PAGE 2D PAGE poliszacharidok elválasztása DNS szekvenálás Denaturáló gél, urea, egyszálú, jelölt DNS felbontó képesség 1 bázis! (kb. 30-700 bázis hosszúságú tartományban). Szekvenáló automaták: fluoreszcens festékekkel a detektálás (leolvasás) automatizálható (lásd később) Bioinformatika: részszekvenciák összeszerelése, kiértékelése, génkeresés lásd Bioinformatika kurzus 3-4
Szekvenáló gélről készült autoradiogram és egy részlete. Az egy DNS mintához tartozó reakciók a filmre rajzolt vonalakkal utólag lettek bejelölve (A, C, G, T reakciók) 3-5
ACGT a aa cc t ct a t a 3-6
NEMRADIOAKTÍV JELÖLÉS Fluoreszcens jelölés fluoreszcein12- dutp 3-7
Négyféle, különböző hullámhosszon fluoreszkáló ddntp származék alkalmazásával, ugyanabban a reakcióban is meghatározható, hogy milyen bázisra végződik egy adott hosszúságú DNS-szál. 3-8
Automata detektálás az elválasztás során, automatizált DNS-szekvenáló készülék. Az informatka és a robotika fejlődése révén lehetővé vált nagy mennyiségű DNS-szekvencia meghatározása. Szekvenáló gyárak, genomprojektek. Bioinformatika. 3-9
PRIMER szekvenálási reakció, 500 bp inszert, ismeretlen szekvencia Szekvenálási stratégia: - meghatározás átfedő szakaszokban - mindkét irányban (szálon) - klónozás jelentősége, inszert orientáció ismerete Genom szekvenálás shot gun klónozás (random) és szekvenálás 6-10 x es lefedettség, 3-10
3-11
3-12
GENOM SZEKVENÁLÁS A random tördelt fragmentek klónozása, sok millió klón szekvenálása, az adatok feldolgozása, a szekvencia összeszerelése automatikus. 12x es lefedettség minden egyes bázisra. Ha egy olvasásban egy ponton hiba van, még 11 másik szekvencia megmutatja a konszenzus, korrekt szekvenciát. Nincs szükség és lehetőség az egyedi olvasások hibáinak javítására. 3-13
PRC Polimeráz láncreakció polymerase chain reaction Kary Mullis 2010.11.07. 3-14
A PCR reakció összetevői A PCR ciklus 1) templát DNS 2) datp, dctp, dgtp, dttp (dntp-k) 3) hőstabil DNS polimeráz (Taq polimeráz) 4) 2 db oligonukleotid primer 1. denaturáció 94 oc A két primer által meghatározot DNS szakasz in vitro megsokszorozása egymást követő ciklusokban. DNS szálak szétválasztása 2. annealing 45-65 oc a primerek kötődése 3. extension 72 oc az új szálak szintézise ismétlés 30-35x 5 GACACCATCGAATCACGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCA - 100-2000 N --CAATTCAGGGTGGTGAATGTGAATGTCAGTAACGTTATACG 3 3 CTGTGGTAGCTTAGTGCGTTTTGGAAAGCGCCATACCGT - 100-2000 N --GTTAAGTCCCACCACTTACACTTACAGTCATTGCAATATGC 5 denaturáció és annealing 5 GACACCATCGAATCACGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCA - 100-2000 N --CAATTCAGGGTGGTGAATGTGAATGTCAGTAACGTTATACG 3 ACAGTCATTGCAATATGC 5 5 GACACCATCGAATCAC 3 CTGTGGTAGCTTAGTGCGTTTTGGAAAGCGCCATACCGT - 100-2000 N --GTTAAGTCCCACCACTTACACTTACAGTCATTGCAATATGC 5 felső primer: alsó primer: 5 GACACCATCGAATCAC 3 16-mer, 5 CGTATAACGTTACTGACA 3 18-mer, Tm= 54,3 C Tm= 54,2 C 3-15
3-16
3-17
3-18
3-19
3-20
3-21
3-22
3-23
3-24
2 (8) 3-25
2 (8) 3-26
8 (22) 3-27
22 (52) 3-28
3-29
3-30
3-31
3-32
A PCR program 1. 2. 3. 4. 5. 6. 2 perc 94 C 30 mp 94 C 30 mp 56 C a hőmérséklet a primerek szekvenciájától függ 40 mp 72 C az idő a termék hosszától függ (60 nt/sec) 32x GO TO 2. end (Részletesebb leírás a gyakorlatos jegyzetben.) Primer tervezés 1. A két primer olvadáspontja (Tm) lehetőleg azonos legyen Tm = 4x(G+C) + 2x(A+T)* Ta= Tm ± (2-5 C) 45-60 C 2. erős másodlagos szerkezetek ne legyenek 3. termék 300-3000 bp között primer hajtű (hairpin) primer dimer *pontatlan megközelítés, csak annak szemléltetésére jó, hogy magasabb GC tartalom, vagy több nukleotid magasabb Tm értéket eredményez. Valós számítások különböző programokkal: http://bioinformatics.org/sms2/pcr_primer_stats.html 3-33
PCR alkalmazások 1) Klónozás - előny: géntár készítés nélkül; hátrány: max. 10.000 bp, nehezen!) 2) diagnózis, mutációk kimutatása 3) heterológ v. degenerált primerekkel rokon, homológ szekvenciák klónozása 4) génsebészet restrikciós helyek bevitele 5) mutáció, más szekvencia bevitele 6) régi szövetmintákből DNS felsokszorozása, szekvenálása (csont, mag honfoglalás kori leletek, neandervölgyi ember) 7) azonosítás kevés mintából: Romanovok, bűnüldözés, katasztrófáknál azonosítás, szülők azonosítása 8) genetikai térképezésnél DNS markerek RAPD, random amplified polymorfic DNA 9) Hibridizáció helyett DNS-szakasz azonosítás 10) mrns kimutatás, génexpresszió mérés, RT-PCR, real time PCR mennyiségi összehasonlításokhoz 3-34
Egyedi azonosítás: mikroszatellita vagy simple sequence repeat (SSR) nem kódoló régiók vizsgálata monoton, ismétlődő szekvenciák, két oldalukon egyedi szekvenciákkal, nem kódol, minden mutáció rögzül, populáción belül is sok eltérés, apai és anyai allél sok, hasonló szakasz vizsgálatával lehetséges a teljesen egyedi azonosítás 3-35
3-36
2010.11.07. 3-37
lambda PstI 100 bp ladder Molekuláris biológia gyakorlat elválasztás agaróz gélen hallgatói minták rosszabb felbontás, mint a poliakrilamid gélen Részletesebb leírás a gyakorlatos jegyzetben. 800 bp 700 bp 600 bp 500 bp 400 bp 3-38