!HU00000634T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 006 34 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 0 743972 (22) A bejelentés napja: 200. 04. 29. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 2000743972 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 174134 A1 200. 11. 17. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 174134 B1 2009. 02. 2. (1) Int. Cl.: C12P 7/16 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 010893 PCT/IB 0/0016 (30) Elsõbbségi adatok: 8002004 2004. 0. 10. AT (72) Feltalálók: GUPTA, Antje, 6207 Wiesbaden (DE); Tschentscher, Anke, 6347 Eltville-Hattenheim (DE); BOBKOVA, Maria, 610 Idstein (DE) (73) Jogosult: IEP GmbH, 6203 Wiesbaden (DE) (74) Képviselõ: Kerény Judit, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest (4) Eljárás 2-butanol elõállítására (7) Kivonat A találmány tárgya eljárás 2¹butanol, különösen R¹2- butanol és S¹2-butanol elõállítására 2¹butanon karbonil-reduktázzal és egy koenzimmel történõ enzimkatalizált redukálásával, amelynek során (a) a karbonil-reduktázt és a koenzimet tartalmazó vizes fázist érintkezésbe hozzák egy, a vizes fázissal nem elegyedõ alkoholos fázissal, amely 2¹butanont tartalmaz, a 2¹butanon redukciójához, azzal a megkötéssel, hogy az alkoholos fázisban lévõ alkohol egy szekunder alkohol, amely alkalmas a koenzim regenerálására, és a víznél magasabb forrásponttal rendelkezik, majd (b) a keletkezett 2¹butanolt elválasztják. HU 006 34 T2 A leírás terjedelme 6 oldal Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 199. évi XXXIII. törvény 84/H. -a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1 HU 006 34 T2 2 A találmány tárgya eljárás 2¹butanol, különösen R¹2- butanol és S¹2-butanol elõállítására 2¹butanon karbonil-reduktázzal és egy koenzimmel történõ enzimkatalizált redukálásával. A 2¹butanol és különösen az aszimmetrikus R¹2- butanol és S¹2-butanol fontos közbensõ termékek gyógyászatilag hatásos anyagok elõállításához. Az enantiomertiszta 2¹butanol, tehát az R¹2-butanol és S¹2-butanol elõállítása költséges, mert mindmáig nem lehetséges közvetlen kémiai úton a 2¹butanon katalitikus aszimmetrikus redukciója R¹, illetve S¹2-butanollá. Nincsenek eddig leírva közvetlen enzimes redukálási eljárások sem. Ipari méterekben csak kerülõúton, a racemáthasítással lehet enantiomertiszta R¹2- butanolt és S¹2-butanolt elõállítani. A karbonil-reduktázok (további megjelölések: alkohol-dehidrogenázok, oxidoreduktázok) katalizátorként ismeretesek karbonilvegyületek redukálásához, illetve szekunder alkoholok oxidációjához. Ezekhez az enzimekhez egy koenzimre van szükség, például NAD(P)H¹ra. A ketonok redukciója a Lactobacillus kefirbõl nyert karbonil-reduktázzal és az NADPH koenzimmel, például az,342,767 számú USA szabadalmi leírásból ismert. Egy alkohol-dehidrogenáz tisztítása és jellemzése Moraxella sp.¹bõl az Eur. J. Biochem. 24, 36 362 (1998) irodalomból ismert. A 2¹butanon 2¹butanollá történõ redukciója egy karbonil-reduktáz segítségével vizes közegben nehézkes, mert a reakcióelegyet nem lehet könnyen feldolgozni, és a 2¹butanol vízben igen jól oldódik. Ezenkívül az extrakciós és desztillációs eljárások a 2¹butanol és a víz szétválasztására mûszakilag bonyolultak. A 2¹butanon 2¹butanollá történõ enzimes redukciója karbonil-reduktáz segítségével problémás azért is, mert az NADH, illetve NADPH kofaktor regenerálása szükséges. Manapság gyakran használják az NAD(P)H regenerálásához a 2¹propanolt, és ez a módszer ugyanúgy problémás, mert az R¹, illetve S¹2-butanol-termék izolálása tovább nehezíti az eljárást, és ezenkívül csak igen körülményesen lehet teljesen szétválasztani az R¹, illetve S¹2-butanolt egymástól. További problémát jelent a 2¹butanon enzimes redukciójánál vizes közegben egyidejûleg az NAD(P)H 2¹propanollal történõ koenzim regenerálása mellett a legtöbb enzim inaktiválódása 20%-nál nagyobb 2¹propanol- és 2¹butanoltartalom mellett. Ez azt jelenti, hogy az alkalmazandó 2¹butanon végsõ koncentrációjának messze 10 tömeg/térf.% felett kell lenni, hogy ha az alkalmazandó 2¹propanol feleslegébõl indulunk ki. Ezek a csekély realizálható anyag¹, illetve termékkoncentrációk megnehezítik viszont az R¹, illetve S¹2-butanol izolálását a reakcióelegybõl. A WO 93/18138 A dokumentum [(Forschungszentrum Juelich GmbH), 1993. szeptember 16.] leír egy eljárást 2¹butanol elõállítására 2¹butanon enzimes katalitikus redukciójával egy karbonil-reduktáz segítségével Candida parapsilosisból és egy koenzimmel egy egyfázisú vizes rendszerben. A koenzim regenerálását nátrium-formiát/formiát-dehidrogenáz eleggyel történõ 10 1 20 2 30 3 40 4 0 60 összekapcsolással végzik. Az EP A 1 323 827 számú [(Sumitomo Chemical Combani, Limited), 2003. július 2.] dokumentuma leír egy eljárást 2¹hidroxi-cikloalkánkarboxilsav-észter elõállítására 2¹oxo-cikloalkánkarboxilsav-észter karbonil-reduktázzal és koenzimmel kétfázisú rendszerben és szekunder alkohol jelenlétében történõ enzimkatalizált redukciójával, ahol a szekunder alkohol forráspontja legfeljebb 200 C. A találmány szerinti eljárás a 2¹butanol elõállítására 2¹butanon enzimkatalizált redukciójával karbonil-reduktázzal és koenzimmel azt a feladatot hivatott megoldani, hogy megoldja a fent említett problémákat, és azzal jellemezhetõ, hogy (a) a karbonil-reduktázt és a koenzimet tartalmazó vizes fázist egy alkoholos fázissal, amely nem elegyedik a vizes fázissal és 2¹butanont tartalmaz, a 2¹butanon redukciójához érintkezésbe hozzuk, azzal a megkötéssel, hogy az alkoholos fázisban lévõ alkohol egy szekunder alkohol, amely képes regenerálni a koenzimet, és egy olyan forráspontja van, amely a víz forráspontja feletti, majd (b) a képzõdött 2¹butanolt elválasztjuk. A találmány szerinti eljárás során a 2¹butanont karbonil-reduktázzal reagáltatjuk 2¹butanollá, ezáltal egy kétfázisú rendszerben hajtjuk végre az eljárást, amely az enzimet és a koenzimet oldott állapotban tartalmazó vizes fázisból és egy szekunder alkoholból és egy 2¹butanonból képzõdõ szerves fázisból áll. A koenzimregenerálást egy szekunder alkohollal hajtjuk végre, amely nem elegyedik vízzel, és egyidejûleg lényegesen magasabb a forráspontja, mint a vízé. Elõnyösek a 2¹pentanol, 2¹hexanol, 2¹heptanol, 2¹oktanol és a 4¹metil-2-pentanol, melyek közül elõnyös a 2¹heptanol és a 2¹oktanol. Koenzimként különösen az NADH és az NADPH alkalmas. Ezenkívül a szekunder, vízzel nem elegyedõ alkohol alkalmazása a találmány szerinti eljárásban a karbonil-reduktáz stabilizálásához vezet. Egy vízzel nem elegyedõ szekunder alkohol alkalmazásának elõnye a koenzimregenerálásnál abból áll, hogy nagyobb feleslegben lehet alkalmazni a redukálandó 2¹butanon anyagra vonatkoztatva. Ezáltal nagyobb konverzió érhetõ el egyidejûleg nagyobb alkalmazott 2¹butanonkoncentrációk mellett. Elõnyösen az alkoholos fázis szekunder alkoholját és a 2¹butanont 1:2 1:10 moláris arányban alkalmazzuk (2¹butanon:szekunder alkohol), és különösen elõnyös az 1:2, 1: mólarány. A találmány szerinti eljárás további változata abból áll, hogy a 2¹butanont olyan mennyiségben alkalmazzuk, hogy az össz-reakcióelegyre vonatkoztatva a koncentráció legalább térf.%, elõnyösen 10 2 térf.% legyen. A karbonil-reduktázt elõnyösen legalább 2000 egység, elõnyösen azonban legalább 10 000 egység karbonil-reduktáz per 2¹butanon kg mennyiségben használjuk, miközben a felsõ határ célszerûen 20 000 egység karbonil-reduktáz 1 kg 2¹butanonra vonatkoztatva. Az 1 U enzimegység olyan enzimmennyiségnek felel meg, amely 1 mol 2¹butanon percenkénti reagáltatásához szükséges. 2
1 HU 006 34 T2 2 Karbonil-reduktázként, illetve alkohol-dehidrogenázként különösen elõnyösnek mutatkoznak olyanok, amelyek a Candida parapsilosisból származnak. Elõnyösen olyan karbonil-reduktázt alkalmazunk, amely lényegében enantiomertiszta S¹2-butanolt vagy R¹2- butanolt eredményez. Azt találtuk, hogy a Candida parapsilosisból származó karbonil-reduktáz alkalmas a 2¹butanon S¹2-butanollá történõ sztereoszelektív redukálására, miközben a választott eljárási körülményektõl függõen több, mint 98% enantiomerfelesleg érhetõ el a kívánt enantiomerbõl. A találmány szerinti eljárás során keletkezõ 2¹butanol a szekunder alkohol fázisban található, és ezzel együtt dekantálható a vizes fázisról. Ezt követõen a 2¹butanolt egyszerû desztillációs úton kinyerhetjük. A találmány szerinti eljárásban a megfelelõ enantiomertiszta S¹alkoholt is alkalmazhatnánk a koenzim regeneráláshoz. A reakcióelegy össztérfogatában a vizes és szerves fázis megoszlása változtatható, miközben a vizes fázis legfeljebb 3 térf.%¹a redukálható, ami oda vezet, hogy az alkalmazott 2¹butanon több, mint 90%¹a, illetve az R¹, illetve S¹2-butanol a vízzel nem elegyedõ alkoholból képzett fázisban található. A találmány szerinti eljárás további elõnye abban áll, hogy összehasonlíthatóan egyszerûen lehet az R¹, illetve S¹2-butanolt nagy tisztaságú formában feldolgozni és izolálni. Az R¹, illetve S¹2-butanol-termék izolálása úgy történik, hogy a szerves fázist elválasztjuk, és a 2¹butanon/2¹butanol elegyet nagy forráspontú, vízzel nem elegyedõ szekunder alkoholból desztilláljuk. Ezt követõen desztilláció útján kinyerhetjük az aszimmetrikus R¹, illetve S¹2-butanol-terméket a 2¹butanol/2¹butanon elegybõl több, mint 99%¹os kémiai tisztasággal és több, mint 98%¹os enantiomerfeleslegben. A 2¹butanon anyag alkalmazandó koncentrációja a találmány szerinti eljárás során elõnyösen több, mint térf.%, különösen elõnyösen 10 és 2 térf.% közé esik. 10 1 20 2 30 3 A vizes fázisra vonatkoztatva a koenzim NAD(P)H koncentrációja 0,01 mmol-tól 10 mmol¹ig, különösen 0,1 mmol-tól 1 mmol¹ig terjed. A találmány szerinti eljárás során alkalmazott vizes fázishoz elõnyösen egy puffert adagolunk, ami lehet például kálium-foszfát¹, trisz/hcl- vagy trietanol-amin-puffer, melyeknek ph¹értéke 10, elõnyösen 6 9 között van. A találmány szerint a karbonil-reduktázt vagy teljesen tisztított vagy részben tisztított formában sejtlizátok vagy egész sejtek formájában alkalmazhatjuk. Az alkalmazott sejtek lehetnek természetesek vagy permeabilizáltak. A hõmérséklet például körülbelül 10 60 C¹ig, elõnyösen 2 3 C között változhat. A találmány szerinti eljárást például egy zárt reakcióedényben, amely lehet üvegbõl vagy fémbõl, hajthatjuk végre. Ehhez a komponenseket külön-külön bevezetjük a reakcióedénybe, és például nitrogén- vagy levegõatmoszférában keverjük. A reakcióidõ 1 órától 48 óráig, különösen 2¹tõl 24 óráig változhat. A Candida parapsilosisból származó karbonil-reduktáz helyett alkalmazhatunk más karbonil-reduktázokat is, melyek alkalmasak arra, hogy enantioszelektív redukálják a 2¹butanont S¹2-butanollá vagy R¹2-butanollá. A találmány további részleteit az alábbi példákkal írjuk le közelebbrõl. 1. példa Ebben a példában bemutatjuk az S¹2-butanol elõállítását 2¹butanonból, és az S¹2-butanol termelésének függését az alkalmazott 2¹butanon/szekunder alkohol (2¹heptanol) alkalmazott arányának függvényében. Karbonil-reduktázként a Candida parapsilosisból származót alkalmazzuk. A koenzimregenerálást 2¹heptanollal végezzük. Az alábbi táblázatban bemutatjuk a három különbözõ arányban alkalmazott 2¹butanon/2¹heptanol eleggyel végzett termelési adatokat. 1. táblázat Összetétel 1. elegy 2. elegy 3. elegy Puffer (100 mmol TEA ph=7,0) 1,ml 1,ml 1,ml 2-Butanon 2, ml (0,027 mol) 2, ml (0,027 mol) 2, ml (0,027 mol) NAD 0, mg 0, mg 0, mg 2-Heptanol 10,ml (0,068 mol) 1,ml (0,103 mol) 20,ml (137,mol) ADH Candida parapsilosisból 60,egység 60,egység 60,egység Paraméterek Térfogat 13, ml 18, ml 23, ml Mólarány 1:2, 1:3,8 1: 2-Butanon/2¹heptanol A 2¹butanon térf.%¹os koncentrációja 18,% 13,% 10,6% S-Butanol %¹os termelése 43% 61% 70% S-Butanol enantiomerfeleslege 99% S 99% S 99% S 3
1 HU 006 34 T2 2 A reakciót úgy hajtjuk végre, hogy elõször a reakcióedénybe vezetjük a puffert, amelyben fel van oldva az NAD és az enzim. Ezután hozzáadjuk az edénybe a 2¹heptanolt és a 2¹butanont. A reakcióelegyet ezután jól átkeverjük és 30 C¹on inkubáljuk. A reakciót megszakítjuk, amikor már a 2¹butanon további reakcióját nem figyeljük meg, és ezzel elérjük a reakcióegyensúlyt. Az 1. táblázatból kitûnik, hogy növekvõ 2¹heptanolkoncentráció mellett lényegesen nõ az S¹2-butanol termelése. 2. példa Ebben a példában három elegy révén mutatjuk ki, hogy a vizes fázist úgy lehet redukálni, hogy közben a termelés lényegesen nem változik. 2. táblázat Összetétel 4. elegy. elegy 6. elegy Puffer (100 mmol TEA ph=7,0) 2, ml,ml 10,ml 2-Butanon,ml (0,04 mol),ml (0,04 mol),ml (0,04 mol) NAD 1,mg 1,mg 1,mg 2-Heptanol 30,ml (0,206 mol) 30,ml (0,206 mol) 30,ml (0,206 mol) Candida parapsilosisból származó ADH 00,egység 00,egység 00,egység Paraméterek Térfogat 37, ml 40,ml 4,ml Mólarány 1:3,8 1:3,8 1:3,8 2-Butanon/ 2¹heptanol 2-Butanon koncentrációja térf.%-ban 13,3% 12,% 11% S-Butanol termelése %¹osan % 8%,6% S-Butanol enantiomerfeleslege 98% S 98% S 98% S 3. példa Ebben a példában bemutatjuk, hogy a koenzim regenerálását különbözõ szekunder alkoholokkal lehet végrehajtani, a három kísérlet eredményét az alábbi 3. táblázat mutatja be. 3 3. táblázat Összetétel 7. elegy 8. elegy 9. elegy Puffer (100 mmol TEA ph=7,0) 20,ml 20,ml 6,ml 2-Butanon,ml (0,04 mol),ml (0,04 mol) 1,ml (0,0108 mol) NAD 0, mg 0, mg 1,mg Szekunder alkohol 30,ml 30,ml 4,ml 4-metil-2-pentanol 2-hexanol 2-pentanol (0,23 mol) (0,23 mol) (0,036 mol) ADH Candida parapsilosisból 00,egység 00,egység 100,egység Paraméterek Térfogat,ml,ml 11,ml Mólarány 1:4,3 1: 4,3 1:3,3 2-Butanon/ 2¹heptanol 2-Butanon térf.% 9% 9% 9% S-Butanol %¹os termelés 78% 70% 68% S-Butanol enantiomerfelesleg 96% S 98% S 98% S 4
1 HU 006 34 T2 2 4. példa Ebben a példában az S¹2-butanol ipari méretekben történõ elõállítását mutatjuk be. Az S¹2-butanol elõállításához 4,96 1 puffert (TEA 100 ml, ph=7,0) egy 30 C¹on temperált keverõreaktorba adagolunk. Ezután 4,96 g NAD¹t feloldunk pufferben, és hozzáadunk a pufferhez Candida parapsilosisból származó 300 000 egység karbonil-reduktázt. A reakcióelegyet befedjük 76,11 l (60,9 kg) 2¹heptanollal, és ezután a 10 kg (12, 1) 2¹butanon anyagot adjuk hozzá. Ezután bekapcsoljuk a keverést, és a reakcióelegyet 12 órát alapos keverés közben inkubáljuk. 12 óra múlva a 2¹butanon 68%¹át S¹2-butanollá reagáltatjuk, enantiomerfelesleg 98,4%. A reakció befejezése után a 2¹butanon/S¹2-butanol-tartalmú heptanol fázist elválasztjuk és szárítjuk. A 2¹butanon/S¹2-butanol elegyet elõször a heptanol fázisból desztilláció útján nyerjük ki (a forráspont körülbelül 18 161 C), mielõtt egy második desztillációban elválasztanánk egymástól a 80 C¹on forró 2¹butanont és a 97 100 fokon forró S¹2-butanolt. Ily módon több, mint 99% kémiai tisztaságú S¹2-butanolt lehet kapni. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 10 1 20 2 30 3 1. Eljárás 2¹butanol elõállítására 2¹butanon enzimkatalizált redukciójával egy karbonil-reduktáz és egy koenzim segítségével, azzal jellemezve, hogy (a) a karbonil-reduktázt és a koenzimet tartalmazó vizes fázist érintkezésbe hozzuk egy, a vizes fázissal nem elegyedõ alkoholos fázissal, amely 2¹butanont tartalmaz, a 2¹butanon redukciójához, azzal a megkötéssel, hogy az alkoholos fázisban lévõ alkohol egy szekunder alkohol, amely alkalmas a koenzim regenerálására, és a víznél magasabb forrásponttal rendelkezik, majd (b) a keletkezett 2¹butanolt elválasztjuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alkoholos fázis alkoholja 2¹pentanol, 2¹hexanol, 2¹heptanol, 2¹oktanol vagy 4¹metil-2-pentanol. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alkoholos fázis alkoholja 2¹heptanol vagy 2¹oktanol. 4. Az 1 3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alkoholos fázis szekunder alkoholját és a 2¹butanont 1:2 1:10 (2¹butanon:szekunder alkohol) mólarányban alkalmazzuk.. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mólarány 1:2, 1: között van. 6. Az 1. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 2¹butanont legalább térf.%, elõnyösen 10 2 térf.% mennyiségben alkalmazzuk az össz-reakcióelegyre vonatkoztatva. 7. Az 1 6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy legalább 2000 egység, elõnyösen azonban legalább 10 000 egység karbonil-reduktázt alkalmazunk 1 kg 2¹butanonra. 8. Az 1 7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Candida parapsilosisból elõállítható karbonil-reduktázt alkalmazunk. 9. Az 1 7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a keletkezett 2¹butanolt desztillációs úton választjuk el. 10. Az 1 9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan karbonil-reduktázt alkalmazunk, amellyel lényegében enantiomertiszta S¹2-butanol vagy R¹2-butanol állítható elõ.
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest