A VASZKULÁRIS ENDOTELIÁLIS NÖVEKEDÉSI FAKTOR SZINTÉZISÉNEK ÉS SZEREPÉNEK VIZSGÁLATA HIPOXÁS ÁLLAPOTOKBAN Dr. Vannay Ádám Doktori értekezés Budapest, 2004 Témavezeto: Dr. Szabó András, egyetemi docens Készült a Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola Krónikus betegségek gyermekkori prevenciója címu Ph.D. programjának keretében. Programvezeto: Prof. Tulassay Tivadar Opponensek: Dr. Kovács Tibor Dr. Tóth Mikós Szigorlati bizottság: Prof. Rácz Károly Dr. Szalay Csaba Dr. Prohászka Zoltán
TARTALOMJEGYZÉK 1. RÖVIDÍTÉSEK 6 2. ÖSSZEFOGLALÓ 9 3. SUMMARY 10 4. BEVEZETÉS, IRODALMI ÁTTEKINTÉS 11 4.1. A VEGF génszerkezete 11 4.2. A VEGF szintézisének szabályozása 19 4.3. A VEGF izoformái 20 4.4. A VEGF receptorai 21 4.5. A VEGF receptorainak (VEGFR1, VEGFR2) szignalizációja 25 4.6. A VEGF biológiai hatásai 27 4.7. A VEGF szintézisének és a vese iszkémia/reperfúziós károsodásának 32 kapcsolata 4.8. A hisztamin és a VEGF szintézis kapcsolata a vese iszkémia/reperfúziós 33 károsodása során 4.9. A dehidro-epiandrosztendion és a VEGF szintézis kapcsolata a vese 34 iszkémia/reperfúziós károsodása során 4.10. A patkány VEGF izoformáinak mrns szintu kimutatása 34 4.11. A VEGF génpolimorfizmusok és a kis születési súlyú koraszülöttek 35 retinopátiájának kapcsolata 5. CÉLKITUZÉSEK 37 6. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 39 6.1. In vivo patkány vese iszkémia/reperfúziós kísérletek 39 6.1.1. A kísérletek során felhasznált állatok 39 6.1.2. Mutéti beavatkozás 39 6.1.3. Kezelési protokollok 40 6.1.4. Szérum kreatinin és karbamid meghatározás 40 6.1.5. A ves eszövet hisztológiai vizsgálata 41 2
6.1.6. Hisztamin ELISA 41 6.1.7. DHEA és dehidro-epiandrosztendion-szulfát radioimmunoassay 41 6.1.8. Szemikvantitatív és kompetitív RT-PCR mérések 42 6.1.9. A patkány vesék szöveti VEGF szintjének meghatározása Western blottal 47 6.1.10. Immunhisztológia 49 6.1.11. Az in vivo patkány vese iszkémia/reperfúziós kísérletek statisztikai analízise 50 6.2. A patkány VEGF izoformáinak mrns szi ntu kimutatása real time 51 RT-PCR- fluoreszcens rezonancia energia transzfer segítségével 6.2.1. A VEGF különbözo izoformáinak detektálásához használt real time RT-PCR 51 rendszer tervezése során felmerülo megfontolások 6.2.2. Rekombináns DNS molekulák eloállítása 54 6.2.3. A rekombináns DNS molekulák klónozása 55 6.2.4. A VEGF izoformáinak detektálása real time RT-PCR-fluoreszcens 56 rezonancia energia transzfer segítségével 6.3. A VEGF gén promoter polimorfizmusainak és a kis születési súlyú 56 koraszülöttek retinopátiája közti kapcsolat vizsgálata 6.3.1. A vizsgálatba bevont kis születési súlyú koraszülöttek klinikai adatai 56 6.3.2. DNS izolálás 57 6.3.3. A VEGF T -460 C polimorfizmusának detektálása real time PCR-fluoreszcens 58 rezonancia energia transzfer segítségével 6.3.4. A VEGF G +405 C polimorfizmusának detektálása PCR- restrikciós fragment 58 hossz polimorfizmus segítségével 6.3.5. A populációs adatok statisztikai feldolgozása 59 7. EREDMÉNYEK 60 7.1. A VEGF szintézisének vizsgálata vese iszkémia/reperfúziós 60 patkánymodellben 7.1.1. A szérum kreatinin és karbamid koncentrációjának változásai 60 7.1.2. A vesék szövettani elváltozásai 61 7.1.3. VEGF, IL-6 és az IL-1? mrns expresszió változásai a patkány vesékben 62 7.1.4. A VEGF fehérje szint változásai a patkány vesékben 64 7.1.5. A VEGF szöveti eloszlása a vesében 65 3
7.2. A hisztamin és a hisztamin kettes receptor antagonista, ranitidin kezelés 67 hatásának vizsgálata a VEGF szintézisére vese iszkémia/reperfúziós patk ánymodellben 7.2.1. A patkányok vese iszkémiát követo túlélése 67 7.2.2. A patkányok szérum kreatinin és karbamid koncentrációjának változásai 68 7.2.3. A patkányok vese tubuláris károsodásának változásai 69 7.2.4. A patkányok szérum hisztamin koncentrációjának változásai 70 7.2.5. A patkányok VEGF mrns expres sziójának változásai a vesében 71 7.2.6. A patkányok L-6 mrns expressziójának változásai a vesében 72 7.2.7. A patkányok VEGF fehérje szintjeinek változásai a vesében 73 7.3. A dehidro-epiandrosztendion kezelés hatásának vizsgál ata a VEGF 74 szintézisére patkány vese iszkémia/reperfúziós modellben 7.3.1. A patkányok vese iszkémiáját követo túlélés 74 7.3.2. A patkányok szérum kreatinin és karbamid koncentrációjának változásai 75 7.3.3. A vesék szövettani elváltozásai 76 7.3.4. A DHEA kezelés hatása a szérum DHEA és dehidro-epiandrosztendionszulfát 77 koncentrációjára 7.3.5. A patkányok VEGF mrns expressziójának változásai a vesében 78 7.3.6. A patkányok IL-1? mrns expressziójának változásai a vesében 79 7.3.7. A patkányok IL-6 mrns expressziójának változásai a vesében 79 7.3.8. A patkányok VEGF fehérjeszint változásai a vesében 80 7.4. A patkány VEGF izoformák mrns expressziójának real time 81 RT-PCR-fluoreszcens rezonancia energia transzferrel történo kimutatása 7.4.1. A VEGF 120 mrns expressziójának kimutatása 82 7.4.2. A VEGF 144 mrns expressziójának kimutatása 83 7.4.3. A VEGF 164 mrns expressziójának kimutatása 84 7.4.4. A VEGF 188 mrns expressziójának kimutatása 85 7.4.5. A VEGF204 mrns expressziójának kimutatása 86 7.5. A VEGF gén promoter polimorfizmusainak és a kis születési súlyú 87 koraszülöttek retinopátiája közti kapcsolat vizsgálata 7.5.1. A VEGF promoter régió -460-as lokusz vizsgálatának reprezentatív real time 87 PCR-fluoreszcens rezonancia energia transzfer eredményei 4
7.5.2. A VEGF +405-ös lokusz vizsgálatának reprezentatív PCR-RFLP eredményei 88 7.5.3. A VEGF -460-as, illetve +405-ös lokuszának allél, illetve genotípus 88 frekvenciái 7.5.4. A kis születési súlyú koraszülöttek haplotípus megoszlása 89 8. EREDMÉNYEK MEGBESZÉLÉSE, KÖVETKEZTETÉSEK 91 8.1. A patkányvesék iszkémia/re perfúziós károsodása során a VEGF 91 szintézisében bekövetkezo változások megbeszélése 8.2. A hisztamin és a hisztamin kettes receptor antagonista ranitidin 93 kezelésnek a posztiszkémiás patkányvese VEGF szintézisére gyakorolt hatásának megbeszélése 8.3. A dehidro-epiandrosztendion kezelés nek a posztiszk émiás patkányvese 96 VEGF szintézisére gyakorolt hatásának megbeszélése 8.4. A patkány VEGF izoformák detektálására kialakított real time RT-PCRfluoreszcens 99 rezonancia energia transzfer rendszer eredményeink megbeszélése 8.5. A VEGF promoter polimorfizmusainak és a kis születési súlyú 100 koraszülöttek retinopátia kockázatának megbeszélése 9. EREDMÉNYEK ÖSSZEGZÉSE 101 10. IRODALOMJEGYZÉK 104 11. ÁBRÁK ÉS TÁBLÁZATOK JEGYZÉKE 122 12. PUBLIKÁCIÓS LISTA 125 13. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS 126 5
1. RÖVIDÍTÉSEK Akt anti-apoptikus kináz BAD Bcl 2 antagonista bfgf bázikus fibroblaszt növekedési faktor camp adenozin 3, 5 -monofoszfát Crk avian szarkóma vírus CT10 homológ DAG diacilglicerol DHEA dehidro-epiandrosztendion DHEA-S dehidro-epiandrosztendion-szulfát dntp dezoxi nukleotid trifoszfát ECM extracelluláris mátrix EGF epidermális növekedési faktor enos endoteliális nitrogén-monoxid szintáz FAK fokális adhéziós kináz FR transzkripcióra nem kerülo génszakasz FRET fluoreszcens rezonancia energia transzfer Fyn, fyn tirozinkináz protoonkogén GAP GTPáz aktíváló fehérje GAPDH glicerin-aldehid-foszfát dehidrogenáz Grb2, növekedési faktor receptor köto fehérje 2 HIF-1 hipoxia indukálta faktor 1 HR2 hisztamin receptor 2 HRE hipoxia válasz elem HSPG heparin szulfát proteoglikán HuR Hu-antigen R HUVEC human köldökzsinór endotélsejt I/R iszkémia/reperfúzió IAP apoptózis gátló IGF-I inzulinszeru növekedési faktor I IL-1? interleukin-1? IL-6 interleukin-6 6
IP3 inozitol 1,4,5,-trifoszfát IRES riboszóma köto hely JNK c-jun N -terminális protein kináz L-NAME N(G)-nitro-l-arginin metil észter MAM meprin-a5 antigen-protein-tirozin foszfatáz? MAPK mitogen-aktivált protein kináz MEK mitogén-aktivált protein kináz kináz MMP mátrix metalloproteáz NCBI nemzeti biotechnikai információs központ Nck, Nck mediátor fehérje NF IL-6 nukleáris faktor IL-6 NF?? nukleáris faktor-??? NO nitrogén-monoxid NP-1 neutropilin-1 PBS foszfátpuffer PCR polimeráz láncreakció PDGF trombocita növekedési faktor PG propilén-glikol PGI 2 prosztaciklin PI3K foszfatidilinozitol 3 -kináz PIGF placenta növekedési faktor PIP2 foszfatidilinozitol-biszfoszfát PKC fehérje kináz C PLA 2 foszfolipáz A2 PLC foszfolipáz C Pyk2 FAK tirozinkináz 2 Raf-1 v-raf-1 rágcsáló leukémia vírus onkogén homológ Ras Ras-GTP-áz aktivitású fehérje 1 RFLP restrikciós fragment hossz polimorfizmus RIA radioimmunoassay ROP koraszülött ek retinopátiája RT reverz transzkripció 7
Sch schwannomin sflt -1 szolúbilis VEGF receptor 1 SHP fehérje-tirozin foszfatáz SNP egy nukleotidot érinto polimorfizmus Sos guanin nukleotid kicserélo faktor Src avian szarkóma vírus onkogén TGF transzformáló növekedési faktor UTR fehérjére át nem íródó génszakasz VEGF vaszkuláris endoteliális növekedési faktor VEGFR1 VEGF receptor 1 VEGFR2 VEGF receptor 2 VLBW kis születési súlyú koraszülött VVO veziko-vakuoláris sejtorganellumok Yes Yamaguchi szarkóma vírus onkogén homológ 8
2. ÖSSZEFOGLALÓ A vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF) egy számos izoformával (VEGF 121, VEGF 145, VEGF 165, VEGF 189, VEGF 206 ) rendelkezo homodimer polipeptid. A VEGF fontos szabályzó eleme az endotélsejtek differenciálódásának, proliferációjának, vándorlásának és így az angiogenezisnek. A VEGF ezeken a folyamatokon kívül számos sejtfunkciót, így a nitrogén-monoxid (NO) és prosztaciklin (PGI 2 ) termelést, a simaizomsejt proliferációt és az apoptózist is befolyásolja. Vizsgálataink során a VEGF szintézisét, illetve annak szerepét vizsgáltuk különbözo hipoxiás kórképekben. Állatkísérleteink kapcsán vizsgáltuk a VEGF szintézisét a vese iszkémia/reperfúziós (I/R) károsodása során és kifejlesztettünk egy, a különbözo patkány VEGF izoformák mrns expresszióját detektáló real time RT-PCR rendszert. Humán vizsgálatainkban VEGF gén polimorfizmusok (SNP) allél és haplotípus frekvenciáit vetettük össze a kis születési súlyú koraszülöttek retinopáta (ROP) kockázatával. Állatkísérleteink során azt találtuk, hogy más posztiszkémiás szervektol eltéroen, a posztis zkémiás vesében változatlan VEGF mrns expresszió mellett emelkedik a VEGF fehérje szintje. Kísérleti állataink hisztamin, ranitidin, illetve dehidro-epiandrosztendion (DHEA) kezelése után a VEGF mrns expresszió, illetve fehérje szint, egymástól eltéro irányú változását tapasztaltuk a posztiszkémiás vesékben. Adataink a VEGF szintézisének egyedülálló, poszt -transzkripcionális szabályozására utalnak a posztiszkémniás vesében. A kifejlesztett real time RT-PCR rendszer egyedülálló módon alkalmas a különbözo patkány szövetekben a VEGF 120-as, 144-es, 164-es, 188-as és 205-ös izoformáinak egymástól független detektálására. A VEGF -460 C alléljának, valamint a -460 TT/ +405 CC haplotípus ának elofordulása gyakoribb volt a retinopátia fokozott kockázata miatt krioterápiával vagy fotokoagulációval kezelt kis születési súlyú koraszülöttekben, mint a nem kezeltekben. Összefoglalva, adataink a vese VEGF szintézisének egyedülállóan, a korábbi in vitro, illetve in vivo modellekben tapasztaltaktól különbözo, poszt-transzkripcionális jellegére utalnak. Humán genetikai vizsgálataink eredménye arra utal, hogy a VEGF T -460 C és G +405 C SNP-k vizsgálata hasznos információt ad a kis születési súlyú koraszülöttek, ROP rizikójának becslésére. 9
3. SUMMARY Vascular endothelial growth factor (VEGF) is a homodimeric polipeptid which posses different isoforms (VEGF121, VEGF145, VEGF165, VEGF189, VEGF206). VEGF plays a crucial role in the differentiation, proliferation and migration of the endothel cells and therefore in angiogenesis. VEGF also regulates multiple endothelial cell functions, such as synthesis of nitric oxide (NO) and prostacyclin (PGI 2 ), proliferation of vascular smooth muscle cell and apoptosis. We investigated the regulation of VEGF synthesis and its role in different ischemic diseases. In our animal experiments we analysed the changes in VEGF synthesis in a rat model of ischemia/reperfusion (I/R) induced acute renal failure. Moreover, we developed a new real time RT-PCR method to measure the mrna expression of different VEGF izoforms. In our human study we investigated the association of functional promoter polimorphisms of VEGF with the risk of proliferativ retinopathy (ROP) of very low birht weight infants (VLBW). In rats with I/R induced acute renal failure the increased VEGF protein levels but not mrna expression suggesting that during renal I/R injury VEGF synthesis - distinct from other organs - is primarily regulated at a post-transcriptional level. Histamine, ranitidine and DHEA pretreatment of the rats resulted in distinct changes in VEGF mrna expression and protein levels in the postischemic kidneys further supporting the importance of posttranscriptional mechanisms in the regulation of VEGF synthesis. Our real time RT -PCR system, irrespectively of each other, is able to detect the different VEGF izoforms. We observed increased prevalence of VEGF +405 C allele and VEGF - 460 TT/ +405 CC haplotype in VLBW infants between treated with or without cryotherapy/photocoagulation due to risk of proliferative ROP. In conclusion our data suggest that ischemic kidney has a unique regulation of VEGF synthesis. Our data emphasize the importance of the posttranscriptional regulation of VEGF synthesis in the postischemic rat kidney. Our findings also suggest that testing of VEGF SNPs would provide valuable information for the risk assessment of ROP in VLBW infants. 10
4. BEVEZETÉS, IRODALMI ÁTTEKINTÉS A vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF) befolyásolja az endotélsejtek differenciálódását [1], proliferációját [2] és migrációját [3]. Ezeken a folyamatokon keresztül szabályozza az angiogenezist mind, az embrionális fejlodés során [4] mind, pedig a születést követoen [5]. A VEGF számos betegség patomechanizmusában (kardiovaszkuláris megbetegedések, daganatok, reumatoid artritisz) játszik szerepet. Azon betegségek esetén, ahol az angiogenezis a patomechanizmus központi eleme (daganatok, gyulladásos kórképek), a túl nagy mennyiségben termelodo VEGF a betegség progressziójához vezethet. Ugyanakkor más betegségekben, ahol az érellátási, illetve a keringési zavar dominál (pl.: iszkémiás szívbetegség), a VEGF mint terápiás eszköz jöhet szóba. Egyre világosabban látszik az is, hogy a VEGF egy multifunkcionális citokin, amely nem csak az angiogenezist befolyásolja. A VEGF az endotélsejtek (és más egyéb sejtek pl.: vese tubuláris epitélsejt) számos egyéb biológiai funkcióját is szabályozza. A VEGF fokozza a nitrogén-monoxid (NO) és a prosztaciklin (PGI 2 ) [6] szintézist, valamint gátolja a trombusképzodést [7] és a simaizom sejtek proliferációját [8]. A VEGF hatással van a gyulladásos folyamatokra [9] és befolyásolja a sejtek apoptozisát [10, 11]. Mivel VEGF számos biológiai folyamat (angiogenezis, szöveti átépülés, gyulladás, apoptózis, daganatáttét-képzés) szabályozásában vesz részt, fontos megérteni a különbözo betegségek patomechanizmusában betöltött szerepét. 4.1. A VEGF génszerkezete A humán VEGF gén a hatos kromoszóma rövid karján (6p21.3) helyezkedik el. A VEGF génjének 5, illetve 3 végi transzkripcióra nem kerülo (flanking region - FR), illetve fehérjére át nem íródó régiója (untranslated region = UTR) igen összetett szerkezetu (1. ábra). Ezeknek a területeken lokalizált, speciális nukleotid 11
szekvenciáknak fontos szerepe van a gén trans zkripciós, illetve transzlációs szintu szabályozásában. A VEGF gén transzkripciója a -1038. bázistól indul (vastag, nagy betu ) [12]. A VEGF transzkripciós start pontja körüli régióban, ellentétben számos más génnel, nem található TATA szekvencia (TATA box). Mindössze a gén távoli 5 FR szakaszán található TATA box (-2465 és -2461-es bázisai között), ez azonban túl távol helyezkedik el a gén transzkripciós start pontjától ahhoz, hogy szignifikáns hatása lehessen a transzkripcióra [12]. A -2013-es és -2006-os bázisok között található a gén azon szakasza (5 TACGTTTT 3 ), amely a transzkripció hipoxia általi szabályozásáért felelos (hipoxia válasz elem - HRE) a hipoxia indukálható faktor-1 (HIF 1) megkötésén keresztül. Ehhez a régióhoz közel (-2000 és -1994 és bázisai között) fekszik még egy úgynevezett, járulékos HIF-1 transzkripciós faktor köto szekvencia (5 ACAGGTC 3 ), amelynek szintén szerepe van a hipoxia hatásának közvetítésében. Ugyanezek a régiók felelosek a NO VEGF transzkripciójára kifejtett hatásaiért is [13]. Két 5 CCGCCC 3, illetve 5 GGGCGG 3 bázis szekvenciájú szakasz, úgynevezett GC box található a gén 5 FR régiójában (-2138 és -2133, valamint -1277 és -1272 bázisok között) [12]. A transzkripciós start pontot közvetlenül megelozo régióban négy GC box is található (-1133 és -1128, -1123 és -1118, -1112 és -1107, valamint -1096 és -1091 bázisok között). További két GC box van az 5 UTR régióban a -518 és -513, valamint a -66 és -61 bázisok között [12]. Korábban hasonló GC boxokat találtak más gének transzkripciós start pontja körüli régiókban is. Ezeknél a géneknél a GC box-ok feladata az Sp1-es transzkripciós faktor megkötése. Feltételezheto, hogy a VEGF estében is hasonló szerepe van ezeknek a GC gazdag szekvenciáknak [12]. Öt kötohely található az AP-1-es (-2930 és -2924, -2265 és -2258, -1975 és -1969, -1528 és -1522, valamint -620 és -614 bázisok között) és ketto az AP-2-es (-1875 és -1868, valamint -135 és -128) transzkripciós faktor számára a VEGF 5 FR, illetve 5 UTR régiójában. Az AP-1-es és az AP-2-es transzkripciós faktorok kötohelyeivel komplementer szakaszok jelenléte a VEGF transzkripciójának 12-O-tetradekanoilforbol-13-acetáton, illetve camp-n keresztüli aktiválhatóságára utalnak [12]. 12
A VEGF 5 UTR-jának -187. és -185. bázisa közötti szakaszán egy extra start kodon (AUG) található. Bár a pontos jelentosége ennek a struktúrának nem ismert, részét képezi a VEGF 5 UTR-n található transzláció folyamatának szabályozásáért felelos génszakasznak (internal ribosomal entry site IRES). Ezért valószínusítik az extra start kodonnak transzláció szabályozásában való szerepét. A VEGF 5 UTR-jén két IRES szekvenciát is azonosítottak (IRES A és B), ezek a szakaszok a gén 947 és 555 (IRES B), illetve a 293 és a 1 (IRES A) bázisai között helyezkednek el [14]. Ezeken a gén szakaszokon (IRES A és B) belül is kitüntetett szerepe van a -947 és a -904, -659 és a -555, illetve a - 293 és a -192, a -187 és a -131, valamint a -121 és a -41 bázisok közti szakaszoknak. Ezen szakaszok deléciója jelentos mértekben csökkenti a VEGF transzlációját. Az eddig felsorolt, a VEGF szintézisének szabályozásában fontos génszakaszokon kívül ösztrogén receptor köto régió található a gén 5 UTR (5 GGGCAAAGTGACT 3 ) régiójában a gén -637 és -625 bázisai között. Ez a régió mind az ösztrogén? mind, pedig? receptorát megkötik. Ez a szekvencia felelos a VEGF transzkripciójának ösztrogén általi szabályzásáért [15]. A gén 5 UTR régiójának közvetlenül a transzlációs start kodont megelozo régiója igen gazdag G, illetve C bázisokban. Bár a pontos szerepe ezeknek a GC gazdag régióknak nem ismert, minden bizonnyal a transzláció finom szabályozásában van szerepük. Hasonló szerkezete van más növekedési faktorok a (bázikus fibroblaszt növekedési faktor = bfgf, illetve a transzformáló növekedési faktor béta = TGF?) 5 UTR régiójának is [16, 17]. A VEGF gén fehérjét kódoló régiója, mintegy 14 kb hosszúságú, 8 exont tartalmazó szakasz. A génrol átírt mrns alternatív splicingja során több különbözo VEGF izoforma keletkezik [18, 19]. A VEGF 3 UTR-ja AU gazdag. A gén 3 UTR-jén sikerült azonosítani egy 13 bázisnyi szakaszt (5 TTTTTTAATTTTA 3 ), mely képes egy RNS köto fehérje, a HuR megkötésére. A HuR megkötése a VEGF mrns-ének stabilizálásához vezet [20]. 13
1. ábra: A humán VEGF gén promoterének, kódoló szakaszának és részleges 3 UTR-jának, illetve FR-jának szerkezete (nemzeti biotechnikai információs központ (NCBI) AF095785, AF437895)........ -3100 aatgagcccttagggctcagagcctccatcctgccccaagatgtctacagcttgtgctcc....... -3040 tggggtgctagaggcgcacaaggaggaaagttagtggcttcccttccatatcccgttcat....... -2980 cagcctagagcatggagcccaggtgaggaggcctgcctgggagggggccctgagccagga....... -2920 aataaacatttactaactgtacaaagaccttgtccctgctgctggggagcctgccaagtg....... -2860 gtggagacaggactagtgcacgaatgatggaaagggagggttggggtgggtgggagccag....... -2800 cccttttcctcataagggccttaggacaccataccgatggaactgggggtactggggagg....... -2740 taacctagcacctccaccaaaccacagcaacatgtgctgaggatggggctgactaggtaa....... -2680 gctccctggagcgttttggttaaattgagggaaattgctgcattcccattctcagtccat..... c/a.. -2620 gcctccacagaggctatgccagctgtaggccagaccctggcaagatctgggtggataatc....... -2560 agactgactggcctcagagccccaactttgttccctggggcagcctggaaatagccaggt..t/c..... -2500 cagaaaccagccaggaatttttccaagctgcttcctatatgcaagaatgggatgggggcc....... -2440 tttgggagcacttagggaagatgtggagagttggaggaaaagggggcttggaggtaaggg....... -2380 aggggactgggggaaggataggggagaagctgtgagcctggagaagtagccaagggatcc....... -2320 tgagggaatgggggagctgagacgaaacccccatttctattcagaagatgagctatgagt....... -2260 ctgggcttgggctgatagaagccttggcccctggcctggtgggagctctgggcagctggc....... -2200 ctacagacgttccttagtgctggcgggtaggtttgaatcatcacgcaggccctggcctcc....... -2140 acccgcccccaccagccccctggcctcagttccctggcaacatctggggttgggggggca....... -2080 gcaggaacaagggcctctgtctgcccagctgcctccccctttgggttttgccagactcca....... -2020 cagtgcatacgtgggctccaacaggtcctcttccctcccagtcactgactaaccccggaa....... -1960 ccacacagcttcccgttctcagctccacaaacttggtgccaaattcttctcccctgggaa....... -1900 gcatccctggacacttcccaaaggaccccagtcactccagcctgttggctgccgctcact....... -1840 ttgatgtctgcaggccagatgagggctccagatggcacattgtcagagggacacactgtg....... -1780 gcccctgtgcccagccctgggctctctgtacatgaagcaactccagtcccaaatatgtag....... -1720 ctgtttgggaggtcagaaatagggggtccaggagcaaactccccccaccccctttccaaa 14
....... -1660 gcccattccctctttagccagagccggggtgtgcagacggcagtcactagggggcgctcg....... -1600 gccaccacagggaagctgggtgaatggagcgagcagcgtcttcgagagtgaggacgtgtg..... c/t.. -1540 tgtctgtgtgggtgagtgagtgtgtgcgtgtggggttgagggtgttggagcggggagaag... t/c.... -1480 gccaggggtcactccaggattccaacagatctgtgtgtccctctccccacccgtccctgt....... -1420 ccggctctccgccttcccctgcccccttcaatattcctagcaaagagggaacggctctca....... -1360 ggccctgtccgcacgtaacctcactttcctgctccctcctcgccaatgccccgcgggcgc....... -1300 gtgtctctggacagagtttccgggggcggatgggtaattttcaggctgtgaaccttggtg....... -1240 ggggtcgagcttccccttcattgcggcgggctgcgggccaggcttcactgggcgtccgca... g/a.... -1180 gagcccgggcccgagccgcgtgtggaggggctgaggctcgcctgtccccgccccccgggg....... -1120 cgggccgggggcggggtcccggcggggcggagccatgcgccccccccttttttttttaaa....... -1060 agtcggctggtagcggggaggatcgcggaggcttggggcagccgggtagctcggaggtcg....... -1000 TGGCGCTGGGGGCTAGCACCAGCGCTCTGTCGGGAGGCGCAGCGGTTAGGTGGACCGGTC....... -940 AGCGGACTCACCGGCCAGGGCGCTCGGTGCTGGAATTTGATATTCATTGATCCGGGTTTT....... -880 ATCCCTCTTCTTTTTTCTTAAACATTTTTTTTTAAAACTGTATTGTTTCTCGTTTTAATT....... -820 TATTTTTGCTTGCCATTCCCCACTTGAATCGGGCCGACGGCTTGGGGAGATTGCTCTACT....... -760 TCCCCAAATCACTGTGGATTTTGGAAACCAGCAGAAAGAGGAAAGAGGTAGCAAGAGCTC....... -700 CAGAGAGAAGTCGAGGAAGAGAGAGACGGGGTCAGAGAGAGCGCGCGGGCGTGCGAGCAG. g/c...... -640 CGAAAGCGACAGGGGCAAAGTGAGTGACCTGCTTTTGGGGGTGACCGCCGGAGCGCGGCG....... -580 TGAGCCCTCCCCCTTGGGATCCCGCAGCTGACCAGTCGCGCTGACGGACAGACAGACAGA....... -520 CACCGCCCCCAGCCCCAGCTACCACCTCCTCCCCGGCCGGCGGCGGACAGTGGACGCGGC....... -460 GGCGAGCCGCGGGCAGGGGCCGGAGCCCGCGCCCGGAGGCGGGGTGGAGGGGGTCGGGGC....... -400 TCGCGGCGTCGCACTGAAACTTTTCGTCCAACTTCTGGGCTGTTCTCGCTTCGGAGGAGC....... -340 CGTGGTCCGCGCGGGGGAAGCCGAGCCGAGCGGAGCCGCGAGAAGTGCTAGCTCGGGCCG....... -280 GGAGGAGCCGCAGCCGGAGGAGGGGGAGGAGGAAGAAGAGAAGGAAGAGGAGAGGGGGCC....... -220 GCAGTGGCGACTCGGCGCTCGGAAGCCGGGCTCATGGACGGGTGAGGCGGCGGTGTGCGC....... -160 AGACAGTGCTCCAGCCGCGCGCGCTCCCCAGGCCCTGGCCCGGGCCTCGGGCCGGGGAGG....... -100 AAGAGTAGCTCGCCGAGGCGCCGAGGAGAGCGGGCCGCCCACAGCCCGAGCCGGCAGAGG.... t/c. Met Asn Phe Leu Leu -40 GAGCGCGAGCCGCGCCGGCCCCGGTCGGGCCTCCGAAACC ATG AAC TTT CTG CTG 15
Exon 1 Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu Tyr Leu His His Ala Lys TCT TGG GTG CAT TGG AGC CTT GCC TTG CTG CTC TAC CTC CAC CAT GCC AAG Trp Ser Gln gtaagcggtcgtgccct...tctctttctgtcctcag TGG TCC CAG Exon 2 Ala Ala Pro Met ALa Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu V GCT GCA CCC ATG GCA GAA GGA GGA GGG CAG AAT CAT CAC GAA Ggtgagtcccc al Val Lys Phe Met Asp ctggctg...catcgcctctcatgcag TG GTG AAG TTC ATG GAT Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe GTC TAT CAG CGC AGC TAC TGC CAT CCA ATC GAG ACC CTG GTG GAC ATC TTC Exon 3 Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro CAG GAG TAC CCT GAT GAG ATC GAG TAC ATC TTC AAG CCA TCC TGT GTG CCC Leu Met Arg Cys GlY Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro CTG ATG CGA TGC GGG GGC TGC TGC AAT GAC GAG GGC CTG GAG TGT GTG CCC Glu Thr Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln ACT GAG GAG TCC AAC ATC ACC ATG CAG gtgggcatctttgggaa... Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln GLy Gln...gcttccttcctttccag ATT ATG CGG ATC AAA CCT CAC CAA GGC CAG Exon 4 His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Ar CAC ATA GGA GAG ATG AGC TTC CTA CAG CAC AAC AAA TGT GAA TGC AG gtgagg Exon 5 g Pro Lys Lys Asp atgtagtcacg...ctccctacccattgcag A CCA AAG AAA GAT Arg Ala Arg Gln Gln Ly/AS AGA GCA AGA CAA GAA AA gtaagtggccctgactt...gtttt Exon 6 S Lys Ser Val Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg tttattttccag A AAA TCA GTT CGA GGA AAG GGA AAG GGG CAA AAA CGA AAG CGC Lys Lys Ser Arg Tyr Lys Ser Trp Ser Va AAG AAA TCC CGG TAT AAG TCC TGG AGC GT gtacgttggtgcccgct... l Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg...cttttgcctttttgcag T CCC TGT GGG CCT TGC TCA GAG CGG AGA Exon 7 Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn AAG CAT TTG TTT GTA CAA GAT CCG CAG ACG TGT AAA TGT TCC TGC AAA AAC Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Ar ACA CAC TCG CGT TGC AAG GCG AGG CAG CTT GAG TTA AAC GAA CGT ACT TGC AG g Cys Asp gttggttcccagaggca... ttttccatttccctcag A TGT GAC Exon 8 Lys Pro Arg Arg *** AAG CCG AGG CGG TGA GCCGGGCAGGAGGAAGGAGCCTCCCTCAGGGTTTCGGGAACCAGATCTC TCACCAGGAAAGACTGATACAGAACGATCGATACAGAAACCACGCTGCCGCCACCACACCATCACCATC 16
GACAGAACAGTCCTTAATCCAGAAACCTGAAATGAAGGAAGAGGAGACTCTGCGCAGAGCACTTTGGGT t/c CCGGAGGGCGAGACTCCGGCGGAAGCATTCCCGGGCGGGTGACCCAGCACGGTCCCTCTTGGAATTGGA TTCGCCATTTTATTTTTCTTGCTGCTAAATCACCGAGCCCGGAAGATTAGAGAGTTTTATTTCTGGGAT TCCTGTAGACACACCCACCCACATACATACATTTATATATATATATATTATATATATATAAAAATAAAT ATCTCTATTTTATATATATAAAATATATATATTCTTTTTTTAAATTAACAGTGCTAATGTTATTGGTGT CTTCACTGGATGTATTTGACTGCTGTGGACTTGAGTTGGGAGGGGAATGTTCCCACTCAGACCTGACAG GGAAGAGGAGGAGATGAGAGACTCTGGCATGATCTTTTTTTTGTCCCACTTGGTGGGGCCAGGGTCCTC TCCCCTGCCCAGGAATGTGCAAGCCAGGGCATGGGGGCAAATATGACCCAGTTTTGGGAACACCGACAA AC CCAGCCCTGGCGCTGAGCCTCTCTACCCCAGGTCAGACGGACAGAAAGACAGATCACAGGTACAGG t/c GATGAGGACACCGGCTCTGACCAGGAGTTTGGGGAGCTTCAGGACATTGCTGTGCTTTGGGGATTCCCT CCACATGCTGCACGCGCATCTCGCCCCCAGGGGCACTGCCTGGAAGATTCAGGAGCCTGGGCGGCCTTC g/a GCTTACTCTCACCTGCTTCTGAGTTGCCCAGGAGGCCACTGGCAGATGTCCCGGCGAAGAGAAGAGACA t/c CATTGTTGGAAGAAGCAGCCCATGACAGCTCCCCTTCCTGGGACTCGCCCTCATCCTCTTCCTGCTCCC g/a CTTCCTGGGGTGCAGCCTAAAAGGACCTATGTCCTCACACCATTGAAACCACTAGTTCTGTCCCCCCAG t/c GAGACCTGGTTGTGTGTGTGTGAGTGGTTGACCTTCCTCCATCCCCTGGTCCTTCCCTTCCCTTCCCGA GGCACAGAGAGACAGGGCAGGATCCACGTGCCCATTGTGGAGGCAGAGAAAAGAGAAAGTGTTTTATAT ACGGTACTTATTTAATATCCCTTTTTAATTAGAAATTAAAACAGTTAATTTAATTAAAGAGTAGGGTTT TTTTTCAGTATTCTTGGTTAATATTTAATTTCAACTATTTATGAGATGTATCTTTTGCTCTCTCTTGCT CTCTTATTTGTACCGGTTTTTGTATATAAAATTCATGTTTCCAATCTCTCTCTCCCTGATCGGTGACAG g/a TCACTAGCTTATCTTGAACAGATATTTAATTTTGCTAACACTCAGCTCTGCCCTCCCCGATCCCCTGGCT CCCCAGCACACATTCCTTTGAAATAAGGTTTCAATATACATCTACATACTATATATATATTTGGCAACTT t/c GTATTTGTGTGTATATATATATATATATGTTTATGTATATATGTGATTCTGATAAAATAGACATTGCTAT TCTGTTTTTTATATGTAAAAACAAAACAAGAAAAAATAGAGAATTCTACATACTAAATCTCTCTCCTTTT TTAATTTTAATATTTGTTATCATTTATTTATTGGTGCTACTGTTTATCCGTAATAATTGTGGGGAAAAGA TATTAACATCACGTCTTTGTCTCTAGTGCAGTTTTTCGAGATATTCCGTAGTACATATTTATTTTTAAAC AACGACAAAGAAATACAGATATATCTTaaaaaaaaaaaagcattttgtattaaagaatttaattctgatc tcaaagctcctcttggtttctccttctccattgaatccttgctctagacttcctcccgccccctttccct cttcctctggggaacatggcatttgtcttgggtctgggaaaggtacgtctaatgtgtaggatatggggtg acccaccttgttgtgctgggggcaaagtccttccattttggctgagctggtcctgggggaacccatccat cctgtcttgatatagaaggtgggaagctctgggaatgggtggagggggagaaacagcttaggagccaagg 17
gcccttgcaattggtagtgctgccttcaggaattagatgatccaggcccctgtcccttagccagggaaag aactggccatgtctccaagcttgctgcccaggagacaggagagagctgtttttgtctgtgggggtcttgt tggctgcaacaggctgggagtgggagggggatgctgctggagggctgtgactccagggtgtaacttaatt ttacatagttttacaccctggagttccttgagcctctggaagatggacccataggtttggtcaccactga tgggactccctgccccagcttgccataagctcttctctcacgtcctgctcctgggtaaggtggcacctat ccaggtctttgacactgaagggcagtgcttccaaattcacttcctctagcctctcatttattcttgcaaa ccatagatatggcttgaataaatattgagccagtcattgtgctgctatgaataagacacaattccacccc tcaaggatctggtgaggatgggtgggtggggagacccaaaactataaatccatgagcagaaaaatacata aaatgtgctgggggcatctgatctagcttgggagtgggagttgtattgggggtggtggctggggggtggt g/a gtcttatgacattatctctaggctgccacttaaagtatggtttgaagacagggagaacggggcggcggag tgaaagggttgaggacatcccaggcagaagggatagtgtgagcaaggcatgaaggtggcacttgggcagg A gén teljes szakaszán számos polimorf hely található (aláhúzott betu felette jelölve a báziscsere). A gén transzkripciója a -1038. bázisnál (vastag nagybetu) indul. TATA box található a gén -2465 és -2461-es bázisai között (vastag kisbetu). A gén -2013-es és -2006-os, illetve a -2000 és -1994 és bázisai között találhatóak a hipoxia indukálható faktor-1 megkötéséért felelos génszakaszok (aláhúzott, vastag kisbetuk). GC boxok találhatók a gén -2138 és -2133, -1277 és -1272, -1133 és -1128, -1123 és -1118, - 1112 és -1107, -1096 és -1091, -518 és -513, valamint -66 és -61 bázisok között (bekeretezett szakaszok). AP-1 transzkripciós faktor kötohelyek vannak a gén -2930 és -2924, -2265 és -2258, -1975 és -1969, - 1528 és -1522, valamint -620 és -614 bázisai közti területén (bekeretezett, vastag kisbetu). AP-2 transzkripciós faktor kötohelyek vannak a gén -1875 és -1868, valamint -135 és -128 bázisai között (bekeretezett aláhúzott, vastag betu). A VEGF 5 UTR-jén található IRES A 293 és a 1, az IRES B pedig a 947 és 555 bázisai között helyezkednek el (csíkos vonal). Ösztrogén receptor kötohely van a gén -637 és -625 bázisai között (aláhúzott, vastag betu). A VEGF start kodonja elott egy extra start kodon található a -185 és -187 bázisok közti területen. (vastag dolt nagybetu). A hármas és négyes exonok által kódolt aminosavak (vastag betu) felelosek a VEGF receptoraihoz való kötodésért. A stop kodon a 8-as exon 3 végén található (csillagok). A 3 UTR, illetve a 3 FR génszakaszon számos AU gazdag terület helyezkedik el (bekeretezett dolt betu). Ezek közül egy 13 bázisnyi szakaszról (duplán aláhúzott) mutattak ki HuR köto képességet. 18
4.2. A VEGF szintézisének szabályozása 4.2.1. A hipoxia hatása a VEGF szintézisére A VEGF szintézisének legfontosabb szabályzó faktora a hipoxia. Az oxigéntenzió csökkenése a VEGF szintézisének gyors, reverzibilis fokozódásához vezet mind in vitro mind in vivo [5, 21]. A hipoxia számos ponton befolyásolja a VEGF transzkripcióját, illetve transzlációját. A hipoxia hatására fokozódik a HIF-1 szintézise [22]. A HIF-1 heterodimer molekula, amely HIF1? és HIF1? alegységekbol épül fel [23]. Hipoxia hatására a HIF-1 a sejtmagba transzlokálódik, kötodik a VEGF gén promoterén elhelyezkedo HRE-hez [24], ez a VEGF génjének fokozott transzkripciójához vezet [25]. A hipoxia számos kevésbé tisztázott mechanizmuson keresztül is képes fokozni a VEGF szintézisét. A hipoxia hatására aktiválódó transzkripciós faktorok, mint a nukleáris faktor-??? (NF?? ) [26], SP1 [27], AP1 [28], AP2 [29], valamint a felhalmozódó adenozin [30] is képes a VEGF szintézisét fokozni. Más vizsgálatok szerint a hipoxia során foszforilálódó avian szarkóma vírus onkogén (Src) szintén fokozza a VEGF expresszióját [31]. A transzkripció fokozásán túl, a hipoxia hatással van a VEGF mrns-ének stabilitására is [32]. A hipoxia a 3 UTR régió adenozin-uracil gazdag régióihoz kötodo fehérjéken (HuR) keresztül stabilizálja a VEGF mrns-ét [33]. Így a VEGF mrnsének a normoxiás körülmények közötti, 40 perces féléletideje akár 180 percre is megnohet [34]. A VEGF 5 UTR-jén található két IRES szekvencia is, amely elosegíti a VEGF mrns-ének riboszómához való kötodését és transzlációját [17]. A VEGF mrns-ének IRES dependens transzlációs mechanizmusa lehetové teszi a transzlációt még fokozottan hipoxiás körülmények között is, amikor más transzlációs mechanizmusok már gátoltak [14, 35]. 19
4.2.2. A VEGF bioszintézise és a citokinek kapcsolata Számos pro- és anti-inflammatorikus citokinrol, valamint növekedési faktorról bizonyították be, hogy fokozza a VEGF szintézisét. In vitro az interleukin-1? (IL-1???[36], az interleukin-6 (IL-6) [37, 38], az epidermális növekedési faktor (EGF) [39], bázikus fibroblaszt növekedési faktor (bfgf) [40], a transzformáló növekedési faktor? és? (TGF?, TGF???[41, 42]??az inzulinszeru növekedési faktor I (IGF-I) [43], valamint a trombocita növekedési faktor (PDGF) [44] fokozza a VEGF mrns expresszióját, illetve fehérje szintjét. 4.3. A VEGF izoformái A VEGF szoros rokonságot mutató növekedési faktorokat (VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D és placenta növekedési faktor (PIGF)) magába foglaló fehérjecsalád tagja. A VEGF génje 8 exont tartalmaz. A VEGF mrns-ének alternatív splicingja során 5 különbözo izoforma (VEGF 121, VEGF 145, VEGF 165, VEGF 189, VEGF 206 ) keletkezik. Az különbözo izoformák a 6a a 6b, illetve a 7-es exon meglétében, illetve hiányában különböznek egymástól (2. ábra) [12]. A különféle sejtek, illetve szövetek eltéro mértékben expresszálják a különbözo VEGF izoformákat. A VEGF 121-es izoformája a lépben, a vesében és a tüdoben, a 145-ös izoformája a méhlepényben, a 165-ös az agyban és a vesében, a 189-as a szívben és a tüdoben, míg a 206-os izoforma elsosorban a méhlepényben fordul elo [45, 46, 47]. A VEGF 121-es izoformája enyhén savas karakteru, a sejtekbol szabadon szecernálódik [48]. A VEGF 145-ös izoformája 6-os exon által kódolt 24 aminosav jelenléte miatt enyhén bázikus karakteru [18]. VEGF 165-ös izoforma a VEGF145-höz hasonlóan enyhén bázikus karakteru a 7-es exon által kódolt bázikus aminosavak jelenléte miatt [49]. Szekrécióját követoen 30-40%-ban sejt, illetve extracelluláris mátrix (ECM) kötött marad. Ezért a VEGF 165-ös izoforma heparin szulfát proteoglikánokkal (HSPG) való interakciója teheto felelossé [48]. A VEGF 189-es, illetve a 206-os izoformái mind a 6-os mind a 7-es exon által kódolt bázikus aminosavakat tartalmazzák, ezek a legbázikusabb karakteruek. Ezek az izoformák szinte 20
teljes mértékben ECM asszociáltan fordulnak elo [48, 50]. Az ECM-hez kötött VEGF izoformák raktárt képeznek, melybol heparin, heparán szulfát, heparináz, plazmin vagy plazminogén aktivátor hatására felszabadulhatnak [48]. A különbözo VEGF izoformák diszulfidhidakkal stabilizált homodimerek formájában aktívak. A VEGF heterodimerek biológiailag inaktívak [51]. 2. ábra: A humán VEGF izoformáinak szerkezete. E1-E5 E8 VEGF 121 E1-E5 E6a E8 VEGF 145 E1-E5 E7 E8 VEGF 165 E1-E5 E6a E7 E8 VEGF 189 E1-E5 E6a E6b E7 E8 VEGF 206 115 24 17 44 6 Aminosav (db) A humán VEGF különbözo izoformái a VEGF gén nyolc különbözo exonjának (E1-8) alternatív splicingja során jönnek létre. 4.4. A VEGF receptorai A VEGF-nek két tirozinkináz receptora, a VEGF receptor 1 (VEGFR1, Flt-1) [52] és a VEGF receptor 2 (VEGFR2, KDR/Flk-1) ismert (3. ábra) [53]. Mindkét tirozinkináz receptor elsosorban az endotélsejtek felszínén expresszálódik, de számos más sejten (VEGFR1: trofoblaszt [54], mezangiális sejtek [55], monociták [56]; VEGFR2: hematopoetikus [57] és a retina progenitor sejtek [58] is kimutattak már muködo VEGF receptorokat. A VEGFR1 (180 kd) és a VEGFR2 (230 kd) tirozinkináz receptorok aminosav homológiája eléri a 44%-ot [59]. 21
3. ábra: A VEGF receptorainak sematikus ábrája. Hét extracelluláris immunglobulinszeru domén (1-7) felelos a VEGF megkötéséért és a receptorok dimeralizációjáért. Mindkét receptor rendelkezik egy transzmembrán (TM) és két intracelluláris tirozinkináz (TK) doménnel. Ortega N. és mtsai.: Front Biosci. 4:D141-D520, 1999. A VEGF tirozinkináz receptorai 7 extracelluláris immunglobulinszeru doménbol, egy transzmembrán régióból és egy intracelluláris a katalitikus egységet tartalmazó tirozinkináz doménbol állnak [60]. A VEGFR1 VEGF iránti affinitása 16-114 pm, míg a VEGFR2-jé 400-1000 pm [60]. A VEGFR1, illetve a VEGFR2 elso három extracelluláris, immunglobulinszeru doménje felelos a VEGF megkötéséért [61, 62]. A VEGF molekulák biológiai hatásukat homodimerek formájában fejtik ki. A dimeralizáció során a VEGF monomerek egymással ellentétes orientációjú egységeit diszulfidhidak kötik össze. A VEGF VEGF 1-es receptorához való kötodéséhez a 63. aszparaginsav, a 64. és a 67. glutaminsav, míg a VEGFR 2-es receprothoz való kötodéséhez a 82. arginin a 84. lizin és a 86. hisztidin jelenléte nélkülözhetetlen [63]. A receptorokhoz való kötodéséhez elengedhetetlen aminosavak, a VEGF monomerek ellentétes oldalán helyezkednek el [63] (4. ábra). 22
4. ábra: A VEGF homodimerek háromdimenziós modellje. A VEGF monomerek (zöld) egymással ellentétes orientációjú egységeit diszulfidhidak (sárga) kötik össze egymással. A VEGF VEGFR1-hez (piros), illetve VEGFR2 -höz (kék) való kötodésért felelos aminósavak a monomerek ellentétes végén helyezkednek el. Keyt BA. és mtsai.: J Biol Chem. 271: 5638-5646, 1996. Így a VEGF monomerek dimeralizációja lehetové teszi, hogy egyszerre két receptorhoz is kötodve receptor homo [61], illetve heterodimerek [62] jöjjenek létre. A VEGF receptorok dimeralizációját segítik elo a negyedik, az ötödik, a hatodik és a hetedik extracelluláris, immunglobulinszeru domének is [64, 65]. A receptor dimerek 100-szor nagyobb affinitással kötik meg a VEGF-et, mint a monomerek [66]. A VEGFR1 génjérol a teljes receptor mrns-énél rövidebb mrns is expresszálódhat [67]. Ez az mrns egy, a komplett VEGFR1-nél rövidebb, szolubilis receptort (sflt-1) kódol. Az sflt-1 tartalmazza VEGFR1 elso hat immunglobulinszeru doménjét, hiányzik viszont a VEGFR1 hetedik immunglobulinszeru, a transzmembrán és az intracelluláris tirozinkináz doménje is. Az sflt-1 tartalmaz egy további 31 aminosav hosszú karboxi terminális véget, amit érdekes módon a VEGFR1 génjének egy intronikus szakasza kódol [67]. Az sflt-1 nagy affinintással (K d? 10-20 pm) köti a VEGF-et, de a hiányzó tirozinkináz doménje miatt a VEGF biológiai hatásait nem közvetíti [68]. Emiatt ezt a receptorformát a VEGF természetes antagonistájának tartják [67]. 23
A VEGF rendelkezik egy nem tirozinkináz transzmembrán receptorral, a neutropilin-1-el (NP-1) is (5. ábra). Az NP-1 egy 140 kd nagyságú rövid intracitoplazmatikus résszel rendelkezo receptor. Az endotélsejteken kívül számos egyéb sejten is kimutatták a jelenlétét [69]. Az NP-1 képes specifikusan megkötni a VEGF 165-ös izoformáját. Ezt a kötést VEGF génjének 7-es exonja által kódolt fehérjék teszik lehetové [70]. Jelenleg az NP-1-et a VEGFR2 ko-receptorának tartják. Az NP-1 a VEGFR2 VEGF iránti affinitását, mintegy négyszeresére növeli [71]. 5. ábra: A neutropilin-1 sematikus szerkezete. a1 a2 b1 b2 c A neutopilin 5 extacelluláris (komplement C1r homológ-a1; komplement C1s homológ-a2; VIII-as véralvadási faktor homológ-b1; V-ös véralvadási faktor homológ-b2; MAM (meprin-a5 antigen-proteintirozin foszfatáz?) homológ-c), egy transzmembrán és egy intracelluláris doménnel rendelkezik. Ortega N. és mtsai.: Front Biosci. 4: D141-D520, 1999. Az elozoekben felsorolt receptorokon kívül a HSPG-ok egy további kis affinitású kötohelyet jelentenek a VEGF számára. A VEGF extracelluláris mátrix-asszociált HSPG -okhoz való bekötodése más növekedési faktorok (bfgf) HSPG kötésboli felszabadulásához vezethet [72]. Feltételezik, hogy a HSPG-ok egyúttal a VEGF extracelluláris raktárai is [50]. A HSPG-ok további feltételezett szerepe a VEGF receptoraihoz való kötodésének modifikálása. Kis koncentrációban a heparin elosegíti a VEGF humán melanoma sejtekhez való kötodését, míg nagy koncentrációban gátolja azt [73]. A glipikán-1 - glikozil-foszfatidilinozitolhoz kötött HSPG - elosegíti a VEGF heparináz kezelt sejtekhez való kötodését [74]. 24
4.5. A VEGF receptorainak (VEGFR1, VEGFR2) szignalizációja A VEGF receptorait a VEGF különbözo izoformáin kívül számos, a VEGF családba tartozó faktor is (VEGFR1: placenta növekedési faktor 1 és 2 (PIGF-1 és 2), VEGF-B; VEGFR2: VEGF-C és D) aktiválja [60]. Ugyan a VEGFR1 VEGF iránti affinitása jóval nagyobb, mint a VEGFR2-jé [60], tirozinkináz aktivitása viszont csak a tizede a VEGFR2-jének [75]. A VEGFR1 intracelluláris tirozinkináz doménjén több autofoszforilációs helyet azonosítottak (Tyr 794, 1169, 1213, 1242, 1327, 1333) [76, 77]. Ennek ellenére azonban a receptor muködéséhez nincs feltétlen szükség a receptor foszforilációjára. A VEGFR1 tirozinkináz doménjének deléciója ugyanis nem befolyásolja a VEGF angiogenezist serkento potenciálját [78]. A receptor 794-es és a 1169-os tirozin autofoszforilációja úgy tunik fontos szerepet tölt be a VEGFR1 foszfolipáz C??(PLC?????protein kináz C (PKC) szignáltranszdukciós kaszkád aktiválásában [76] (6. ábra). A VEGFR1 aktiválása számos, az avián szarkóma vírus onkogén (Src) családhoz tartozó molekula (Fyn tirozinkináz protoonkogén (Fyn), Yamaguchi szarkóma vírus onkogén homológ (Yes)) foszforilációjához vezet, ennek jelentosége azonban nem ismert [79] (6. ábra). A VEGFR2 intracelluláris tirozinkináz doménjén is több autofoszforilációs helyet azonosítottak (Tyr 801, 951, 996, 1054, 1059, 1175) [80, 81]. A foszforilált VEGFR2 aktiválja a PLC?? PKC rendszert. Ebben kiemelt jelentosége van a 801-es és a 1175-ös tirozin foszforilációjának. Az aktivált PLC??aktiválja a PKC -t (elsosorban a PKC??t). Ezt követoen azonban, más tirozinkináz receptoroktól szokatlan módon, a PKC?? közvetlenül aktiválja a Raf-1-et, majd az tovább aktiválja a mitogén-aktivált protein kináz kináz (MEK) aktiválásán keresztül a mitogen-aktivált protein kináz (MAPK) rendszert [82] (6. ábra). Más vizsgálatok szerint a VEGFR2 foszforilációjakor a MAPK az Sch növekedési faktor receptor köto fehérje 2 (Grb2) - guanin nukleotid kicserélo faktor (Sos) - Ras-GTP-áz aktivitású fehérje 1 ( Ras) - v-raf-1 rágcsáló leukémia vírus onkogén homológ (Raf) - MEK rendszeren keresztüli aktivációja is tetten érheto [83] (6. ábra). 25
A VEGFR2 foszforilációjakor beszámoltak még az Nck mediátor fehérje (Nck), a fehérje-tirozin foszfatáz 1 és 2 (SHP-1 és SHP-2) aktiválódásáról is, ezek jelentosége jelenleg kevéssé ismert [84]. A VEGFR2 foszforilációja aktiválja a foszfatidilinozitol 3 -kinase (PI3K) - antiapoptikus kinázt (Akt) rendszert is [85] (6. ábra). Mindkét receptor foszforilációja aktiválja a fokális adhéziós kinázt (FAK) [86]. A VEGFR2 esetén a FAK foszforilációja a Grb2 és az Shc fehérjéken keresztül valósul meg [80] (6. ábra). 6. ábra: A VEGFR1 és a VEGFR2 fobb szignáltranszdukciós útvonalai. VEGFR1 VEGF köto hely VEGFR2 Adhézió A VEGFR1, illetve VEGFR2 szignáltranszdukciós útvonalai. Rövidítések: fokális adhéziós kinázt (FAK), Nck mediátor fehérje (Nck), diacilglicerol (DAG), Fyn tirozinkináz protoonkogén (Fyn), GTPáz aktíváló fehérje (GAP), növekedési faktor receptor köto fehérje 2 (Grb2), inozitol 1,4,5,-trifoszfát (IP3), mitogénaktivált protein kináz (MAPK), mitogén-aktivált protein kináz kináz (MEK), foszfatidilinozitolbiszfoszfát (PIP2), fehérje kináz C (PKC), foszfolipáz C (PLC), v-raf-1 rágcsáló leukémia vírus onkogén homológ (Raf-1), Ras-GTP-áz aktivitásúfehérje 1 (Ras), schwannomin (Sch), fehérje-tirozin foszfatáz (SHP), guanin nukleotid kicserélo faktor (Sos), Yamaguchi sarcoma vírus onkogén homológ (Yes). Ortega N. és mtsai.: Front Biosci. 4: D141-D520, 1999. 26
4.6. A VEGF biológiai hatásai 4.6.1. VEGF, VEGFR1 és VEGFR2 knock-out egerek Egerekben a VEGF gén inaktiválása, még a heterozigótákban (VEGF +/-) is korai, a 11-12. embrionális napon bekövetkezo elhulláshoz vezet [87]. A VEGF heterozigóta knock-out embriók fejlodése retardált, számos fejlodési rendellenességet mutatnak. Jelentos a szív, a nagy erek fejletlensége és a különbözo szervek érellátásának hiánya. A erek és az érrendszer fejletlensége mellett szembetuno az egerek idegrendszeri fejletlensége. Homozigóta VEGFR1 knock-out egerek már az embrionális fejlodés 8-9. napján elpusztulnak. Ezekben az állatokban az endotélsejtek kialakulása ugyan zavartalan, de a sejtek nem formálnak er eket [88]. A VEGFR2 knock-out egerek szintén korán, a 8-9. embrionális napon elpusztulnak. Ezekben az állatokban az érképzési zavar mellett a hematopoetikus ossejtek zavart fejodése is kimutatható [89]. 4.6.2. A VEGF hatása az erek permeabilitására A VEGF-et eloször, mint az erek permeabilitást fokozó faktort írták le [90]. Ezt a hatását különbözo mechanizmus ok révén fejti ki. A fokozott érpermeabilitás közvetítésében jelentos a VEGFR2 szerepe. A VEGFR2-höz kötodni nem képes VEGF mutáns hatására ugyanis nem fokozódik az erek permeabilitása [91]. A NO, illetve a PGI 2 szerepét a VEGF érpermeabilitást fokozó hatásának közvetítésében számos in vivo kísérlet igazolja. A ciklooxigenáz gátló indometacin, illetve az endoteliális nitrogén-monoxid szintáz (enos) gátló N(G)-nitro-l-arginin metil észter (L-NAME) hatására jelentosen csökken a VEGF indukálta érpermeabilitás [6]. A PLC? és a PKC foszforilációját, illetve az intracelluláris Ca 2+ mobilizációját a vénák VEGF indukálta permeabilitás fokozódásban tartják fontosnak [92]. A fenesztrált endotélsejtek elofordulása az élo szervezetben bizonyos szövetekre korlátozott (vese glomerulus, gyomor-bélrendszer, endokrin szer vek, az agy bizonyos 27
területei). In vitro a VEGF hatására az erek endotéljének fenesztrációját figyelték meg a mellékvesekéreg [93] és az agyi hajszálerek endotélsejtein [94] is. A VEGF fokozza a nemrégiben felfedezett veziko-vakuoláris sejtorganellumok (VVO) jelenlétét is. A VVO több, mint 100 szolofürtszeruen összekapcsolódó vezikula által alkotott sejtorganellum (7. ábra), amely kapcsolatot létesít az endotélsejtek érlumen felöli és az azzal ellentétes, abluminális oldala között, biztosítva ezzel a plazmafehérjék transzportját [95]. 7. ábra: Az endotélsejteket áthidaló VVO-k elektromikroszkópos képének háromdimenziós rekonstrukciója. Az endotélsejtek 12-14 nm-es metszeteinek elektronmikroszkópos képének háromdimenziós rekonstrukcióján jól látszik a VVO-k (zöld) az egész sejtet áthidaló szerkezete. Lefelé az érlumen feloli sejtfelszín, felfelé pedig az abluminális sejtfelszín (piros) látható. Dvorak AM. és mtsai.: J Histochem Cytochem. 49: 419-432, 2001. 4.6.3. A VEGF sejtproliferációs hatásai A VEGF sejtproliferációs hatását számos, mindkét VEGF receptoron keresztül mediált szignáltranszdukciós út biztosítja. A VEGF hatására aktiválódó mitogenaktivált protein kinázok (MAPK1 és MAPK2) a c-jun N-terminális protein kináz (JNK) 28
aktiválásán keresztül fokozzák az endotélsejtek mitózisát. A VEGF hatást az MAPK gátló PD98059, illetve a JNK egy funkció nélküli negatív mutánssal való helyettesítése teljesen felfüggeszti [96]. A VEGF a PLC? - PKC szignáltranszdukciós útvonalon keresztül is befolyásolja a sejtek osztódását. A PLC??aktiválódása a diacilglicerol (DAG), illetve az inozitol 1,4,5,-trifoszfát (IP3) képzodésén keresztül vezet a PKC? és a PKC? aktiválódásához, valamint az intracelluláris Ca 2+ mobilizációjához. A PKC inhibitort felhasználó, valamint az izoformaspecifikus antiszensz kísérletek igazolják a PKC? és a PKC? központi szerepét a VEGF mitogén hatásának közvetítésében [97]. A VEGF mitogén hatásának közvetítésében fontos szer epe van a NO által közvetített PKC? gátlásnak is [98]. A PKC? fokozott aktivitása gátolja az endotélsejtek proliferációját [99]. 4.6.4. VEGF hatása a sejtmigrációra A bazálmembrán degradációja fontos, eleme az endotélsejtek migrációjának és egyúttal az angiogenezisnek is [100]. A VEGF számos ponton befolyásolja az endotélsejtek migrációját. Kimutatták, hogy a VEGF fokozza a kötoszöveti elemek lebontásáért felelos metalloproteáz (MMP), a gelatináz A szintézisét [101]. A VEGF fokozza a FAK tirozin foszforilációját [85, 86]. Az aktív FAK központi szerepet játszik a sejtek adhéziójában, az aktin filamantek szervezodésében és ezen keresztül a sejtmigráció folyamatában [102]. A FAK aktiválását jelentosen befolyásolja a Hsp90 jelenléte is. Hsp90 geldanamicinnel történo gátlása meggátolja a sejtek VEGF indukálta migrációját is [103]. Egyre több az adat, melyek szerint a NO fontos szerepet játszik az endotélsejtek VEGF indukálta migrációjában [104, 105]. Az enos 1177-es szerinjének Akt dependens foszforilációja elengedhetetlen a VEGF indukálta sejtmigráció folyamatában [106]. Másrészt a NO elosegíti a FAK foszforilációját [105]. 29
4.6.5. VEGF angiogenezist befolyásoló hatásai Az angiogenezis során a már meglévo erekbol képzodnek újabbak. A különbözo hatásokra (hipoxia, citokinek, mechanikai stressz, stb.) aktiválódó endotélsejtek MMP-okat termelnek. A MMP-k feloldják az erek körüli extracelluláris mátrixot, teret engedve az endotélsejtek osztódására, vándorlására. Az angiogenezisben számos VEGF által szabályozott folyamat (érpermeabilitás fokozódása, endotélsejt proliferáció és migráció) vesz részt. A VEGF angiogenezist szabályozó hatásainak fontos szerepet tulajdonítanak mind, az embrionális fejlodésben mind, pedig a posztnatális életben (sebgyógyulás, menstruációs ciklus, iszkémiás betegségek, tumorok) [107]. Egerekben a VEGF gén egyetlen alléljának inaktiválása is kóros érfejlodéshez és az embrionális élet 11-12. napján halálhoz vezet [87]. A VEGF 165-ös és 189-es izoformájának hiánya szintén az egerek korai elhullásához vezet [108]. Az egerekben kóros érfejlodés, szívmegnagyobbodás és csökkent szívizomkontraktilitás alakul ki. Régóta ismert, hogy a tumorok méretének növekedésével párhuzamosan no a tumorok érdenzitása is [109]. Ezzel összhangban fokozott VEGF szintézist mutattak ki számos humán tumorban. A VEGF hatásainak gátlása számos tumor növekedését csökkenti. Klinikai vizsgálatok tanúsítják, hogy konzervatív antitumor terápiát humán rekombináns anti-vegf neutralizáló antitesttel kiegészítve mind a nem kissejtes tüdodaganatos [110] mind, pedig a kolorektális daganatos betegek túlélése javul [111]. 4.6.6. A VEGF antiapoptotikus hatása A VEGF-nek a sejtek túlélését elosegíto hatását elsoként a retina endotélsejtjein igazolták [10]. Ezt követoen a VEGF hasonló, a sejtek túlélését elosegíto hatását más sejteken, így a humán vénás köldökzsinór endotélsejteken (HUVECs) [112] és vese tubuláris epitélsejtjein is igazolták [11]. 30